郭海雷　盧才教　劉政軍　凌翔偉　胡德林　方林森

[摘要] 目的 觀察早期膿毒癥大鼠模型心臟冠狀動脈內(nèi)皮與心肌細胞損害情況，探討內(nèi)皮細胞在心肌損害中發(fā)揮的作用。 方法 SD大鼠72只，隨機分為正常、假手術(shù)和膿毒癥組，采用盲腸結(jié)扎加穿孔術(shù)（CLP）制備膿毒癥模型，術(shù)后3 h、6 h、12 h和24 h測量心肌力學(xué)指標，包括左室收縮峰壓（LVSP）、左室壓力最大上升速率（+dp/dt max）和左室壓力最大下降速率（-dp/dt max），并測量血清內(nèi)皮素1（ET-1）、一氧化氮（NO）、肌鈣蛋白I（cTnI）水平，透射電鏡觀察冠狀動脈內(nèi)皮細胞和心肌細胞超微結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)果 膿毒癥組NO和ET-1水平在術(shù)后即明顯升高，12 h達峰值；NO和ET-1比值在CLP術(shù)后3 h即開始明顯降低，持續(xù)低于正常水平。冠狀血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)損傷呈逐步加重，管腔內(nèi)脫落內(nèi)皮細胞數(shù)目增多，內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)損傷評分逐步增高。CLP后3 h即出現(xiàn)收縮舒張功能顯著下降，LVSP、±dp/dt max術(shù)后6 h達最低；膿毒癥組血清cTnI在術(shù)后即明顯升高，12 h時點達峰值；膿毒癥組心肌細胞超微結(jié)構(gòu)顯示肌原纖維、肌漿網(wǎng)、線粒體等損傷逐漸加重，但線粒體數(shù)目有增多現(xiàn)象。 結(jié)論 膿毒癥早期即存在明顯冠狀動脈內(nèi)皮損傷，心肌細胞損害和心肌功能障礙，內(nèi)皮細胞在心肌損害中可能扮演重要角色。

[關(guān)鍵詞] 膿毒癥；內(nèi)皮細胞；心肌細胞；肌鈣蛋白I；內(nèi)皮素

[中圖分類號] R656.7；R459.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）10-0037-05

Study on the early vascular endothelial and myocardial damage in rats with sepsis and its correlation

GUO Hailei1 LU Caijiao1 LIU Zhengjun1 LING Xiangwei1 HU Delin2 FANG Linsen2

1.Burn and Wound Center，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000，China； 2.Department of Burn Surgery，the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022，China

[Abstract] Objective To observe the damages of coronary artery endothelium and myocardial damage in the rat model of early sepsis and to explore the role of endothelial cells in myocardial damage. Methods 72 SD rats were randomly divided into normal， sham-operation and sepsis groups. Cecal ligation and perforation（CLP） was used to prepare sepsis model. 3 h， 6 h， 12 h and 24 h after surgery， indices of myocardial mechanics were measured， including left ventricular systolic pressure （LVSP）， maximum increasing rate of left ventricular pressure （+dp/dt max） and maximum decreasing rate of left ventricular pressure（-dp/dt max）. The levels of endothelin 1 （ET-1）， nitric oxide（NO）， troponin I （cTnI） were measured. TEM was used to observe endothelial cells of coronary artery and myocardial ultrastructure changes. Results The levels of NO and ET-1 in sepsis group were increased significantly after operation and peaked at 12 hours； the ratio of NO to ET-1 was decreased significantly at 3 h after CLP， and remained below normal level. Coronary endothelial cell ultrastructure damage was gradually increased， exfoliative endoluminal endothelial cells were increased， and endothelial cell ultrastructure damage score was gradually increased. 3 h after CLP， the systolic and diastolic function was decreased significantly. LVSP， ±dp/dt max reached the lowest at 6 h after operation； serum cTnI in sepsis group was increased significantly after operation and peaked at 12 h. The ultrastructure of myocardial cells in sepsis group showed that the myofibrils， sarcoplasmic reticulum， mitochondria and other damages were gradually aggravated， but there was an increase in the number of mitochondria. Conclusion In the early stage of sepsis， there are obvious coronary endothelial damage， myocardial cell damage and myocardial dysfunction. Endothelial cells may play an important role in myocardial damage.

