胡珊，楊志業(yè)，鄔龍怡，李華，計周正*

(1.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510663；2.廣東省藥品檢驗所，廣東 廣州 510180)

化橘紅為蕓香科植物化州柚Citrusgrandis‘Tomentosa’或柚Citrusgrandis(L.)Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外層果皮[1]，具有散寒、燥濕、消痰等功效，用于風寒咳嗽，喉癢痰多[2]?；偌t為廣東化州道地藥材，根據(jù)其果實表面絨毛的有無、多少分為大致正毛化橘紅、副毛化橘紅和光青化橘紅，品質和功效以正毛化橘紅最優(yōu)[3-5]、副毛化橘紅次之、光青化橘紅最差，假西洋品種是外觀介于正毛和副毛之間、功效介于副毛和光果的一個較特殊品種，而正毛化橘紅和非正毛化橘紅的種苗在外觀形態(tài)非常相似，運用傳統(tǒng)方法很難準確區(qū)分。以生物分子的多態(tài)性為基礎的遺傳標記，即DNA水平的分子標記如RAPD、ISSR分標記[6-7]等，相對于傳統(tǒng)形態(tài)標記具有巨大優(yōu)勢，為解決品種混亂和品種優(yōu)劣問題提供了一種新的手段。本文在ISSR分子標記的基礎上建立了一種利用PCR特征條帶組合來鑒別正毛化橘紅種苗的方法，該方法快速、簡便且準確性高，只需要少量樣本即可實現(xiàn)正毛化橘紅種苗的鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料來源

研究實驗：正毛化橘紅、副毛化橘紅、光青化橘紅等樣品均來自廣東省化州市和茂名市，并經(jīng)廣東省藥品檢驗所楊志業(yè)副主任中藥師鑒定。其中正毛化橘紅樣品8份，副毛化橘紅5份，假西洋品種3份，光青化橘紅2份。采集其新鮮葉片并用硅膠快速干燥，采樣時間為2016年5月，樣品信息見表1。

表1 研究實驗樣品的來源及品種

驗證實驗：2017年5月在廣州市香雪制藥股份有限公司的化州橘紅種植基地隨機選擇已掛果的部分正毛化橘紅、副毛化橘紅、假西洋品種和光青化橘紅共80棵，品種信息經(jīng)廣東省藥品檢驗所楊志業(yè)副主任中藥師鑒定，其中正毛化橘紅24株，副毛化橘紅21株，假西洋品種23株，光青化橘紅12株。采集其葉片并做好其編號和品種信息記錄，具體情況見表樣品信息詳見表2。

1.2 試劑

Taq DNA聚合酶、10×Taq緩沖液、dNTPs[普洛麥格(北京)生物技術有限公司]；PCR擴增引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]；化學試劑均為分析純。

1.3 儀器

5418型高速離心機(Eppendorf，德國)；C1000 TouchTMwith 48/48 Fast Reaction型PCR擴增儀(BioRad，美國)；Gel DocTMXR+型凝膠成像系統(tǒng)(BioRad，美國)

表2 驗證實驗化橘紅樣品的品種情況

1.4 方法

1.4.1 DNA提取與檢測 采用天根植物基因組試劑盒提取所有樣品的基因組DNA。用微量紫外核酸儀檢測DNA濃度和純度。將合格樣品DNA濃度稀釋至20 ng·μL-1后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 ISSR分子標記的引物篩選及PCR擴增 PCR反應體系：10×buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)1.5 μL，dNTPs(10 mmol·L-1)0.5 μL，引物(10 μmmol·L-1)0.5 μL，Taq DNA聚合酶1.5 U，DNA模板50 ng，用純水補足25 μL。擴增程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min，35個循環(huán)，72 ℃ 10 min；電泳條件：取10 μL PCR產(chǎn)物與1 μL上樣緩沖液混勻，于1×TAE、5 V·cm-1電泳30 min，用凝膠成像系統(tǒng)照相存盤，每個處理重復2次。對50條ISSR引物進行分析，篩選出條帶清晰、多態(tài)性好的ISSR引物，并用篩選到的引物對SN1～SN18的DNA模板進行PCR擴增和電泳，每個處理重復2次。

