萬(wàn)岷金相廷張幸 黃俊 陳桂林 夏紅枝 李東洋 盧振剛 劉希娥

股骨頭缺血性壞死臨床十分常見，常用治療方法包括早期自體腓骨打壓植骨等保頭治療和晚期金屬假體置換。早期的各種保頭療法效果并不確定，我們認(rèn)為其原因在于無(wú)法解決壞死區(qū)域的再血管化問(wèn)題。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）屬于多功能干細(xì)胞，具有多項(xiàng)分化潛能，在不同誘導(dǎo)條件下可分化為骨、內(nèi)皮、脂肪、肌肉、韌帶等多種組織細(xì)胞，可作為種子細(xì)胞用于修復(fù)損傷的組織器官[1-3]。有學(xué)者研究證實(shí)促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）可以促進(jìn)hMSCs增殖并向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，促進(jìn)血管的形成[4-6]。本研究旨在觀察hMSCs與同種異體骨材料共培養(yǎng)細(xì)胞增殖情況及在EPO誘導(dǎo)下干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的情況，以期為股骨頭缺血壞死的早期治療探索一種新的治療方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料來(lái)源

同種異體骨材料（北京大清生物），凍存人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human mesenchymalstem cells,hMSCs,廣州賽業(yè)生物）。

1.1.2 主要試劑和儀器

Cell Counting Kit-8試劑（日本Dojindo公司），hMSC完全培養(yǎng)基（廣州賽業(yè)生物），離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司），離心管，恒溫水浴箱（上海恒一公司），細(xì)胞培養(yǎng)瓶，細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），移液器（德國(guó)Eppendrof公司），PBS（武漢博士德），0.25%胰酶（美國(guó)ThermoFisher公司），促紅細(xì)胞生成素（EPO，美國(guó) Peprotech公司），4%多聚甲醛（武漢博士德），兔抗 von willebrand factor(VWF)多克隆抗體（美國(guó) Santacruz公司），兔抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF)多克隆抗體（美國(guó)CST公司），兔抗血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子（Platelet endothelial cell adhesion molecule 1，PECAM-1）多克隆抗體（美國(guó) Santacruz公司），熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG（北京中杉金橋公司），熒光顯微鏡（日本Olympus公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司），細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖率測(cè)定

取凍存hMSCs一支，放入37℃水浴箱中解凍，800 rpm，室溫下離心5 min，吸取上清液，加入1 mL新鮮hMSC完全培養(yǎng)基，吹散細(xì)胞沉淀，移入25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入2 mL培養(yǎng)基，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。第二天復(fù)蘇細(xì)胞換液，其后每2～3天換液，待細(xì)胞融合率達(dá)90%，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞用0.25%胰酶消化，用新鮮培養(yǎng)基制成10000個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。將骨材料反復(fù)雙蒸水沖洗浸泡后切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小，放入96孔板中。將細(xì)胞懸液加入孔中，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。96孔板中以添加骨材料者為實(shí)驗(yàn)組，未添加者為對(duì)照組，每組8孔。接種細(xì)胞1，2，3，4天后，將CCK-8(CellCounting Kit-8)用培養(yǎng)基1∶10稀釋備用，吸去孔中舊培養(yǎng)基，每孔中加入100 uL稀釋好的CCK-8，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，每孔吸出90 uL至新的96孔板中，用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm波長(zhǎng)吸光度值（OD值），測(cè)得的OD值（A450 nm）與細(xì)胞增殖數(shù)成正比。每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)各組均取5孔測(cè)量并計(jì)算增殖率。

hMSCs增殖率=（各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞總數(shù)－首日接種存活細(xì)胞數(shù)）/首日接種存活細(xì)胞數(shù)×100%

1.2.2 誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)