[Key words] Sepsis； Endothelial cells； Myocardial cells； Troponin I； Endothelin

膿毒癥是指因感染引起機體反應(yīng)失調(diào)而引起致命性多臟器功能障礙，存在循環(huán)、細胞和代謝功能異常[1]。膿毒癥和膿毒性休克目前仍是引起死亡的重要原因，每年全球膿毒癥患者數(shù)量超過數(shù)百萬，約1/4甚至更多患者因此死亡[2]。目前膿毒癥的病理生理學(xué)機制尚未完全明確，其中內(nèi)皮細胞作為炎癥反應(yīng)的重要靶細胞和效應(yīng)細胞，其凋亡、脫落、通透性改變，失控性分泌多種細胞因子和炎性物質(zhì)，引起凝血功能紊亂等在膿毒癥進展中發(fā)揮重要作用[3，4]。膿毒癥心功能障礙表現(xiàn)為心肌收縮、舒張功能下降，是一種“功能性”、可逆性改變，是嚴重膿毒癥的常見并發(fā)癥，合并心功能障礙患者病死率可達70%～90%，被認為是膿毒性休克患者病死率的獨立危險因素[5]。本實驗采用經(jīng)典的CLP膿毒癥大鼠模型，通過檢測血清NO、ET-1和cTnI水平，測定心肌力學(xué)、透射電鏡下觀察冠狀動脈內(nèi)皮和心肌細胞細胞核、線粒體、肌原纖維等超微結(jié)構(gòu)變化，深入了解膿毒癥大鼠早期血管內(nèi)皮、心肌細胞損害和心肌功能障礙情況，探討內(nèi)皮細胞可能在膿毒癥心肌損害中扮演的角色。

1 材料與方法

1.1 動物分組與膿毒癥模型制備

SD大鼠72只，清潔級，♂♀各半，體重（250±30）g（購于安徽醫(yī)科大學(xué)動物中心）。SD大鼠染色編號后隨機分正常組（N組）、假手術(shù)組（S組）和膿毒癥組（C組），S組和C組又分為手術(shù)后3 h、6 h、12 h和24 h四個亞組（S1，S2，S3，S4，C1，C2，C3，C4），每組8只SD大鼠，動物分籠飼養(yǎng)。

使用CLP法復(fù)制膿毒癥模型：SD大鼠皮下注射水合氯醛（濃度10%，0.03 mL/kg），麻醉顯效后固定，腹正中線切開約1.5 cm，拉出盲腸，根部絲線結(jié)扎，用18號注射針頭貫穿盲腸3次，擠壓盲腸見有糞便流出，回納盲腸后逐層關(guān)腹。術(shù)后立即在大鼠皮下注射NS 5 mL預(yù)防休克。S組大鼠僅行盲腸探查術(shù)。

1.2 心肌力學(xué)測量

N組在3 h時點，S組和C組在3 h、6 h、12 h和24 h四時點分批用水合氯醛（濃度10%，0.03 mL/kg）麻醉大鼠，固定，頸部去毛后切開皮膚，找到、分離左頸內(nèi)動脈，將導(dǎo)管置入左心室內(nèi)，采用生物機能實驗系統(tǒng)（BIOPAC-11A2055型）測量3 h、6 h、12 h和24 h時點的LVSP、+dp/dt max和-dp/dt max，穩(wěn)定2 min后記錄數(shù)值。心肌力學(xué)測定后開腹，從腹主動脈留取血標本待檢測。動物失血死亡后立即開胸取出心臟，切取部分心肌和冠狀動脈置于戊二醛液（濃度2.5%）中固定。

1.3 冠狀動脈內(nèi)皮細胞和心肌細胞電鏡下觀察

戊二醛溶液固定后的冠狀動脈和心肌組織經(jīng)包埋、切片后在JEM-1230型透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)。

1.4 血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)損傷評分

根據(jù)大鼠冠狀動脈血管內(nèi)皮細胞在透射電鏡下超微結(jié)構(gòu)改變，按照有關(guān)文獻[6]稍作改變后對血管內(nèi)皮細胞損傷程度進行評分，評分標準見表1。

1.5 cTnI、NO和ET-1測定

留取的血標本4000轉(zhuǎn)/min離心10 min，分離血清放置-80℃冰箱保存。使用酶聯(lián)免疫法檢測血清cTnI、ET-1水平，硝酸還原法檢測血清NO水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，進行獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清NO、ET-1和內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)損傷評分的變化

與S組和N組比較，C組血清NO、ET-1術(shù)后3 h即持續(xù)升高（P<0.01），24 h時點較前略有回落，但仍維持較高水平；NO和ET-1比值CLP術(shù)后3 h即開始逐步下降，顯著低于N組和S組（P<0.05）；C組大鼠CLP術(shù)后3 h冠狀動脈血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)損傷評分即開始升高，分值逐步增大。見表2。

2.2 心肌力學(xué)和血清cTnI變化

與S組和N組比較，C組心肌力學(xué)指標（LVSP、+dp/dt max和-dp/dt max）術(shù)后3 h即明顯降低，在6 h達谷底，12 h后有所回升，但仍顯著低于對照組（P<0.05）；C組術(shù)后3 h血清cTnI水平持續(xù)升高，顯著高于同時點S組與N組（P<0.01），24 h時點有回落趨勢，但仍顯著高于正常水平。見表3。

