馬玉楠，陳傳嬌，馬曉惠，程永現(xiàn)，董鮮*，徐福榮*

(1.云南中醫(yī)學院，云南 昆明 650500；2.深圳大學 醫(yī)學部 藥學院，廣東 深圳 518060)

三七是我國傳統(tǒng)道地中藥材，為五加科人參屬多年生草本植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根及根莖[1]，具有散瘀止血、消腫定痛等功能。主要用于治療冠心病、心絞痛等心腦血管疾病，其用藥范圍甚廣，社會需求量日益增加，從而引起種植面積的急劇擴大。由于三七生長環(huán)境的特殊性，造成其連作障礙十分嚴重，制約著三七產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，是三七產(chǎn)業(yè)發(fā)展急需解決的問題[2]。據(jù)報道，連作障礙易導致三七根部的腐爛。Miao等[3]通過對三七的腐爛根際真菌微生物進行研究，表明毀壞柱孢菌Cylindrocarpondestructans(Zinssm.)Scholten、腐皮鐮刀菌Fusariumsolani(Mart.)Sacc和尖孢鐮刀菌F.oxysporumSchltdl是三七根腐病的主要病原真菌，其中分離頻率最高的為柱孢屬真菌[4-5]。鐮刀菌屬類病原菌能引發(fā)多數(shù)作物根腐病的發(fā)生，給作物生產(chǎn)帶來嚴重損失。

黃花蒿ArtemisiaannuaL.為菊科Asteraceae蒿屬Artemisia1年生草本植物，是我國傳統(tǒng)的中草藥，具有很高的藥用價值。黃花蒿的主要化學成分包括揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性成分，其中非揮發(fā)性成分的主要代表是青蒿素，揮發(fā)性成分主要包括芳香族、脂肪族及萜類化合物[6]。本課題組經(jīng)過長期的田間試驗，發(fā)現(xiàn)在三七土壤表面覆蓋黃花蒿能促進三七植株的生長，與無黃花蒿覆蓋的三七相比，葉綠素含量(SPAD)升高，株高和根系干重也有所增加，覆蓋黃花蒿的三七發(fā)病率(10%)顯著低于無黃花蒿覆蓋的三七發(fā)病率(33.13%)，黃花蒿對三七根腐病的防控效果高達76.60%[7]。本實驗用甲醇為溶劑對黃花蒿的葉進行超聲提取，測定其提取物對尖孢鐮刀菌的孢子萌發(fā)、孢子活力、菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響，試圖揭示黃花蒿抑制三七根腐病的發(fā)生機理，從而尋求防治三七根腐病的新途徑，為消減三七連作障礙及規(guī)?；N植提供理論依據(jù)。

1 材料

供試黃花蒿：黃花蒿種子由云南省農(nóng)業(yè)科學院提供，在云南省道地瀕危中藥材繁育與栽培工程技術研究中心內(nèi)種植。

供試菌株：菌株分離自發(fā)病三七植株根系，經(jīng)鑒定為尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum，對三七植株有強致病性。在PDA培養(yǎng)基上進行活化，接種3～4次后，取生長旺盛的菌株備用。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL。

2 方法

2.1 黃花蒿葉甲醇粗提物的制備

將黃花蒿葉片陰干，粉碎，過40目篩，稱取50 g用甲醇超聲提取(100 mL×2 h×3次)。過濾，冷凍干燥得粉末2.565 g，制備成質(zhì)量濃度分別為3.66、5.13、8.55、25.65 mg·mL-1的甲醇溶液，置于4 ℃冰箱備用，空白對照為甲醇溶液。

