徐席斌，劉晨濤

(1.咸陽(yáng)師范學(xué)院 體育學(xué)院,陜西 咸陽(yáng) 712000;2.西北大學(xué) 體育教研部，陜西 西安 710069)

目前老齡化社會(huì)的出現(xiàn),以及生活壓力增加、生活節(jié)奏加快使衰老的問(wèn)題備受關(guān)注,預(yù)防衰老和延緩衰老是近幾年生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)。衰老的發(fā)生發(fā)展過(guò)程與線粒體功能異常有關(guān)[1-2]。衰老的線粒體理論認(rèn)為,活性氧與細(xì)胞隨年齡的增長(zhǎng)而惡化有密切關(guān)系,而線粒體是活性氧的主要產(chǎn)生場(chǎng)所[3]。在研究衰老的預(yù)防和延緩中,藥物干預(yù)仍是主流,但其副作用和局限性共存。運(yùn)動(dòng)干預(yù)抗衰老因其經(jīng)濟(jì)性、安全性和對(duì)機(jī)體的積極作用,使得近年來(lái)隨著研究的不斷深入[4-6]。目前，對(duì)于運(yùn)動(dòng)改善心肌線粒體功能預(yù)防衰老的報(bào)道較少,本研究選擇抗阻力運(yùn)動(dòng)作為干預(yù)手段,觀測(cè)抗阻運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響,并探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

30只雄性SD大鼠,其中青年大鼠(2月齡,10只)和老年鼠(24月齡,20只),購(gòu)自西安交大醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心。將老年鼠隨機(jī)分為2組: 老年對(duì)照組(elderly control group, e-Ctrl,n=10)和老年抗阻力運(yùn)動(dòng)組(elderly resistance training group, e-RT,n=10)。青年鼠作為青年對(duì)照組(young control group, y-Ctrl,n=10)。各組大鼠每天自由攝食飲水。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

參照Bedford等[7]的方法進(jìn)行老年抗阻力負(fù)重跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。大鼠背部負(fù)重為自體重的30%,跑臺(tái)速度15m/min,無(wú)坡度。每次訓(xùn)練10min,間歇2min,每天6次,每周6天,共8周。

1.3 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

大鼠稱重麻醉后,采用RM6240多通道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)采集信號(hào)并記錄血流動(dòng)力學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)變化。

1.4 取 材

測(cè)試完血流動(dòng)力學(xué)后,立即處死取心臟,對(duì)心臟稱量并計(jì)算心系數(shù)。

1.5 H&E染色

將在4%(體積分?jǐn)?shù))中性甲醛固定液中固定的心臟組織取出,切取需要觀察部位后,依次通過(guò)濃度梯度為 70%,80%,90%,95%,100%Ⅰ,100%Ⅱ的酒精進(jìn)行脫水,脫水完成后,經(jīng)氯仿透明 8h后,置于石蠟中脫氯仿,最后經(jīng)石蠟包埋。石蠟經(jīng)5μm切片后,用二甲苯及酒精脫蠟脫水,蘇木精染色8min,伊紅復(fù)染 5min,樹(shù)膠封片。光鏡下進(jìn)行觀察,拍片。

1.6 Masson染色

石蠟切片用Masson復(fù)合染色液染色5min,經(jīng)0.2%(體積分?jǐn)?shù))醋酸水溶液稍洗后置于5%(體積分?jǐn)?shù))磷鎢酸10min,洗滌2次,苯胺藍(lán)浸染5min,洗滌2次后脫水透明封片,光鏡下進(jìn)行觀察,拍片。

1.7 超微結(jié)構(gòu)觀察

在低溫下切取左心室肌組織,迅速固定。經(jīng)梯度漂洗、脫水后用Epon812包埋,進(jìn)行超薄50～60nm切片,醋酸鈾檸檬酸鉛雙染,日立 H-7650透射電鏡觀察,拍攝。

1.8 Western Blot

采用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)心肌組織實(shí)施總蛋白濃度測(cè)定。將定量后的總蛋白用10%(體積分?jǐn)?shù))SDS-PAGE分離,NC膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,3%(體積分?jǐn)?shù))BSA封閉45min,孵育一抗Anti-PGC1 alpha 抗體(1∶1 000),Anti-SIRT1抗體(1∶800), Anti-AMPK alpha 1(1∶600),Anti-AMPK alpha 2(1∶1 000),24℃過(guò)夜。復(fù)溫1h后TBST洗膜3次, 3min/次。用山羊抗兔的二抗(1∶10 000)室溫?fù)u床孵育1h,TBST洗膜3次, 3min/次,ECL發(fā)光。GAPDH(1∶5 000)作為內(nèi)參。用Quantity One4.62軟件分析并計(jì)算蛋白表達(dá)量變化。