2.3 冠狀動脈內(nèi)皮細胞和心肌細胞電鏡下變化

CLP術(shù)后3 h 大鼠冠狀動脈血管內(nèi)皮細胞表現(xiàn)為水腫，輪廓變圓，線粒體也呈現(xiàn)腫脹；CLP術(shù)后12 h冠狀動脈血管內(nèi)皮細胞部分可見核皺縮和染色體邊集，胞內(nèi)溶酶體數(shù)目增加，部分線粒體脊突結(jié)構(gòu)破壞消失，可見部分內(nèi)皮細胞與血管基膜分離；CLP術(shù)后24 h可見較多輪廓不清的冠狀動脈血管內(nèi)皮細胞，胞內(nèi)較多線粒體脊突結(jié)構(gòu)消失，出現(xiàn)核固縮和空泡樣改變，冠狀動脈管腔內(nèi)可見數(shù)目較多的凋亡脫落的內(nèi)皮細胞（圖1～4）。

CLP術(shù)后3 h SD大鼠心肌肌原纖維間距離開始逐漸增寬、溶解，肌漿網(wǎng)擴張，線粒體腫脹，隨膿毒癥進展損傷逐步加重，CLP術(shù)后24 h心肌肌原纖維結(jié)構(gòu)破壞嚴重，大量肌原纖維斷裂、溶解，并見部分線粒體結(jié)構(gòu)模糊，但數(shù)目有增多表現(xiàn)（圖5～8）。

3 討論

目前膿毒癥發(fā)病機制尚不完全明確，認為失控性炎癥反應(yīng)、凝血功能障礙和微血管功能紊亂在膿毒癥病理生理變化中擔(dān)當關(guān)鍵角色，其中內(nèi)皮細胞的激活和損傷在膿毒癥發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[7-9]，是SIRS、MODS、MOF發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。關(guān)于膿毒癥心功能障礙的病理生理學(xué)機制尚不明確，目前研究認為心肌抑制因子、氧化應(yīng)激、線粒體功能損害、神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)障礙、能量異常代謝等方面可能參與膿毒癥心功能障礙的病理生理過程，心肌損害是膿毒性休克患者病死率的獨立危險因素，可影響膿毒癥患者預(yù)后[5]。

內(nèi)皮細胞作為炎癥反應(yīng)的重要靶細胞因鈣超載損傷而發(fā)生凋亡和壞死，內(nèi)皮細胞與基膜分離、脫落，血管通透性增加，炎性細胞游走到臟器組織，促使組織炎癥反應(yīng)加重；內(nèi)皮細胞作為效應(yīng)細胞分泌多種細胞因子和炎性介質(zhì)，造成組織器官損傷加重，加速膿毒癥的進程[10-12]。ET-1和NO主要由內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的血管收縮和舒張調(diào)節(jié)物質(zhì)，二者分泌失調(diào)時可造成嚴重的機體組織缺血缺氧性損傷[13，14]。生理狀態(tài)下的NO具有抑制白細胞與血管內(nèi)皮粘附、抑制血小板凝集、調(diào)節(jié)內(nèi)皮素的分泌水平、防止血管收縮痙攣及血栓形成、維持心臟等重要器官的血液灌注等作用[15]。膿毒癥及膿毒癥休克時，機體在炎癥介質(zhì)、內(nèi)毒素等刺激下高表達iNOS，產(chǎn)生大量NO，啟動機體內(nèi)的硝化應(yīng)激反應(yīng)，對細胞產(chǎn)生毒性作用，造成肺組織等損傷[15，16]。ET-1對血管平滑肌具有強烈持久的收縮作用，能使機體各種血管發(fā)生收縮，尤其是心臟冠狀動脈，其主要表達于內(nèi)皮細胞。本研究中SD大鼠CLP術(shù)后3 h血清NO和ET-1即明顯升高，12 h達到最大值，分別為（123.5±4.2）μg/mL、（148.4±9.7）pg/mL，24 h稍有降低，但仍明顯高于假手術(shù)組和正常組（P<0.01），而NO和ET-1比值呈下降趨勢，每時點比值均顯著低于正常組（P<0.05）。實驗結(jié)果提示，內(nèi)皮細胞在膿毒癥狀態(tài)下過度產(chǎn)生NO，高表達內(nèi)皮素，且二者比例失衡，在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到重要作用，尤其在心肌毒性、心肌缺血缺氧性損傷中可能起關(guān)鍵作用；如果能夠有效防治NO和ET-1的過度表達與釋放，將二者調(diào)控在合適比例，勢必可能會減輕膿毒癥臟器損害。凋亡的內(nèi)皮細胞脫落后形成循環(huán)內(nèi)皮細胞，其數(shù)量可以直接和特異地反映活體內(nèi)血管損傷情況[17]。本實驗電鏡下觀察冠狀動脈血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)損傷評分呈逐步升高，內(nèi)皮細胞呈現(xiàn)水腫，線粒體棘突消失、腫脹，核固縮、空泡樣變化，并逐步加重，最后較多內(nèi)皮細胞凋亡脫落至管腔內(nèi)。內(nèi)皮細胞凋亡、脫落，引起凝血功能紊亂，微循環(huán)障礙，累及多系統(tǒng)和臟器，進而導(dǎo)致MODS發(fā)生，所以內(nèi)皮細胞可能是尋找膿毒癥治療的重要靶細胞。