2.2 尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)率的測定

用瓊脂平板表面萌發(fā)法[8]。取培養(yǎng)7 d的尖孢鐮刀菌，加20 mL無菌水到培養(yǎng)皿中，用無菌載玻片將菌絲和孢子輕輕刮下，8層無菌紗布過濾除去菌絲和培養(yǎng)基，最后配制成濃度為5×103個·mL-1的孢子懸浮液。采用2%水瓊脂培養(yǎng)基，在無菌條件下，每個培養(yǎng)皿中加入15 mL的水瓊脂和1 mL無菌黃花蒿葉甲醇提取物，充分混勻。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，在每個培養(yǎng)皿中加入50 μL上述已制備好的孢子懸浮液，使用無菌涂布棒將孢子懸浮液順時針均勻涂布在培養(yǎng)基上。涂布完成后，將培養(yǎng)皿放置在微生物培養(yǎng)箱中，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)72 h，每個處理設5個重復，按公式(1)計算孢子的萌發(fā)率。

(1)

2.3 尖孢鐮刀菌孢子活力的測定

黃花蒿葉甲醇提取物對尖孢鐮刀菌的生長抑制作用參照牛津杯法[9]，孢子活力測定采用吖啶橙-碘化丙啶熒光染色法[10]。在無菌操作條件下，每個培養(yǎng)皿中倒入15 mL PDA培養(yǎng)基，待冷卻凝固后，取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的尖孢鐮刀菌，用直徑5 mm的打孔器沿菌落邊緣打取菌塊，接種于培養(yǎng)基中央，然后將4個無菌牛津杯距離真菌塊25 mm處等距離放置，每個牛津杯加入200 μL上述不同質(zhì)量濃度的黃花蒿葉甲醇提取物(事先用0.22 μm有機系濾頭過濾除菌)，于微生物培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)。每個處理設5個重復。生長1周后，刮下菌絲，用無菌水制成孢子懸浮液(1×106個·mL-1)。取50 μL的菌懸液，加入50 μL的無菌水和20 μL碘化丙啶(2%)和40 μL吖啶橙(0.1%)?；旌暇鶆蚝笤谑覝睾诎禇l件下放置5 min進行染色。染色完成后，10 000×g離心5 min。再用100 μL的無菌水沖洗菌懸液。將染色液完全洗凈后，取10 μL樣品，用熒光顯微鏡進行觀察。激發(fā)光波長為450～490 nm。計算活細胞的百分率。

2.4 尖孢鐮刀菌的生長曲線測定

參照牛津杯法[9]，測定黃花蒿葉甲醇粗提物對尖孢鐮刀菌菌絲生長的影響，具體實驗步驟按2.3的牛津杯方法。測量菌落直徑采用“十字交叉法”，每24 h測量1次，直至第8 d。用折線圖表示尖孢鐮刀菌的生長曲線。

2.5 尖孢鐮刀菌產(chǎn)孢量測定

按2.4方法，測定菌落直徑后，加入10 mL無菌水到培養(yǎng)皿中，用接種環(huán)將培養(yǎng)基中的菌絲和孢子輕輕刮下，再用布氏漏斗過濾，用10 mL的無菌水清洗漏斗，最后定容到30 mL，在雙目生物顯微鏡下用血球計數(shù)板對孢子的產(chǎn)量進行測定。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

3 結(jié)果與分析

3.1 尖孢鐮刀菌的孢子萌發(fā)率

圖1結(jié)果表明，黃花蒿葉甲醇提取物在一定程度上能抑制尖孢鐮刀菌的孢子萌發(fā)，隨著黃花蒿葉甲醇提取物濃度的增加，其對孢子萌發(fā)率的抑制作用顯著增強。與對照組相比，當質(zhì)量濃度為3.66、5.13 mg·mL-1時，孢子萌發(fā)率沒有明顯差異。當質(zhì)量濃度為8.55、25.65 mg·mL-1時，孢子萌發(fā)率分別是63.32%、58.42%，相比對照顯著降低。