1.9 圖像處理、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(x±SD)表示用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。采用 GraphPad Prism 6.0軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 抗阻力運(yùn)動(dòng)提高衰老的心功能

結(jié)果顯示,與e-Ctrl組相比,抗阻力運(yùn)動(dòng)顯著提高了老年鼠的心功能(P<0.01)。與y-Ctrl組相比,老年鼠的LVSP(P<0.01),LVEDP(P<0.01),+dp/dtmax(P<0.01),-dp/dtmax(P<0.01)等血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)都顯著增加。而與e-Ctrl組相比,抗阻力運(yùn)動(dòng)降低了老年鼠的LVSP(P<0.05),LVEDP(P<0.01),+dp/dtmax(P<0.05),-dp/dtmax(P<0.05)等血流動(dòng)力學(xué)參數(shù),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)表1)。

表1 抗阻力運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老心功能的影響Tab.1 The effect of resistance training on aged cardiac function

*P<0.05 與y-Ctrl組比較;**P<0.01 與y-Ctrl組比較;#P<0.05 與e-Ctrl組比較;##P<0.01 與e-Ctrl組比較。

2.2 抗阻力運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老的心肌組織結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)心肌纖維的結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn),y-Ctrl組大鼠心肌纖維呈整齊排列,心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整且分布比較緊密(圖1a)。而e-Ctrl組大鼠的心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變,心肌細(xì)胞斷裂,排列雜亂無(wú)章,且心肌細(xì)胞分布比較稀疏(圖1b)。老年組大鼠經(jīng)抗阻力運(yùn)動(dòng)后,顯示心肌纖維排列較為整齊且分布較為緊密,體積也稍有增大(圖1c)。心肌組織Masson染色結(jié)果顯示,y-Ctrl組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)完整,心肌細(xì)胞與膠原纖維交互分布(圖1d)。而e-Ctrl組大鼠心肌組織發(fā)生損傷,結(jié)構(gòu)遭受破壞,大量心肌細(xì)胞壞死,增加的膠原纖維呈條索狀,分別包繞心肌束、部分膠原纖維融合呈深藍(lán)色,表明了膠原纖維過(guò)度增生(圖1e)。e-RT組大鼠心肌細(xì)胞明顯增多,膠原纖維顯著減少,表明抗阻力運(yùn)動(dòng)可改善衰老的心肌組織的結(jié)構(gòu)(圖1f)。

a-c: H&E染色結(jié)果,蘇木素復(fù)染后細(xì)胞核呈紫色,伊紅染后細(xì)胞質(zhì)為紅色。d-f: Masson染色結(jié)果,膠原纖維由苯胺藍(lán)染膠原纖維變?yōu)樗{(lán)色,麗春紅染心肌纖維為紅色。a和d表示y-Ctrl組,b和e表示e-Ctrl組,c和f表示e-RT組?！?00 圖1 抗阻力運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老的心肌組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 The effect of resistance training on aged myocardial structure

2.3 抗阻力運(yùn)動(dòng)重塑衰老的心肌線粒體結(jié)構(gòu)

電鏡下,y-Ctrl組大鼠心肌細(xì)胞具有正常的超微結(jié)構(gòu),閏盤(pán)結(jié)構(gòu)規(guī)則無(wú)擴(kuò)張現(xiàn)象,肌節(jié)明暗帶清晰可見(jiàn),線粒體形態(tài)呈帶狀排列,嵴清晰,細(xì)胞膜形態(tài)結(jié)構(gòu)良好(圖2a)。而e-Ctrl組大鼠的心肌細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷,閏盤(pán)呈不規(guī)則排列且有擴(kuò)張現(xiàn)象,肌節(jié)不完整,Z線的排列也出現(xiàn)不規(guī)則,線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞,嵴消失,空泡樣形狀增多,細(xì)胞膜也有損傷現(xiàn)象(圖2b)。e-RT組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)屬于基本正常,肌節(jié)也整齊排列,Z線規(guī)則,閏盤(pán)基本規(guī)則無(wú)擴(kuò)張,線粒體數(shù)量增多,嵴清晰可見(jiàn)(圖2c)。

a y-Ctrl組,b e-Ctrl組,c e-RT組?！?0000 圖2 抗阻力運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老的心肌超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 The effect of resistance training on aged myocardial ultrastructure

2.4 抗阻力運(yùn)動(dòng)重塑衰老的心肌線粒體功能

與y-Ctrl組相比,e-Ctrl組PGC1α的表達(dá)顯著下降(P<0.01)?？棺枇顒?dòng)可以明顯提高衰老誘導(dǎo)的PGC1α表達(dá)的降低(圖3a,P<0.05)。與y-Ctrl組相比,e-Ctrl組SIRT1的表達(dá)顯著下降(P<0.01)。則抗阻力活動(dòng)也可明顯提高衰老誘導(dǎo)的SIRT1表達(dá)的降低(圖3b,P<0.01)。與y-Ctrl組相比,e-Ctrl組AMPKα1的表達(dá)顯著下降(P<0.01)。e-RT組AMPKα1的表達(dá)也顯著提高(圖3c,P<0.01)。衰老誘導(dǎo)AMPKα2的表達(dá)顯著降低(P<0.01),而抗阻力運(yùn)動(dòng)可以顯著緩解衰老誘導(dǎo)的AMPKα2表達(dá)的降低(圖3d,P<0.01)。

