楊朝帆，董誠明，邢冰，夏偉，田亞杰

(河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046)

菊花為菊科菊屬多年生草本植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥頭狀花序，有散風(fēng)清熱、平肝明目、清熱解毒的功能，臨床上用于治療風(fēng)熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、眼目昏花、瘡癰腫毒[1]。菊花作為藥食兩用植物，在我國已有3000多年的栽培歷史[2]，因其產(chǎn)地變遷、加工方法的改進(jìn)等，逐漸形成了不同的商品和規(guī)格，有杭白菊、毫菊(小毫菊)、大馬牙(大毫菊)、貢菊、滁菊、懷菊等[3]，其中以杭菊、亳菊、滁菊、懷菊最為有名，有“四大名菊”之稱[4]。目前，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對(duì)菊花的產(chǎn)地變遷、栽培、遺傳育種、類型之間的質(zhì)量比較、藥理作用等方面進(jìn)行了大量研究，其活性成分主要有黃酮、綠原酸、揮發(fā)油等類成分，影響其質(zhì)量的因素涉及品種、栽培條件、采收時(shí)間、產(chǎn)后加工、炮制和貯存等[5-7]。2015年版《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)一部中，菊花藥材按產(chǎn)地及加工方法不同，分為“亳菊”“杭菊”“滁菊”“懷菊”“貢菊”。《中國藥典》以綠原酸、木犀草苷及3，5-O-二咖啡?；鼘幩釣闄z測指標(biāo)進(jìn)行含量測定。本文通過對(duì)市場上流通的不同規(guī)格的杭菊、亳菊、滁菊、懷菊進(jìn)行綠原酸、木犀草苷、槲皮素、3，5-O-二咖啡?；鼘幩嵋约翱傸S酮含量的檢測，并對(duì)主要化學(xué)成分進(jìn)行比較分析，以期探討菊花內(nèi)在化學(xué)成分之間的關(guān)聯(lián)性，從而進(jìn)一步為菊花質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

樣品為市場流通的藥用菊花，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠明教授鑒定為菊花ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥頭狀花序，具體樣品信息見表1。

表1 收集的菊花樣品信息表

1.2 儀器與試劑

UV-3200S型紫外可見分光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司)；Waters 2596 型高效液相色譜儀。

對(duì)照品綠原酸(純度≥98%，批號(hào)：110753-200413)、槲皮素(純度≥ 98%，批號(hào)：100081-200907)、木犀草苷(純度≥98%，批號(hào)：720-200905)和蘆丁(純度≥98%，批號(hào)：100080-9303)均購于中國食品藥品檢定研究院；3，5-O-二咖啡?；鼘幩釋?duì)照品(純度≥ 98%，CAS號(hào)碼：2450-53-5)購于四川維克奇生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 水分測定

參照《中國藥典》2015版通則0832第二法進(jìn)行測定[1]。

2.2 總黃酮含量的測定

參考劉利軍等[8]的實(shí)驗(yàn)方法測定總黃酮含量。

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱定蘆丁對(duì)照品5.1 mg，置25 mL錐形瓶中，加70%甲醇制成每1 mL含蘆丁0.204 mg的溶液，即得。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取204 μg·mL-1的蘆丁對(duì)照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分別置于10 mL帶刻度試管中，各加入5%的亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻，放置6 min，加入10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，放置6 min，4%的氫氧化鈉2 mL，加70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置10 min，在510 nm波長處測定吸光度，以蘆丁含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)做線性回歸，回歸方程為Y=12.436X-0.001 6，r=0.999 8，表明蘆丁在0～0.816 mg吸光度與蘆丁含量呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取1 g過五號(hào)篩的菊花粉末，于具塞磨口錐形瓶中，加入70%乙醇30 mL，60 ℃水浴0.5 h，取出抽濾，洗滌，置100 mL的容量瓶，70%乙醇定容至刻度，精密量取3 mL于10 mL容量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，靜置備用。

2.2.4 含量測定 精密量取供試品溶液2 mL于10 mL帶刻度的試管中，以不加供試品為空白對(duì)照，照2.2.2進(jìn)行測定。

2.3 綠原酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩帷⒛鞠蒈?、槲皮素的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Xaqua C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脫，程序見表2；檢測波長：348 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。對(duì)照品及供試品溶液色譜圖見圖1。