材料組（A組）將同種異體骨材料反復(fù)雙蒸水沖洗浸泡后切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小，放入15 mL離心管中。將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞用0.25%胰酶消化，用新鮮培養(yǎng)基制成10000個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，用移液器吸取400uL細(xì)胞懸液，加入骨材料中，放入 37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。12 h后待細(xì)胞貼壁，每個(gè)離心管中分別加入1 mL正常培養(yǎng)基和1 mL含EPO濃度為1ng/mL的培養(yǎng)基，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。非材料組（B組）離心管中不加入骨材料，其余同A組。非誘導(dǎo)組（C組）離心管中加入骨材料，但不加入EPO，其余同A組。各組每3天換液一次，連續(xù)60天。將各離心管中細(xì)胞用0.25%胰酶消化，用新鮮培養(yǎng)基制成1000個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液滴入預(yù)先準(zhǔn)備好的細(xì)胞爬片上，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。2天后細(xì)胞已在爬片上完全伸展，吸取培養(yǎng)基，用 PBS漂洗一次，加入4℃預(yù)冷的4%多聚甲醛固定。各組均制作24張爬片。對(duì)PECAM-1、VEGF、VWF三種標(biāo)記物進(jìn)行免疫熒光染色，每種標(biāo)記物每組抽取8張爬片染色，于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3 圖像軟件分析

應(yīng)用ImageJ1.51k圖像分析軟件（NationalInstitutesofHealh,USA）進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量評(píng)估。每張爬片均隨機(jī)抽取一張視野照片，應(yīng)用軟件測(cè)量視野中細(xì)胞個(gè)數(shù)，并除以測(cè)量面積，從而得到相對(duì)細(xì)胞密度值，用以估算各組所觀察細(xì)胞數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，資料數(shù)據(jù)以（±s）表示。增殖率各時(shí)間點(diǎn)兩組間比較采用配對(duì)樣本 檢驗(yàn)，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)各組間比較采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)資料的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 移植后干細(xì)胞增殖率

干細(xì)胞移植后2～4天，可見兩組hMSCs細(xì)胞增殖數(shù)量均隨培養(yǎng)時(shí)間逐漸增加，第4天，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組增殖率分別為（486.74±33.84）%，（489.47±59.34）%。各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞增殖率無(wú)明顯差異（值均＞0.05，見圖1）。說(shuō)明同種異體骨材料與hMSCs共培養(yǎng)條件下，同種異體骨材料對(duì)hMSCs增殖無(wú)明顯影響。

圖1，兩組孔板接種hMSCs細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖率比較。

2.2 EPO誘導(dǎo)干細(xì)胞情況

2.2.1 免疫熒光染色觀察

熒光顯微鏡下觀察可見C組三種標(biāo)記物均無(wú)明顯表達(dá)，A組及B組血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物PECAM-1、VEGF、VWF熒光染色均有表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)出高亮紅色熒光。且A組、B組熒光表達(dá)情況與C組對(duì)比差異明顯（見圖2-4）。說(shuō)明在hMSCs與同種異體骨材料共培養(yǎng)情況下，EPO對(duì)hMSCs仍有明顯的成血管誘導(dǎo)作用，而單獨(dú)應(yīng)用同種異體骨材料并不能顯著促使hMSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化。

圖2，免疫熒光染色PECAM-1表達(dá)情況（彩圖見插頁(yè)）。

圖3，免疫熒光染色VWF表達(dá)情況（彩圖見插頁(yè)）。

圖4，免疫熒光染色VEGF表達(dá)情況（彩圖見插頁(yè)）。

2.2.2 圖像分析軟件分析結(jié)果

ImageJ圖像分析軟件進(jìn)行熒光染色粒子計(jì)數(shù)。A組PECAM-1、VEGF、VWF三種血管內(nèi)皮標(biāo)記物陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（分別為 174.13±28.02/mm2，487.38±43.09/mm2，375.25±44.12/mm2）均明顯高于C 組（分別為 44.50±18.81/mm2，63.13±18.90/mm2，41.62±10.06/mm2，均＜0.01），但A組與B組間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均＞0.05，見圖5）。說(shuō)明同種異體骨材料對(duì)于EPO的誘導(dǎo)hMSCs成血管作用無(wú)明顯影響。