1.4.3 PCR擴增的條件優(yōu)化 選用L16(54)正交試驗設計(表3)，對Mg2+、dNTPs濃度、Taq DNA聚合酶、引物和DNA用量進行5因素4水平的正交試驗。以正毛化橘紅SN2樣本的DNA為模板，引物827作為擴增引物，反應總體積25 μL，含有10×PCR Buffer 2.5 μL，每個處理重復2次。

表3 PCR反應正交體系濃度表

1.4.4 驗證實驗 以2017年5月采集的化橘紅(表2)葉片DNA為樣品進行驗證實驗，在正交實驗的基礎上選擇最優(yōu)的PCR體系進行擴增反應，擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。擴增反應結束后，取10 μL擴增產(chǎn)物加入1 μL 10×loading buffer用1.0%瓊脂糖凝膠，于1×TAE、5V·cm-1電泳30 min，凝膠成像儀下拍照。每個處理重復2次。

2 結果與分析

2.1 DNA提取結果

將提取的所有樣品的基因組DNA在超微量紫外分光光度計下測量其濃度和純度，得到其A260/A280均在1.8～2.0之間，說明DNA純度較高，符合PCR技術要求。

2.2 正毛化橘紅特征條帶分析及引物選擇

在50條ISSR隨機引物篩選過程中發(fā)現(xiàn)引物818和827有不同于其他引物的特征條帶，其組合能夠鑒別正毛化橘紅。引物序列：818——CACACACACACACACAG，827——ACACACACACACACACG。

圖1和圖2分別為ISSR隨機引物818和827的電泳圖譜，第1～18泳道對應的樣品分別為表1中SN1～SN18。圖1中第3～5、11、13、14、18泳道在200～500 bp之間接近500 bp處有一條條帶(白線圈出的條帶)，而其他泳道沒有，這7個泳道對應的化橘紅樣品分別是SN3副毛、SN4假西洋、SN5光青、SN11假西洋、SN13副毛、SN14光青和SN18假西洋，其他泳道為正毛化橘紅和部分副毛化橘紅，說明正毛化橘紅是沒有這一特征條帶的。圖2中第2、3、6～8、10、12、13、15、17泳道在200～500 bp之間接近500 bp處有明顯的條帶(白線圈出的條帶)，而其他泳道沒有，這10個泳道對應的化橘紅樣品分別為SN2正毛、SN3副毛、SN6正毛、SN7正毛、SN8正毛、SN10正毛、SN12正毛、SN13副毛、SN15正毛、SN17正毛，說明假西洋品種、光果、部分副毛化橘紅沒有這一特征條帶。綜合引物818和827的電泳圖譜可以看出，正毛化橘紅的標記為(0，1)，即正毛化橘紅DNA用引物818擴增沒有最下方的條帶，用827擴增有最下方的條帶；副毛化橘紅的標記為(0，0)或(1，1)，光果和假西洋品種的標記為(1，0)。因此通過818和827這兩個引物的特征條帶能夠將正毛化橘紅篩選出。

注：泳道1～18分別對應表1中的樣品SN1～SN18。圖1 引物818的電泳圖譜

注：泳道1～18分別對應表1中的樣品SN1～SN18。圖2 引物827的電泳圖譜

2.3 PCR體系優(yōu)化

使用正毛化橘紅SN2的DNA模板、引物827對PCR反應體系進行優(yōu)化的電泳結果見圖3，本方法是采用特征條帶來鑒別正毛化橘紅，因此特征條帶明顯、雜帶少是關鍵。條件3、4、6、8、11、12、15、16這八個條件雜帶較多，而條件1和條件2因其DNA模板濃度太低可能存在潛在的不穩(wěn)定性，綜合各個條件的重復性和穩(wěn)定性，最終選擇條件14，即PCR反應體系為10×buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)1.5 μL，dNTPs(10 mmol·L-1)0.7 μL，引物(10 μmmol·L-1)0.5 μL，Taq DNA聚合酶2.0 U，DNA模板65 ng。用該條件對引物818進行PCR擴增，其特征條帶也非常清晰，只是其他條帶稍多。為了使本研究建立的方法更加簡便，對引物818和827采用同樣的PCR擴增體系。