表2 菊花中4種化合物檢測的流動(dòng)相梯度洗脫程序表

注：A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；1.綠原酸；2.木犀草苷；3.3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸；4.槲皮素。圖1 混合對(duì)照品及菊花樣品HPLC圖

2.3.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸4.62 mg、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸3.06 mg、木犀草苷1.46 mg、槲皮素3.46 mg，于10 mL量瓶中，用70%甲醇水溶解并稀釋至刻度，搖勻，4 ℃密封避光保存，備用。

2.3.3 供試品溶液制備 精密稱取菊花粗粉0.5 mg，置具塞錐形瓶中。精密加入70%甲醇水50 mL，稱量。超聲處理40 min，補(bǔ)足失重。搖勻，取續(xù)濾液，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過，備用。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密量取混合對(duì)照品溶液2.5、5、7.5、10、12.5、15 μL，按2.3.1色譜條件測定，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相應(yīng)回歸方程，見表3。

表3 綠原酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、木犀草苷、槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

2.3.5 樣品含量測定 吸取各菊花供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測定[9]，即得。

3 結(jié)果與分析

3.1 含量測定結(jié)果

由表4含量測定結(jié)果可以看出，不同產(chǎn)地菊花樣品在總黃酮、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸、槲皮素含量上存在顯著差異。菊花樣品中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.67%～12.41%，其中以樣品5和樣品1較高，即江蘇射陽產(chǎn)杭菊和安徽滁州產(chǎn)滁菊含量較高，分別為12.41%、10.49%，樣品4即安徽亳州產(chǎn)杭菊的總黃酮含量較低，為6.67%；綠原酸含量以樣品5即江蘇射陽產(chǎn)杭菊綠原酸含量較高，為1.10%；樣品6即浙江桐鄉(xiāng)杭菊綠原酸含量較低，為0.52%；木犀草苷含量以樣品6即浙江桐鄉(xiāng)產(chǎn)杭菊含量較高，為0.54%；樣品4即安徽亳州產(chǎn)杭菊的木犀草甘含量較低，為0.15%；3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷恳詷悠?即安徽滁州滁菊含量較高，為3.83%；而樣品4和6即安徽亳州產(chǎn)杭菊和浙江桐鄉(xiāng)產(chǎn)杭菊較低，分別為1.37%、1.38%；槲皮素含量以樣品8即河南武陟產(chǎn)白懷菊較高，為0.22%；而樣品6和7即浙江桐鄉(xiāng)產(chǎn)胎菊和杭菊較低，為0.03%、0.02%。

表4 不同產(chǎn)地菊花中總黃酮及4種化學(xué)成分的含量測定結(jié)果 %

注：同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同列數(shù)據(jù)相同小寫字母表示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.2 相關(guān)性分析

利用SPSS 19.0軟件，選擇Pearson相關(guān)系數(shù)對(duì)各化學(xué)成分進(jìn)行雙側(cè)t檢驗(yàn)相關(guān)性分析，結(jié)果見表5。

表5 總黃酮、綠原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸、木犀草苷、槲皮素含量的相關(guān)性分析表

注：*P<0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

由表5可以看出，菊花樣品中綠原酸含量與總黃酮含量呈顯著正相關(guān)，但與木犀草甘、槲皮素等黃酮類化學(xué)物質(zhì)含量沒有明顯的相關(guān)性，同時(shí)與同為酚酸類的3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷恳矝]有明顯相關(guān)性。而木犀草苷含量與其他成分含量均呈負(fù)相關(guān)，由于樣本量較小，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.3 變異系數(shù)權(quán)重法的綜合評(píng)價(jià)

在綜合評(píng)價(jià)中，權(quán)重系數(shù)是評(píng)價(jià)的關(guān)鍵，權(quán)重系數(shù)法可分為主觀的專家咨詢權(quán)數(shù)法，以及客觀的因子分析權(quán)數(shù)法、獨(dú)立性權(quán)數(shù)法和信息量權(quán)數(shù)法[10]。主觀定權(quán)需要對(duì)指標(biāo)進(jìn)行打分，具有較強(qiáng)的主觀影響，而本實(shí)驗(yàn)根據(jù)表征評(píng)價(jià)指標(biāo)特征值之間的差異性，選客觀的因子分析權(quán)數(shù)法，其變異系數(shù)越大，權(quán)重越大。選取指標(biāo)中的總黃酮、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩帷㈤纹に睾窟M(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。具體計(jì)算步驟如下：