**P<0.01 與y-Ctrl組比較;#P<0.05 與e-Ctrl組比較;##P<0.01 與e-Ctrl組比較 圖3 抗阻力運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老的心肌線粒體功能的影響Fig.3 The effect of resistance training on aged myocardial mitochondrial function

3 討 論

隨著年齡增長(zhǎng),機(jī)體機(jī)能逐漸下降,主要表現(xiàn)為進(jìn)行性衰老過(guò)程,心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化,導(dǎo)致射血功能降低,血管也發(fā)生退行性變化[8-10]。研究表明,有氧運(yùn)動(dòng)可以降低老年大鼠的收縮壓,但并不能低至青年大鼠的收縮壓狀態(tài)[11]?？棺枇\(yùn)動(dòng)不僅可以提高老年大鼠的心系數(shù),而且降低老年大鼠的收縮壓和舒張壓。這可能與抗阻力運(yùn)動(dòng)降低老年大鼠心肌的膠原纖維沉積有密切的關(guān)系。膠原和淀粉樣蛋白的沉積,會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化樣斑塊,舒縮功能障礙,血管的順應(yīng)性下降[11]。本研究的心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察也表明,老年大鼠的心肌細(xì)胞大量壞死嚴(yán)重,分布稀疏,且被大量的膠原纖維包裹。導(dǎo)致心功能下降。而8周的抗阻力運(yùn)動(dòng)改善心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu),緩解其大量壞死的狀態(tài),且膠原纖維的含量也被降低。長(zhǎng)期的抗阻力運(yùn)動(dòng)可以使心血管系統(tǒng)產(chǎn)生變化;提高心肌收縮能力,增強(qiáng)泵血功能。

心肌線粒體的超微結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位會(huì)隨著年齡的增加發(fā)生顯著的改變。衰老的心肌線粒體出現(xiàn)形態(tài)的擴(kuò)大且變圓,基質(zhì)空泡化,嵴變短甚至消失,而抗阻力運(yùn)動(dòng)可以改善這種由于衰老引起的心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的異常。其可能與抗阻力運(yùn)動(dòng)可以使心肌更快速地排出衰老誘導(dǎo)的有害代謝產(chǎn)物的累積,保護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)。

PGC1α是線粒體適應(yīng)運(yùn)動(dòng)的一個(gè)重要調(diào)控蛋白,其不僅促進(jìn)新線粒體的形成,還可以維持線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)[12]。對(duì)22月齡小鼠的研究發(fā)現(xiàn),PGC1α的過(guò)表達(dá)能夠減輕骨骼肌線粒體功能紊亂[13]。此外,PGC1α敲除小鼠的未折疊蛋白反應(yīng)機(jī)制損害[14],表明通過(guò)PGC1α可以修復(fù)或者移除受損的的線粒體蛋白[15]。因此,PGC1α不僅可以通過(guò)促進(jìn)新線粒體蛋白的合成,還可以通過(guò)維持線粒體蛋白對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)來(lái)調(diào)控線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)。本研究表明,抗阻力運(yùn)動(dòng)可以提高老年大鼠心肌中PGC1α的表達(dá),表示抗阻力運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)PGC1α維持老年大鼠心肌線粒體蛋白的穩(wěn)態(tài)。SIRT1是Sirtuins家族成員之一,SIRT1的組蛋白去乙?；傅募せ羁梢源龠M(jìn)多種基因的表達(dá),減輕衰老誘導(dǎo)的代謝紊亂[16]。長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)動(dòng)可以增加SIRT1的表達(dá),并且消除年輕人和老年人之間SIRT1表達(dá)的差異[17]。與我們的研究一致,抗阻力運(yùn)動(dòng)提高老年大鼠心肌SIRT1的表達(dá),使其與青年大鼠心肌SIRT1的表達(dá)幾乎一致。AMPK可以提高線粒體的生物合成,以此增加能量的產(chǎn)生,而失活的AMPK導(dǎo)致老年大鼠的線粒體含量降低[18]。隨著年齡的增長(zhǎng),AMPK對(duì)運(yùn)動(dòng)等刺激的反映逐漸遲鈍。有研究表明,經(jīng)過(guò)5天的有氧運(yùn)動(dòng),AMPK的活性在老年大鼠中依舊保持較低狀態(tài)[19]。因此,這樣遲鈍的信號(hào)在老年大鼠中可能會(huì)限制線粒體蛋白的合成,并且導(dǎo)致有害的線粒體蛋白的累積。而本研究中表明,抗阻力運(yùn)動(dòng)可提高老年大鼠心肌AMPK的表達(dá)。其原因可能是長(zhǎng)期抗阻力運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生適應(yīng)性,從而導(dǎo)致AMPK的表達(dá)增加。研究表明,SIRT1與PGC1α共定位于線粒體[20],似乎是AMPK的下游,并且協(xié)調(diào)AMPK的活性[21]。因此,抗阻力運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)AMPK/PGC1α/SIRT1信號(hào)通路改善老年大鼠的心肌線粒體功能。而進(jìn)一步詳細(xì)的機(jī)制有待下一步探索。

