周柱輝，陳肇源，陳桂霞，潘 杰，張險(xiǎn)朋★

（1．廣東省東莞市橫瀝鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，廣東 東莞 523460；2．東莞市萬(wàn)江農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，廣東 東莞 523050；3．廣東省東莞市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東 東莞 523086）

布魯氏菌病簡(jiǎn)稱布病，是由布魯氏菌（Brucella）引起的一種人畜共患病，廣泛分布于世界各地。根據(jù)布魯氏菌的生物學(xué)特性和宿主，可將布魯氏菌分為6個(gè)種19個(gè)型，即羊種3個(gè)型、牛種8個(gè)型、豬種5個(gè)型、犬種、綿羊附睪種和沙林鼠種，其中羊種、牛種和豬種對(duì)人均具有很強(qiáng)的致病性，尤其以羊種的致病力最強(qiáng)，約80%布魯氏菌病的感染是由羊種布魯氏菌引起。布魯氏菌在家畜和野生動(dòng)物中主要侵害生殖系統(tǒng)，在母畜中主要引起流產(chǎn)，公畜中主要引起睪丸炎和附睪炎，單側(cè)睪丸腫大，導(dǎo)致不育癥。人類主要通過(guò)飲用感染布魯氏菌病奶牛的生奶、油或直接接觸感染動(dòng)物和受污染的動(dòng)物產(chǎn)品而被感染。人感染布病表現(xiàn)為持續(xù)性感染、間歇性流感樣癥狀，稱作“波狀熱”。布魯氏菌病為世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）須通報(bào)的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病,根據(jù)全國(guó)法定傳染病疫情統(tǒng)計(jì)，2017年我國(guó)人感染布魯氏菌病例數(shù)為41241例。由于布魯氏菌是細(xì)胞內(nèi)寄生菌，人感染布病后往往難以治愈，因此給人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的危害。近年來(lái)，人感染布病數(shù)有上升的趨勢(shì)，因此加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物的監(jiān)測(cè)對(duì)布病的防控具有很重要的作用。

布病血清學(xué)檢測(cè)的方法主要有凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、熒光偏振分析技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)等，但各種檢測(cè)方法都存在著不同的缺點(diǎn)。近年來(lái)，熒光免疫層析技術(shù)在膠體金層析技術(shù)的基礎(chǔ)上得到了很大的發(fā)展，廣泛應(yīng)用于病原檢測(cè)的初篩和抗體水平的監(jiān)測(cè)。為了驗(yàn)證熒光免疫層析法檢測(cè)布魯氏菌病抗體的可行性，對(duì)該方法的特異性、敏感性、穩(wěn)定性進(jìn)行了驗(yàn)證，并對(duì)采集的臨床樣品進(jìn)行了檢測(cè)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品

豬血清20份采自屠宰場(chǎng)，牛血清20份采自活牛交易市場(chǎng)，羊血清20份采自養(yǎng)殖場(chǎng)，分離血清，-20℃保存。

1.2 試劑

布魯氏菌陽(yáng)性血清購(gòu)自青島立見(jiàn)診斷發(fā)展中心，批號(hào)為：20170503，試管凝集效價(jià)為1：800；O型口蹄疫陽(yáng)性血清、亞洲Ⅰ型口蹄疫陽(yáng)性血清、豬瘟陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。布魯氏菌病抗體熒光免疫層析試紙條由成都微瑞生物科技有限公司提供，批號(hào)：BRB18011618792。

1.3 儀器

WR-1608熒光檢測(cè)儀由成都微瑞生物科技有限公司提供。

1.4 方法

1.4.1 特異性試驗(yàn)

分別用樣品稀釋液1：10稀釋布魯氏菌陽(yáng)性血清、O型口蹄疫陽(yáng)性血清、亞洲Ⅰ型口蹄疫陽(yáng)性血清、豬瘟陽(yáng)性血清。分別加入稀釋的陽(yáng)性血清80μL到布魯氏菌病抗體熒光免疫層析試紙條孔中，并用稀釋液做空白對(duì)照，15min后，用熒光檢測(cè)儀讀取數(shù)值，結(jié)果判定以T/C值≤0.7判為陽(yáng)性，＞0.7判為陰性。

1.4.2 敏感性試驗(yàn)

用樣品稀釋液分別按 1：10、1：20、1：40、1：80、1：160、1：320、1：640稀釋布魯氏菌陽(yáng)性血清，用移液器吸80μL加入布魯氏菌病抗體熒光免疫層析試紙條上孔中，15min后，用熒光檢測(cè)儀讀取數(shù)值，結(jié)果判定以T/C值≤0.7判為陽(yáng)性，＞0.7判為陰性。

1.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

用樣品稀釋液1：40稀釋布魯氏菌陽(yáng)性血清，分別用移液器吸80μL加入布魯氏菌病抗體熒光免疫層析試紙條上孔中，15min后，用熒光檢測(cè)儀讀取數(shù)值。

1.4.4 臨床樣品檢測(cè)

用樣品稀釋液1：10稀釋待檢血清，用移液器吸80μL稀釋的血清加入到布魯氏菌病抗體熒光免疫層析試紙條上孔中，15min后，用熒光檢測(cè)儀讀取數(shù)值，結(jié)果判定以T/C值≤0.7判為陽(yáng)性，＞0.7判為陰性。同時(shí)，采用虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）對(duì)該批樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 特異性試驗(yàn)結(jié)果

