周小琴 盧瑞芯 司徒少金 湯丹

摘要：目的 建立快速同時(shí)測定梔子藥材中梔子苷和西紅花苷-1含量的分析方法。方法 采用常規(guī)液相色譜儀系統(tǒng)，Agilent Poroshell 120 EC-C18核殼色譜柱（100 mm×4.6 mm，2.7 ?m），流動(dòng)相為乙腈-0.2%甲酸水溶液，梯度洗脫，檢測波長時(shí)間程序?yàn)?40 nm（0～7 min）、440 nm（7～14 min）。采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)色譜圖中的主要成分進(jìn)行指認(rèn)。結(jié)果 梔子苷和西紅花苷-1分別在0.2～6.0 ?g和0.04～1.2 ?g進(jìn)樣量范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 9）；儀器精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)RSD均小于3%；平均加樣回收率分別為99.89%和101.74%，RSD均小于3%。采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)色譜圖中的8個(gè)主要成分進(jìn)行了指認(rèn)，包括3個(gè)環(huán)烯醚萜類成分和5個(gè)西紅花酸類成分。結(jié)論 該方法簡便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為建立高效的梔子藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：梔子；梔子苷；西紅花苷-1；快速分析

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.019

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）05-0086-04

Rapid Determination of Geniposide and Crocin-1 in Gardeniae Fructus

Based on Core Shell Chromatographic Column

ZHOU Xiao-qin1， LU Rui-xin1， SITU Shao-jin1， TANG Dan2

1. Guangzhou Baiyunshan Mingxing Pharmaceutical Co.， Ltd.， Guangzhou 510250， China；

2. College of Pharmacy， Jinan University， Guangzhou 510632， China

Abstract： Objective To establish a rapid method for simultaneous determination of geniposide and crocin-1 in Gardeniae Fructus. Methods A conventional liquid chromatography system was used. An Agilent Poroshell 120 EC-C18 column （100 mm × 4.6 mm， 2.7 ?m） was used with the mixture of acetonitrile-0.2% formic acid solution as the mobile phase in gradient elution. Detection wavelength was as follow： 240 nm （0–7 min）， 440 nm （7–14 min）. At the same time HPLC-MS/MS technology was used to identify the main components of the chromatogram. Results The calibration curves of geniposide and crocin-1 were in good linearity among the ranges of 0.2–6.0 ?g and 0.04–1.2 ?g， respectively （r=0.999 9）. For the precision test， stability test， repeatability test， the RSD were less than 3%. The average recoveries were 99.89% and 101.74%， respectively， and all the RSD were less than 3%. Eight major components were identified by HPLC-MS/MS technology， including three iridoids and five crocetin derivatives. Conclusion The developed method is simple， rapid， accurate and reproducible， which can provide a basis for quality evaluation of Gardeniae Fructus.

Keywords： Gardeniae Fructus； geniposide； crocin-1； rapid analysis

梔子為茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實(shí)，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒等功效。研究表明，梔子中含量較高且具有較強(qiáng)藥理活性的成分主要有2大類，即以梔子苷為代表

基金項(xiàng)目：國家科技重大專項(xiàng)（2011ZX09201-201-07）

通訊作者：湯丹，E-mail：tdpharm@126.com

的環(huán)烯醚萜類和以西紅花苷為代表的西紅花酸類成分[1-2]。梔子苷具有抗炎、利膽等作用[3]，西紅花苷在抗炎、抗心肌缺血、抗血栓、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血脂等方面具有顯著的藥理作用[4]。

在前期系列工作基礎(chǔ)上[5-6]，為提高檢驗(yàn)效率、降低成本，本研究引入新型的核殼色譜柱，基于常規(guī)HPLC系統(tǒng)，建立同時(shí)測定梔子中2種主要成分梔子苷和西紅花苷-1的快速分析方法，對(duì)梔子道地產(chǎn)區(qū)的樣品進(jìn)行含量測定，同時(shí)采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)色譜圖中的主要成分進(jìn)行指認(rèn)。

1 儀器與試藥

Aglient1200型高效液相色譜儀（配備在線脫氣四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器），島津LCMS-8040三重四極桿質(zhì)譜儀，MUS/1006型超聲波清洗器（深圳現(xiàn)代超聲實(shí)業(yè)有限公司），A&DER-180A;型萬分之一分析天平（日本A&D;公司）。

梔子苷（批號(hào)110749-201316）、西紅花苷-1（批號(hào)111588-201303）對(duì)照品，中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純，德國Merck公司；甲酸為分析純，廣州市化學(xué)試劑廠；水為超純水，其他試劑均為分析純。6批梔子藥材均來自道地產(chǎn)區(qū)江西，購自廣州市采芝林藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為160510、160702、160706、161001、161007、161103，經(jīng)廣州白云山明興制藥有限公司中心化驗(yàn)室陳文榮高級(jí)工程師鑒定為茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.7 ?m，100 mm×4.6 mm），流動(dòng)相為0.2%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～7 min，7%～30%B；7～14 min，30%～75%B），流速為1.0 mL/min，檢測波長為240 nm（0～7 min）、440 nm（7～14 min），柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為10 ?L。

2.2 質(zhì)譜條件

正離子模式檢測；霧化氣和干燥氣均為氮?dú)?；干燥氣流?0 L/min；霧化氣流速3 L/min；脫溶劑管溫度為300 ℃，加熱模塊溫度為400 ℃；毛細(xì)管電壓3 kV；全掃描范圍為m/z 100～1200；柱后分流，流動(dòng)相進(jìn)入質(zhì)譜檢測器的量為0.5 mL/min。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取適量梔子苷和西紅花苷-1對(duì)照品，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配制成含梔子苷1.0 mg/mL和西紅花苷-1 0.2 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.4 供試品溶液的制備