綜上所述,長(zhǎng)期抗阻力運(yùn)動(dòng)可以改善衰老的心功能,降低老年大鼠的收縮壓和舒張壓,保護(hù)心肌以及心肌線粒體結(jié)構(gòu)的完整性,可能通過(guò)AMPK/PGC1α/SIRT1信號(hào)通路改善老年大鼠的心肌線粒體功能?？棺枇\(yùn)動(dòng)可作為老年人預(yù)防和延緩衰老的一種經(jīng)濟(jì)安全的方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] GUO X H. Antiaging effects of melatonin on the myocardial mitochondria of rats and associated mechanisms[J]. Mol Med Rep, 2017,15(1):403-410.

[2] GREDILLA R V, BOHR A,STEVNSNER T.Mitochondrial DNA repair and association with aging-an update[J].Exp Gerontol,2010，45(7-8):478-488.

[3] ALEXEYEV M F. Is there more to aging than mitochondrial DNA and reactive oxygen species[J].FEBS J, 2009，276(20):5768-5787.

[4] GLIEMANN L, NYBERG M, HELLSTEN Y.Effects of exercise training and resveratrol on vascular health in aging[J].Free Radic Biol Med, 2016，98:165-176.

[5] MEIRELES L C. Treadmill exercise induces selective changes in hippocampal histone acetylation during the aging process in rats[J]. Neurosci Lett, 2016，634:19-24.

[6] PETERSON C M, JOHANNSEN D L, RAVUSSIN E. Skeletal muscle mitochondria and aging: A review[J].J Aging Res, 2012. 2012:194821.

[7] BEDFORD T G. Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures[J].Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol, 1979，47(6):1278-1283.

[8] MARUYAMA Y. Aging and arterial-cardiac interactions in the elderly[J]. Int J Cardiol, 2012，155(1):14-19.

[9] IRIGOYEN M C. Aging and baroreflex control of RSNA and heart rate in rats[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2000，279(5):R1865-1871.

[10] FRANKLIN S S. Hemodynamic patterns of age-related changes in blood pressure[J]. The Framingham Heart Study. Circulation, 1997，96(1):308-315.

[11] 劉曉東，石麗君，王德剛.運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老大鼠心血管功能和腸系膜動(dòng)脈反應(yīng)性的影響[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志,2013,32(4):316-322.

[12] ROGERS M A. Decline in VO2max with aging in master athletes and sedentary men[J].Appl Physiol (1985), 1990，68(5):2195-2199.

[13] WENZ T. Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009，106(48):20405-20410.

[14] WU J. The unfolded protein response mediates adaptation to exercise in skeletal muscle through a PGC-1alpha/ATF6alpha complex[J]. Cell Metab, 2011，13(2):160-169.

[15] BAKER B M, HAYNES C M.Mitochondrial protein quality control during biogenesis and aging[J]. Trends Biochem Sci, 2011，36(5):254-261.

[16] YOSHINO J. Nicotinamide mononucleotide, a key NAD(+) intermediate, treats the pathophysiology of diet-and age-induced diabetes in mice[J]. Cell Metab, 2011，14(4):528-536.

[17] LANZA I R. Endurance exercise as a countermeasure for aging[J]. Diabetes, 2008，57(11):2933-2942.

[18] LEE H Y. Targeted expression of catalase to mitochondria prevents age-associated reductions in mitochondrial function and insulin resistance[J]. Cell Metab, 2010，12(6):668-674.

[19] REZNICK R M. Aging-associated reductions in AMP-activated protein kinase activity and mitochondrial biogenesis[J].Cell Metab, 2007，5(2):151-156.

[20] AQUILANO K. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma co-activator 1alpha (PGC-1alpha) and sirtuin 1 (SIRT1) reside in mitochondria: possible direct function in mitochondrial biogenesis[J].Biol Chem, 2010，285(28):21590-21599.

[21] CANTO C. Interdependence of AMPK and SIRT1 for metabolic adaptation to fasting and exercise in skeletal muscle[J].Cell Metab, 2010，11(3):213-219.