cTnI是較CK、CK-MB敏感性和特異性更高的心肌細胞損傷標志物，cTnI升高水平與膿毒癥的嚴重程度有關(guān)，持續(xù)性升高預(yù)示心功能障礙和不良預(yù)后[18]。Cheng H等[19]通過對430例患者的研究認為cTnI是嚴重膿毒癥及感染性休克患者強有力的預(yù)測病死率的指標。本實驗顯示膿毒癥大鼠早期就出現(xiàn)cTnI增高，持續(xù)高于正常水平，提示膿毒癥初期即存在明顯的心肌細胞結(jié)構(gòu)破壞，實驗中透射電鏡觀察也證實膿毒癥早期心肌細胞超微結(jié)構(gòu)破壞明顯，表現(xiàn)為肌原纖維間距變寬，溶解破壞逐步加重，線粒體出現(xiàn)腫脹、棘突消失，結(jié)構(gòu)模糊等，故而膿毒癥早期采取有效措施減輕心肌細胞損害尤為重要。本實驗中cTnI水平在CLP術(shù)后C3達峰值[（1.489±0.260）ng/mL]，之后有所降低，與持續(xù)損害的心肌細胞超微結(jié)構(gòu)有差異，cTnI非持續(xù)性升高可能與cTnI釋放、降解動態(tài)平衡及耗竭有關(guān)[20]。LVSP、+dp/dt max、-dp/dt max是反映心肌收縮、舒張功能的敏感指標。本實驗顯示LVSP、+dp/dt max和-dp/dt max在CLP術(shù)后3 h即呈現(xiàn)顯著下降，6 h時達到谷底，在12 h后有回升表現(xiàn)，提示膿毒癥初期即存在心肌收縮、舒張功能異常，其可能是“可逆性”功能改變，所以臨床上早期進行心肌保護治療可能對膿毒癥患者預(yù)后有益[5]。電鏡觀察膿毒癥時心肌超微結(jié)構(gòu)損害呈逐步加重，而心肌力學(xué)并非持續(xù)降低，其機制尚不明確，可能與神經(jīng)內(nèi)分泌負反饋調(diào)節(jié)、心肌抑制因子衰減、消耗、心肌線粒體誘生等因素有關(guān)[20]。

有研究顯示一些抗炎藥物，如烏司他丁、血必凈等在減輕內(nèi)皮細胞活化、損害的同時可顯著改善心肌功能，減少心肌細胞損害[21，22]。本實驗結(jié)果顯示，膿毒癥早期血清NO、ET-1水平明顯升高，且比例失調(diào)的同時，cTnI水平顯著升高，心肌功能下降，透射電鏡下觀察到膿毒癥早期冠狀動脈血管內(nèi)皮細胞損傷的同時伴有心肌細胞損傷，二者超微結(jié)構(gòu)損害均呈進行性加重，提示膿毒癥狀態(tài)下血管內(nèi)皮細胞和心肌細胞損傷可能相關(guān)，內(nèi)皮細胞可能通過多途徑參與心肌損害，如血管內(nèi)皮細胞在毒素和失控性炎性細胞因子刺激下誘導(dǎo)NO和ET-1大量表達和釋放，高濃度的NO可對心肌細胞直接產(chǎn)生毒性作用，且二者比例失衡可引起血管痙攣收縮，引起缺血缺氧性心肌損害；凋亡的血管內(nèi)皮細胞從基底膜脫落，造成膠原暴露，啟動內(nèi)源性凝血機制，引起凝血功能紊亂、血小板聚集、血栓形成，加重心肌微循環(huán)障礙；膿毒癥狀態(tài)下內(nèi)皮細胞損傷和活化，其表面過量表達的黏附分子、選擇素（如VCAM-1、E-選擇素等）誘導(dǎo)白細胞的趨化、黏附和游走，游走至心肌組織的白細胞釋放過量髓過氧化物酶、蛋白水解酶、炎性介質(zhì)等有害物質(zhì)可對心肌細胞造成直接損害。

綜上，膿毒癥早期即出現(xiàn)顯著心肌和血管內(nèi)皮細胞損害，內(nèi)皮細胞在心肌損害中可能扮演重要角色，其具體機制有待進一步深入研究。

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（收稿日期：2017-10-08）