采用布魯氏菌病抗體熒光免疫層析試紙條檢測(cè)不同陽(yáng)性血清，只有布魯氏菌陽(yáng)性血清為陽(yáng)性；O型口蹄疫陽(yáng)性血清、亞洲Ⅰ型口蹄疫陽(yáng)性血清、豬瘟陽(yáng)性血清均為陰性，詳細(xì)結(jié)果表1。結(jié)果表明，熒光免疫層析法特異性強(qiáng)，對(duì)O型口蹄疫陽(yáng)性血清、亞洲Ⅰ型口蹄疫陽(yáng)性血清、豬瘟陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)。

表1 熒光免疫層析法特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

布魯氏菌病抗體熒光免疫層析試紙條能檢測(cè)出到1：320倍稀釋的布魯氏菌病陽(yáng)性血清為陽(yáng)性，1：640倍稀釋以后的檢測(cè)結(jié)果為陰性，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，熒光免疫層析法能夠檢布魯氏菌病陽(yáng)性血清（試管凝集效價(jià)1：800）320倍的稀釋倍數(shù)。

表2 熒光免疫層析法敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

采用布魯氏菌病抗體熒光免疫層析試紙條檢測(cè)10次1：40稀釋的布魯氏菌陽(yáng)性血清，結(jié)果均為陽(yáng)性，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表3，變異系數(shù)（C.V）值為4.66%，差異不顯著。結(jié)果表明熒光免疫層析試紙條檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定。

2.4 臨床樣品的試驗(yàn)結(jié)果

采用布魯氏菌病抗體熒光免疫層析試紙條檢測(cè)豬血清20份、牛血清20份、羊血清20份，結(jié)果均為陰性，虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）檢測(cè)結(jié)果均為陰性，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

表3 熒光免疫層析法穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表4 部分臨床樣品布病抗體檢測(cè)結(jié)果

布魯氏菌病是重要的人畜共患病，屬于自然疫源性疾病，可以通過(guò)消化道（最為常見(jiàn)）、粘膜、呼吸道、皮膚等多種途徑感染。人類主要是通過(guò)接觸感染的家畜或受其污染的產(chǎn)品，食用消毒不完全的奶制品等途徑而感染布魯氏菌病。對(duì)布病的防控，加強(qiáng)動(dòng)物檢疫，開(kāi)展大規(guī)模的布魯氏菌病監(jiān)測(cè)顯得尤為重要。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，熒光免疫層析法檢測(cè)布病抗體，特異性強(qiáng)，可以檢出陽(yáng)性血清（試管凝集效價(jià)1：800）320倍的稀釋倍數(shù)，穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)便，可以在20min內(nèi)完成檢測(cè)，適合大規(guī)模布魯氏菌病抗體的監(jiān)測(cè)。

目前，布病抗體血清檢測(cè)的方法主要有虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、熒光偏振分析技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)等?；⒓t平板凝集試驗(yàn)是國(guó)標(biāo)規(guī)定的初篩方法，敏感性比較好，操作簡(jiǎn)便，試驗(yàn)時(shí)間短，價(jià)格便宜，但是存在假陽(yáng)性，受人為和環(huán)境的影響比較大，并且不能用血漿進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性的樣品需要進(jìn)一步確診。試管凝集試驗(yàn)特異性比較好，是我國(guó)的法定檢測(cè)方法，但是敏感性較差，而且部分感染動(dòng)物的抗體水平達(dá)不到檢測(cè)出限，容易造成漏檢，并且操作復(fù)雜，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，不利于大規(guī)模的監(jiān)測(cè)。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)是公認(rèn)布魯氏菌病抗體檢測(cè)最準(zhǔn)確的方法，但是該方法所需要的溶血素的制備困難，試驗(yàn)操作復(fù)雜，試驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，判定有一定的主觀性，而且補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)不適于豬布病抗體的檢測(cè)，我國(guó)較少采用該方法。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，特異性較好，可以一次完成大量樣品的監(jiān)測(cè)，但目前只有牛的布病抗體ELISA方法是國(guó)際貿(mào)易中指定的方法，ELISA檢測(cè)的成本也較高。熒光偏振分析技術(shù)是國(guó)際貿(mào)易中指定的檢測(cè)方法之一，敏感性和特異性良好，反應(yīng)時(shí)間短，與ELISA方法相比省去了洗板和孵育的時(shí)間，是布魯氏菌病抗體監(jiān)測(cè)的好方法，但需要配置較貴專用儀器，不適合基層推廣。膠體金免疫層析技術(shù)具有快速檢測(cè)的特點(diǎn)，不需要配置儀器，但需要通過(guò)肉眼判定結(jié)果，敏感度不夠高，存在假陽(yáng)性和假陰性。

此次試驗(yàn)的布魯氏菌病抗體熒光免疫層析法是一種競(jìng)爭(zhēng)法，采用高敏層析技術(shù)快速測(cè)定樣品中的布魯氏菌病抗體的含量，充分層析后經(jīng)熒光儀檢測(cè)，通過(guò)預(yù)置的標(biāo)準(zhǔn)曲線自動(dòng)計(jì)算出樣品中布魯氏菌病抗體的含量。該技術(shù)比膠體金免疫層析技術(shù)的靈敏度要提高100～1000倍，并且采用熒光儀讀數(shù)，避免了人為因素的干擾，為布病抗體監(jiān)測(cè)提供了一個(gè)新技術(shù)。此次試驗(yàn)采集臨床樣品數(shù)量和動(dòng)物種類較少，未能檢出布病抗體陽(yáng)性，這些樣品經(jīng)過(guò)虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果也為陰性，結(jié)果一致，實(shí)驗(yàn)室將采集更多的臨床樣品采用對(duì)該方法進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的適用性。

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