取梔子樣品干燥粉末（過40目篩）0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇（V/V）50 mL，密塞，搖勻，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率30 kHz）40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇（V/V）補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 ?m微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液，備用。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 ?L，分別注入色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果理論塔板數(shù)按梔子苷和西紅花苷-1計(jì)算均不低于3000，2種成分色譜峰與相鄰峰之間分離度均大于1.5，對(duì)稱因子在0.95～1.05范圍內(nèi)，樣品中其他成分不干擾待測成分的測定。

A

B

注：A.對(duì)照品；B.供試品；3.梔子苷；4.西紅花苷-1

圖1 梔子中梔子苷和西紅花苷-1 HPLC圖

2.6 色譜峰的指認(rèn)

吸取各供試品溶液1 ?L，記錄質(zhì)譜信號(hào)。在HPLC-MS/MS分析過程中，通過分析ESI-MS/MS提供的化合物保留時(shí)間、分子量信息、質(zhì)譜裂解碎片的種類等信息，并結(jié)合對(duì)照品比對(duì)以及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[7-8]，對(duì)色譜圖中波長240 nm和440 nm處的8個(gè)主要成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，包括3個(gè)環(huán)烯醚萜類成分和5個(gè)西紅花酸類成分。結(jié)果見表1。

2.7 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.4”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，依次注入液相色譜儀，測定色譜峰面積，以對(duì)照品濃度（?g/mL）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。梔子苷：Y=11.714X+4.173（r=0.999 9），西紅花苷-1：Y=30.757X+12.105（r=0.999 9）。結(jié)果表明，梔子苷和西紅花苷-1進(jìn)樣量分別在0.2～6.0 ?g和0.04～1.2 ?g范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.8 精密度試驗(yàn)

取同一混合對(duì)照品溶液10 ?L，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次測定。結(jié)果梔子苷和西紅花苷-1峰面積RSD分別為0.8%、0.5%，表明儀器精密度良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次的供試品溶液，放置于室溫，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 ?L進(jìn)行分析，記錄峰面積。結(jié)果梔子苷和西紅花苷-1的峰面積RSD分別為1.1%、2.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批梔子樣品6份，精密稱定，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 ?L，以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算梔子苷和西紅花苷-1的含量，結(jié)果2種成分含量平均值分別為5.18%、0.68%，RSD分別為1.2%、1.7%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.11 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的梔子樣品粉末6份，每份100 mg，精密稱定，分別加入相當(dāng)于樣品中梔子苷和西紅花苷-1含量的對(duì)照品溶液適量。按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 ?L測定，計(jì)算梔子苷和西紅花苷-1的回收率和RSD。結(jié)果見表2。

2.12 樣品含量測定

精密稱取6批梔子樣品粉末0.2 g，按“2.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 ?L，每個(gè)溶液進(jìn)樣3次，計(jì)算各樣品中梔子苷和西紅花苷-1的含量。結(jié)果見表3。

3 討論

近年來，基于核殼技術(shù)的新型Agilent Poroshell 120色譜柱通過獨(dú)特的填料結(jié)構(gòu)，擁有較高的柱效性能，同時(shí)柱壓較低，使其能在常規(guī)液相系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)快速高效分離。針對(duì)梔子苷和西紅花苷-1的同時(shí)定量分析，常規(guī)HPLC分析方法的時(shí)間達(dá)40 min[9-10]。本研究運(yùn)用該新型色譜柱，成功實(shí)現(xiàn)了在常規(guī)液相系統(tǒng)上14 min內(nèi)快速分析梔子成分的目的，分析時(shí)間明顯縮短，大幅改善液相色譜的分離度、靈敏度，節(jié)省化學(xué)試劑，提高工作通量，從而節(jié)約分析成本，使液相色譜的分離能力得到進(jìn)一步延伸和擴(kuò)展，可極大提高分析工作的質(zhì)量和效率，應(yīng)用前景廣闊。

全波長（200～600 nm）掃描發(fā)現(xiàn)，梔子苷在波長240 nm處有最大吸收，而西紅花苷-1在440 nm處呈最大吸收。兩類成分的最大吸收波長不同，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)及本研究中的HPLC-MS/MS圖譜，環(huán)烯醚萜類成分先于西紅花酸類成分，且兩類成分互不干擾。因此，采用常見的可變單波長檢測器，通過設(shè)定時(shí)間程序改變檢測波長，選取7 min為檢測波長轉(zhuǎn)換點(diǎn)，使檢測波長由240 nm變?yōu)?40 nm，實(shí)現(xiàn)了一張色譜圖同時(shí)呈現(xiàn)梔子中環(huán)烯醚萜類和西紅花酸類兩大類主成分的目的，更加方便直觀。

本研究基于新型表面多孔填料技術(shù)色譜柱，采用常規(guī)HPLC系統(tǒng)結(jié)合程序變波長法同時(shí)測定了梔子中梔子苷和西紅花苷-1的含量，應(yīng)用該方法測定了6批道地產(chǎn)區(qū)梔子樣品中上述2種成分的含量。同時(shí)還采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)色譜圖中的8個(gè)主要峰進(jìn)行了指認(rèn)。本研究建立的含量測定方法分析時(shí)間短、重復(fù)性好、精密度高、專屬性強(qiáng)，且常規(guī)儀器即可滿足，適用面更廣。

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（收稿日期：2017-11-02）

（修回日期：2017-11-23；編輯：陳靜）