注：泳道1～16分別為表3中1～16組不同PCR反應體系。圖3 正交體系優(yōu)化電泳圖譜

2.4 驗證實驗

圖4-圖7分別為表2的化橘紅DNA模板采用引物818和827擴增的電泳圖譜，Marker右側的泳道從左到右依次為表2的編號從小到大的順序。將所有樣品的818和827特征條帶進行統(tǒng)計，有特征條帶記為1，無特征條帶記為0，結果見表4。由表可知，所有正毛化橘紅的標記均為(0，1)，副毛化橘紅的標記為(0，0)或(1，1)，光果和假西洋品種的標記為(1，0)。由電泳圖譜可知，所有正毛化橘紅在200～500 bp之間均無818的特征條帶，均有827的特征條帶，說明通過818和827這兩個引物的特征條帶能夠將正毛化橘紅鑒別出。

注：泳道1～48分別對應表2中的樣品1～48。圖4 化橘紅的引物818的電泳圖譜-1

注：泳道49～80分別對應表2中的樣品49～80。圖5 化橘紅的引物818的電泳圖譜-2

注：泳道1～48分別對應表2中的樣品1～48。圖6 化橘紅的引物827的電泳圖譜-1

注：泳道49～80分別對應表2中的樣品49～80。圖7 化橘紅的引物827的電泳圖譜-2

3 討論

ISSR分子標記技術因其具有穩(wěn)定、多態(tài)性高、簡便易操作及不受環(huán)境因素影響等優(yōu)勢，已被廣泛應用到藥用植物種質資源鑒定、親緣關系分析及道地性研究，并取得良好效果[8]。張春等[9]利用ISSR分子標記技術對藥用當歸及其混偽品進行鑒別，找到了當歸及其混偽品間的特異鑒別引物，為建立穩(wěn)定的當歸質量評價體系提供了技術支持。魏藝聰?shù)萚10]采用ISSR標記分析草珊瑚的DNA指紋圖譜，結果證實ISSR分子標記可以有效辨別18份受試草珊瑚樣品。ISSR分子標記的后期實驗數(shù)據(jù)處理一般采用聚類分析方法，得到聚類分析圖譜，但缺乏統(tǒng)一標準[8]，因此在生產(chǎn)推廣應用上收到限制。本研究是在ISSR分子標記技術的基礎上找到正毛化橘紅的特征條帶組合，建立了通過2條引物鑒別正毛化橘紅的PCR方法，并且進行了大量樣品的驗證。該方法快速簡便且準確，且無需通過聚類分析，直接根據(jù)特征條帶來鑒別正毛化橘紅，可以應用于化橘紅種植基地的種苗篩選中，得到品質最好的正毛化橘紅種苗，為優(yōu)質化橘紅種苗的篩選提供技術支持。

表4 化橘紅的品種及特征條帶情況

由于ISSR標記利用的是非特異引物，其擴增條帶的穩(wěn)定性是相對的，因此在進行PCR時需要嚴格保證各項條件一致才能得到較穩(wěn)定的電泳條帶，最理想的結果是將其轉化為采用特異引物對擴增的SCAR分子標記。在本研究中已經(jīng)找到正毛化橘紅的特征條帶組合(特征標記)，下一步可考慮將ISSR標記中的特異性條帶回收、克隆和測序，設計特異引物對，轉化成SCAR標記，以建立更加穩(wěn)定的分子鑒定方法。

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