圖5，血管內(nèi)皮標(biāo)記物表達(dá)情況。

3 討論

我國(guó)已進(jìn)入老齡化社會(huì)，臨床上股骨頭缺血壞死的發(fā)生率也逐年增高。股骨頭缺血壞死可以造成髖關(guān)節(jié)疼痛并影響髖關(guān)節(jié)的活動(dòng)功能，可導(dǎo)致股骨頭塌陷并形成骨性關(guān)節(jié)炎[7-9]。目前股骨頭壞死的具體發(fā)病機(jī)制仍不十分明確，但目前普遍認(rèn)為與多種因素引起的股骨頭血供障礙密切相關(guān)[10,11]。研究表明股骨頭髓芯鉆孔減壓聯(lián)合自體骨髓細(xì)胞注射移植治療早期股骨頭缺血壞死與單獨(dú)鉆孔減壓相比可以提高治療髖關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)障礙等方面的效果[12,13]。這可能與hMSCs的成血管效應(yīng)最終促進(jìn)了局部循環(huán)的改善有關(guān)。EPO一般情況下由腎臟的腎小管旁細(xì)胞分泌，可促進(jìn)紅細(xì)胞的增殖，EPO還可促進(jìn)hMSCs增殖，并促進(jìn)hMSCs向血管內(nèi)皮分化，引導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞歸巢，促進(jìn)血管形成。同時(shí)有研究表明 EPO還可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)并可抑制成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞的凋亡[14]。臨床治療過(guò)程中發(fā)現(xiàn)植入干細(xì)胞需要良好的支架，否則無(wú)法解決細(xì)胞在植入?yún)^(qū)的定植及分化，同種異體骨經(jīng)過(guò)醫(yī)學(xué)處理后排異性最小，其松質(zhì)骨的孔洞也有利于細(xì)胞附著及新生組織長(zhǎng)入，因此，如果能夠在股骨頭缺血壞死的早期手術(shù)清除壞死骨組織，植入復(fù)合hMSCs的同種異體骨材料，并通過(guò) EPO誘導(dǎo)使 hMSCs向血管內(nèi)皮遷延、分化，促使血管形成，勢(shì)必可以改善骨壞死、骨缺損的局部血液循環(huán)，增加營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，從而提高疾病的治療效果。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，對(duì)血管的發(fā)生形成起著至關(guān)重要的作用[15]。血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子（PECAM-1)又稱CD31，是一種內(nèi)皮細(xì)胞連接分子，廣泛分布于血管細(xì)胞[16]。血管性血友病因子(VWF)是由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，有著重要的止血作用，可促進(jìn)血小板的粘附和聚集，并可與凝血因子Ⅷ結(jié)合起到穩(wěn)定因子Ⅷ的作用[17]。相關(guān)研究中也常將PECAM-1、VWF作為血管內(nèi)皮標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將hMSCs與同種異體骨材料體外共培養(yǎng)，結(jié)果顯示hMSCs的增殖情況良好，說(shuō)明同種異體骨材料不會(huì)影響hMSCs的正常存活及增殖。在hMSCs與同種異體骨材料體外共培養(yǎng)條件下通過(guò)加入EPO誘導(dǎo)，對(duì)PECAM-1、VWF、VEGF三種標(biāo)記物進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示此三種標(biāo)記物表達(dá)情況良好，說(shuō)明EPO對(duì)hMSCs仍有明顯的成血管誘導(dǎo)作用。但是本研究也存在一定的局限性，雖然觀察到有多種血管標(biāo)記物的表達(dá)，但是復(fù)合材料是否可在生物體內(nèi)確實(shí)促進(jìn)血管形成仍需相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。hMSCs可以在同種異體骨材料中正常存活、增殖，并在EPO誘導(dǎo)下向血管內(nèi)皮細(xì)胞方向分化，這為骨壞死、骨缺損等疾病的治療材料選擇提供了一個(gè)新的研究方向。但是如何將hMSCs與同種異體骨材料更好的復(fù)合實(shí)用化、更好的加以成血管誘導(dǎo)、促進(jìn)細(xì)胞增殖，仍需進(jìn)一步探索、研究。

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