3.2 尖孢鐮刀菌的孢子活力

用吖啶橙-碘化丙啶對孢子進行染色后在熒光顯微鏡下觀察尖孢鐮刀菌孢子狀態(tài)。吖啶橙能透過完整的細胞膜進入細胞，將活細胞染成綠色。碘化丙啶則可進入死細胞，與DNA結(jié)合，將細胞染成紅色。圖1和圖2的結(jié)果表明，當黃花蒿葉甲醇提取物質(zhì)量濃度為3.66 mg·mL-1時，尖孢鐮刀菌孢子活力為71.6%，與對照組相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。當質(zhì)量濃度增加到25.65 mg·mL-1時，與對照組相比，孢子的活力降低了12.5%。因此，尖孢鐮刀菌的孢子活力隨著黃花蒿葉甲醇粗提物質(zhì)量濃度的增加顯著降低。

3.3 尖孢鐮刀菌的菌絲生長曲線

圖3的結(jié)果表明，從第3天開始，各處理組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著培養(yǎng)時間的增加，黃花蒿葉甲醇提取物質(zhì)量濃度增大，其對尖孢鐮刀菌的菌落生長抑制作用逐漸增強。在第8天時，與對照組相比，菌落直徑差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。圖3為培養(yǎng)8 d的尖孢鐮刀菌生長曲線，隨著黃花蒿葉甲醇提取物濃度的增加，菌落的直徑顯著降低。圖4的結(jié)果顯示，第8天時，對照組的菌落直徑為78.0 mm，當黃花蒿葉甲醇粗提物質(zhì)量濃度增加到25.65 mg·mL-1時，菌落直徑最小為36.5 mm。上述結(jié)果表明，隨著黃花蒿葉甲醇粗提物質(zhì)量濃度的增加，對尖孢鐮刀菌的菌絲生長抑制作用顯著增強。

注：同系列不同字母表示差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；同系列相同字母表示差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。圖1 黃花蒿葉甲醇提物粗提物對孢子萌發(fā)率、孢子活力的影響

注：A.對照；B.3.66 mg·mL-1；C.5.13 mg·mL-1；D.8.55 mg·mL-1；E.25.65 mg·mL-1。圖2 不同質(zhì)量濃度黃花蒿葉甲醇粗提物對尖孢鐮刀菌孢子活力的抑制作用

圖3 不同質(zhì)量濃度黃花蒿葉甲醇粗提物對尖孢鐮刀菌菌落生長的影響

圖4 不同質(zhì)量濃度黃花蒿葉甲醇粗提物對尖孢鐮刀菌生長的抑制作用

3.4 尖孢鐮刀菌的產(chǎn)孢量

圖5結(jié)果表明，黃花蒿葉甲醇提取物對尖孢鐮刀菌的產(chǎn)孢量有顯著抑制作用，各處理組與對照相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著黃花蒿葉甲醇粗提物質(zhì)量濃度的增加，尖孢鐮刀菌的產(chǎn)孢量顯著降低。對照組的產(chǎn)孢量為1.91×107個·mL-1，而當黃花蒿葉甲醇粗提物質(zhì)量濃度增加到25.65 mg·mL-1時，尖孢鐮刀菌的產(chǎn)孢量最低，為1.79×106個·mL-1，與對照組相比降低了90.61%。

注：圖中不同字母表示差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；相同字母表示差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。圖5 黃花蒿葉甲醇粗提物對尖孢鐮刀菌孢子產(chǎn)量的影響

