潘 杰，陳松春，王自強(qiáng)，莫鉆蘭，黃育浩

（1．東莞市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,廣東 東莞 523086；2．東莞市常平農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心,廣東 東莞 523086）

2013年3月31日首先在中國(guó)上海和安徽發(fā)現(xiàn)了3例人感染H7N9流感病例。自2016年以來(lái),H7N9流感病毒發(fā)生變異,從對(duì)家禽的低致病性變異為對(duì)家禽尤其是雞的高致病性,目前已報(bào)道發(fā)生H7N9流感疫情較多的是種雞場(chǎng)。為遏制H7N9流感疫情，2017年7月開始廣東率先試用H5+H7N9二價(jià)苗。為掌握H5+H7N9二價(jià)苗對(duì)種雞的保護(hù)效果和抗體水平消漲情況，對(duì)東莞市某種雞場(chǎng)在已有H5亞型禽流感免疫基礎(chǔ)上，開展H5+H7N9二價(jià)苗免疫試驗(yàn)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

來(lái)自東莞市某種雞場(chǎng)，選取同一批次30羽種雞為試驗(yàn)動(dòng)物，已免疫廣東永順生物制藥股份有限公司提供的重組禽流感病毒H5亞型三價(jià)滅活疫苗（H5N1,Re-6株 +Re-7株+Re-8株，批號(hào)：2017010）2次。翅靜脈采血，3500r/min離心15min分離獲得待檢血清，-20℃保存?zhèn)錂z。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 疫苗 由哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司提供的重組禽流感病毒（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1 株)，批號(hào)為 20180603。

1.2.2 1%雞紅細(xì)胞懸液 采集實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的3只禽流感和新城疫非免疫的健康公雞的血液與阿氏液等體積混合，用pH值7.2的0.01mol/L PBS液洗滌3次，每次以1000r/min離心10min，洗滌后用PBS液配成體積分?jǐn)?shù)1%雞紅細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 檢測(cè)試劑 抗體檢測(cè)試劑禽流感H5N1 Re-8株和H7N9 H7-Re1株抗原及陽(yáng)性血清，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.2.4 主要耗材和儀器 96孔“V”型反應(yīng)板，離心機(jī)，8道移液器，微量震蕩器。

1.3 方 法

1.3.1 試驗(yàn)步驟 對(duì)試驗(yàn)禽在免疫H5-H7N9二價(jià)苗前（0d即免疫當(dāng)天）采集血清樣品，檢測(cè)抗體水平，隨后對(duì)試驗(yàn)禽按0.5mL/羽進(jìn)行 H5-H7N9 二價(jià)苗一免。一免后 7、14、21、28、75d各采集一次血清樣品，而且21d采樣后當(dāng)天按0.5mL/羽進(jìn)行二次免疫。

1.3.2 檢測(cè)方法 按照《高致病性禽流感診斷技術(shù)》(GB/T18936-2003)規(guī)定的血凝與血凝抑制方法操作。以完全抑制4單位抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI的滴度。HI效價(jià)小于或等于31og2判陰性，HI效價(jià)大于或等于41og2判陽(yáng)性,判定為抗體合格。

表1 種雞免疫H5+H7N9二價(jià)苗后H5N1 Re-8株抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

表2 種雞免疫H5+H7N9二價(jià)苗后H7N9 H7-Re1株抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 H5N1 Re-8株抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

在已免疫H5亞型基礎(chǔ)上，該批雞只在注射H5+H7N9二價(jià)苗前的當(dāng)天（0d）、一免后 7d、14d、21d（21d 采樣后當(dāng)天內(nèi)進(jìn)行二免）、28d（二免后7d），抗體陽(yáng)性數(shù)均為30，抗體保護(hù)率均為100.00%，一免后75d（二免后54d），抗體陽(yáng)性數(shù)為26，抗體保護(hù)率為86.67%。14d到達(dá)峰值，隨后逐步下降，在二免后仍呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，整體抗體效價(jià)較高，即使在免疫后75d仍能維持較高的效價(jià)和100%的保護(hù)率。

2.2 H7N9 H7-Re1株抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

在免疫H5+H7N9二價(jià)苗前（0d）采樣檢測(cè)，抗體陽(yáng)性數(shù)為1，抗體保護(hù)率為3.45%，一免后7d，陽(yáng)性數(shù)為11，抗體保護(hù)率為36.67%，一免后14d，陽(yáng)性數(shù)為26，抗體保護(hù)率為89.66%，一免后21d（21d采樣后當(dāng)天內(nèi)進(jìn)行二免），陽(yáng)性數(shù)為24，陽(yáng)性率為85.71%，一免后28d（二免后7d），陽(yáng)性數(shù)為30，抗體保護(hù)率為100.00%，一免后75d（二免后54d），陽(yáng)性數(shù)為27，抗體保護(hù)率為90.00%。一免后呈現(xiàn)穩(wěn)步上升趨勢(shì)，并在21d開始出現(xiàn)回落，二免后繼續(xù)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，直至75d。

3 討論

3.1H7N9流感是一種近年來(lái)新報(bào)道有人感染的流感，傳染源主要是帶毒的家禽或家禽感染后通過糞便、唾液和鼻腔分泌物和糞便等排出的病毒，人主要是通過接觸染毒家禽或者被其污染的物品或環(huán)境引起感染。

3.2從本次試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，該H5+H7N9二價(jià)苗對(duì)群體H5N1 Re-8株抗體水平在一免、二免后能一直維持80%以上，H7N9 H7-Re1株抗體水平在一免14d后上升到80%以上，二免后7d達(dá)到峰值并能夠繼續(xù)上升，證明對(duì)兩種毒株均能夠起到良好的免疫效果，適用于大規(guī)模群體性集中免疫。

3.3對(duì)個(gè)體H7N9 H7-Re1株抗體水平比較穩(wěn)定，一免、二免后抗體水平均呈現(xiàn)穩(wěn)步上升趨勢(shì)，證明該疫苗在H7N9 H7-Re1株方面具有較高的免疫原性。

3.4相對(duì)而言，H5N1 Re-8株抗體水平不穩(wěn)定，主要是二免后抗體水平出現(xiàn)下降趨勢(shì)，一般來(lái)說，滅活疫苗在二免后應(yīng)該能夠進(jìn)一步引起免疫應(yīng)答，抗體水平應(yīng)該比一免要高，而且一免后抗體水平也屬于穩(wěn)步上升，H7N9 H7-Re1株也未出現(xiàn)類似情況，是否存在免疫抑制仍有待進(jìn)一步研究。

3.5免疫前（0d）出現(xiàn)1份樣品H7N9 H7-Re1株抗體滴度大于4log2，可能與實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)誤差有關(guān)。

3.6東莞市目前家禽存欄量約為60萬(wàn)羽，其中規(guī)模養(yǎng)殖家禽45萬(wàn)羽，未來(lái)在高致病性禽流感免疫方面，將對(duì)全部家禽使用H5+H7N9二價(jià)苗免疫，對(duì)水禽方面以H5N2 D7株為輔助，能夠保證存欄家禽對(duì)AIV病毒起到充足的抵御力。

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