(1)

根據(jù)公式(1)可得變異系數(shù)為：

式中：C1～C5分別代表總黃酮含量、綠原酸含量、木犀草苷含量、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷?、槲皮素含量。

根據(jù)變異系數(shù)(δi)，按公式(2)計(jì)算權(quán)重系數(shù)(Ai)，按公式(3)計(jì)算綜合得分(Wi)。

(2)

(3)

式中：Xi為第i項(xiàng)指標(biāo)的指標(biāo)值。

由最終得分可知，樣品綜合得分為M1>M5>M2>M3、M7> M8、M9>M6>M4，即滁菊(安徽滁州)>杭菊(胎菊，江蘇射陽)>亳菊(大亳菊)>亳菊(小亳菊)、杭菊(浙江桐鄉(xiāng))>懷菊(白，河南武陟)、懷菊(黃，河南武陟)>杭菊(胎菊，浙江桐鄉(xiāng))>江蘇杭菊(亳州引種)。安徽滁州的滁菊綜合評(píng)價(jià)得分較高，為2.18，較其他地區(qū)菊花質(zhì)量佳；而由亳州引種的江蘇杭菊綜合評(píng)價(jià)得分較低為1.16，較其他地區(qū)菊花質(zhì)量差。

4 討論

按《中國藥典》進(jìn)行含量測定時(shí)是按照樣品的干燥品進(jìn)行計(jì)算的；本文進(jìn)行水分測定，是為總黃酮、綠原酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、木犀草苷、槲皮素的含量計(jì)算時(shí)扣除水分，使所有樣品在同一水平下進(jìn)行含量比較，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為嚴(yán)謹(jǐn)。

本實(shí)驗(yàn)在對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)，先對(duì)菊花的各檢測指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，進(jìn)而采用變異系數(shù)加權(quán)法進(jìn)行綜合分析。權(quán)重系數(shù)往往決定了數(shù)據(jù)的最終綜合評(píng)分，權(quán)重系數(shù)一般分為主觀和客觀兩種，主觀是指專家咨詢權(quán)數(shù)法，客觀包括獨(dú)立性權(quán)數(shù)法、分析權(quán)數(shù)法和信息量權(quán)數(shù)法。本實(shí)驗(yàn)選定信息量權(quán)數(shù)法進(jìn)行權(quán)重系數(shù)的確定。采用加權(quán)平均法，將總黃酮、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸、槲皮素含量設(shè)為評(píng)價(jià)菊花的5個(gè)條件來評(píng)價(jià)菊花樣品的質(zhì)量，各樣品質(zhì)量排序?yàn)槌?安徽滁州)>杭菊(胎菊，江蘇射陽)>亳菊(大亳菊)>亳菊(小亳菊)、杭菊(浙江桐鄉(xiāng))>懷菊(白，河南武陟)、懷菊(黃，河南武陟)>杭菊(胎菊，浙江桐鄉(xiāng))>江蘇杭菊(亳州引種)。滁菊(安徽滁州)樣品得分最高，滁菊的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10.49%、綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.90%、木犀草苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.23%、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.83%、槲皮素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.16%，較其他樣品質(zhì)量佳。本文研究結(jié)果與滁菊為“四大藥菊”之首[11]的報(bào)道結(jié)果相一致。從菊花的總黃酮、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸、槲皮素含量測定結(jié)果看，不同產(chǎn)地、不同品種菊花的5種成分含量差異較大，可能與種植、采收、產(chǎn)地加工、環(huán)境、土壤、氣候等因素有關(guān)，有待進(jìn)一步考察研究。

在本實(shí)驗(yàn)質(zhì)量排序中，杭菊(胎菊，江蘇射陽)>杭菊(浙江桐鄉(xiāng))> 杭菊(胎菊，浙江桐鄉(xiāng))>江蘇杭菊(亳州引種)的結(jié)果也與索風(fēng)梅等[4]的“杭菊和亳菊對(duì)生態(tài)環(huán)境的要求相對(duì)較高”這一觀點(diǎn)相一致。藥材具有一定的道地性，同種異地種植的藥材，江蘇杭菊(亳州引種)與亳菊(亳州)、杭菊(浙江、杭州、江蘇)在質(zhì)量上有明顯差異，表明藥材要遵循其道地性原則及其產(chǎn)地適宜性原則[4]。

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