4 討論

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程，根腐病是一種毀滅性病害。三七根腐病有多種表現(xiàn)癥狀，包括莖基干枯型、干裂型、髓爛型、黃腐型、濕腐型和急性青枯型等，其中較常見的是黃腐型，在三七生長的不同年限里均可發(fā)生。三七的根腐病制約著三七的產(chǎn)量和質(zhì)量，阻礙了三七產(chǎn)業(yè)的持久發(fā)展。目前，對三七根腐病的防治主要是生物防治、化學防治和輪作。生物防治在一定程度上可以促進三七種子的出苗，但是對于三七根腐病的防治卻沒有達到理想的效果。輪作雖然可以緩解根腐病的發(fā)生，但因其年限較長，而不能夠大面積推廣?；瘜W防治雖然能夠在一定程度上緩解三七的根腐病，但不能夠完全控制，而且會降低藥材的質(zhì)量并對土壤有一定的污染。三七根腐病的病原菌具有多樣性，不但真菌可侵染，細菌和線蟲亦可侵染致病，其中以真菌為主。根據(jù)不同的病原菌引起的根腐病進行系統(tǒng)、全面的研究，才能有效揭示根腐病的發(fā)生和發(fā)展的相關過程，從而為三七根腐病的防治研究提供理論基礎[11]。

尖孢鐮刀菌在土壤中生存能力較強，是一種土壤習居菌，其產(chǎn)生的厚垣孢子可在土壤中存活10年之久。病原菌從植株的根系侵染植株，并產(chǎn)生分生孢子，以小型分生孢子的形態(tài)隨蒸騰流運輸?shù)街仓甑厣喜?，繼而定殖于根系和上部莖，導致植株地上部發(fā)病。在運輸過程中，尖孢鐮刀菌會產(chǎn)生對植株有害的次生代謝產(chǎn)物，即鐮刀菌酸，對植株的生長也有一定的破壞作用。本研究結(jié)果表明，黃花蒿葉的甲醇提取物對尖孢鐮刀菌的生長有顯著的抑制作用。不同濃度的黃花蒿葉甲醇提取物抑菌效果不同，并且抑菌效果隨質(zhì)量濃度的增大而加強。當黃花蒿葉甲醇粗提物的質(zhì)量濃度為25.65 mg·mL-1時，尖孢鐮刀菌的孢子萌發(fā)受到抑制，萌發(fā)率較對照組顯著降低(見圖1)；從而導致孢子活力的降低和孢子產(chǎn)量的減少(見圖1、圖5)；病原菌菌絲的生長受到抑制(見圖3、圖4)。

初步研究表明，植物中的活性成分對真菌的作用機制較復雜，目前此方面的研究主要是植物的粗提液對病原菌的直接抑制作用。主要表現(xiàn)形式為抑制附著孢子的形成、孢子的游動、菌絲體的生長及體外鈍化效果等。尖孢鐮刀菌侵染三七植株，主要通過病原菌產(chǎn)生的孢子、菌絲附著在三七的根部，進而導致三七的根部變黃腐爛，在本實驗中，制得黃花蒿葉甲醇提取物對尖孢鐮刀菌的孢子活力、孢子萌發(fā)及菌絲的生長都有一定的抑制作用，且隨著質(zhì)量濃度的增加抑制作用增強，進而可從源頭上抑制三七根腐病的發(fā)生。黃花蒿提取物的作用范圍廣泛，對不同的菌類都有一定的抑制作用。相關研究表明，黃花蒿不同溶劑得到的提取物，對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、單核增多性李氏桿菌、大腸桿菌等細菌均有不同程度的抑菌作用[12-13]。另有一些研究結(jié)果表明黃花蒿有機溶劑提取物對許多植物性病原菌如黑曲霉、黃曲霉、青霉、毛霉等真菌也具有顯著的抑制作用[14-17]。

本研究主要針對黃花蒿葉甲醇提取物對尖孢鐮刀菌生長的抑制作用進行分析，但對于具體成分未進行深入的研究，黃花蒿能否與三七間作從而解決三七連作問題也待進一步觀察。今后，可對黃花蒿葉甲醇提取物的成分進一步研究，找出其抑制土傳病害病原菌的主要活性成分，為綠色農(nóng)藥的生產(chǎn)及生物制藥開辟新的道路。黃花蒿在我國分布廣、產(chǎn)量大，若能以其為原料對黃花蒿資源進一步開發(fā)，尋求病蟲害防治的新途徑，將具有廣闊的前景和深遠的意義。

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