袁 敏，張啟來，霍永青

(1.天津市環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院，天津 300191；2.天津市武清區(qū)環(huán)境保護(hù)監(jiān)測(cè)站，天津 301700；3.天津市聯(lián)合環(huán)保工程設(shè)計(jì)有限公司，天津 300191)

0 引 言

隨著世界人口的持續(xù)增加和經(jīng)濟(jì)發(fā)展，某些地區(qū)生態(tài)環(huán)境正在不斷惡化，在這種形勢(shì)下，土壤質(zhì)量受到人們的普遍關(guān)注[1]。目前，我國(guó)現(xiàn)有煤矸石山1 500多座，侵占土地約1.5×104km2，造成土地資源的浪費(fèi)，煤矸石是我國(guó)產(chǎn)出量最大的工業(yè)固體廢棄物之一[2-3]。煤礦中含有的多種非中性物質(zhì)以及微量重金屬等，通過淋溶、揚(yáng)塵等方式進(jìn)入土壤，再通過徑流、滲透等方式在土壤中擴(kuò)散，造成一定區(qū)域內(nèi)土壤酸、堿性的明顯改變，打破了土壤中重金屬的本底值和平衡關(guān)系，破壞植被適宜生長(zhǎng)的環(huán)境，造成大量植物枯死，短期內(nèi)很難恢復(fù)[4-6]。為了消除污染，自20世紀(jì)60年代起，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者就煤矸石的污染問題展開了相關(guān)研究工作，探索煤矸石處理和利用的新方法[7-13]。

單家村煤礦是山東裕隆礦業(yè)集團(tuán)有限公司的發(fā)源地和經(jīng)濟(jì)支柱企業(yè)，位于山東省曲阜市時(shí)莊鎮(zhèn)境內(nèi)，礦井南臨327國(guó)道1 km，東距曲阜市14 km，井田面積6.3 km2，煤質(zhì)為低灰、低磷、特低硫2號(hào)氣煤。單家村煤礦自二十世紀(jì)七八十年代開始建設(shè)以來，煤矸石山堆積超過30年。煤矸石除含有粉塵、SiO2、A12O3、Fe、Mn等常量元素外，還有其他微量重金屬元素，如Pb、Sn、As、Cr等，這些元素為有毒重金屬元素。當(dāng)露天堆放的煤矸石山經(jīng)雨水淋蝕后，產(chǎn)生酸性水，污染周圍的土地和水體(因當(dāng)時(shí)考慮的是監(jiān)測(cè)周邊土壤污染狀況，所以煤矸石具體成分含量沒有分析)。

土壤微生物活性能夠簡(jiǎn)單快速的鑒別出土壤質(zhì)量的好壞，而土壤中重金屬含量對(duì)土壤微生物影響較大[14]。重金屬的污染均能降低細(xì)菌、真菌等的數(shù)量，能夠改變土壤微生物的新陳代謝[15-18]。重金屬污染在一定程度上也影響土壤生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)[19]。有學(xué)者研究表明六價(jià)鉻污染對(duì)不同的土壤生化作用有不同的效應(yīng)[20]。研究土壤微生物活性與重金屬含量的關(guān)系對(duì)于揭示地區(qū)土壤污染狀況和修復(fù)土壤重金屬污染具有重要意義。

本試驗(yàn)從微生物活性角度入手，分析煤矸石堆造成土壤重金屬污染的生物機(jī)制。實(shí)驗(yàn)采用原子吸收分光光度法測(cè)定距離矸石堆不同距離中土壤重金屬(Cr6+、Pb、Hg等)的含量，確定土壤污染程度；通過微生物培養(yǎng)確定周圍土壤中三種常見微生物(細(xì)菌、放線菌和霉菌)的活性，探討煤矸石堆對(duì)周圍土壤中微生物活性產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集

土樣采自曲阜市單家村裕隆煤礦煤矸石堆附近，以煤矸石堆為中心，分別在距矸石堆0 m、10 m、50 m、80 m、125 m的圓周上采樣(圖1)。每個(gè)圓周均設(shè)10個(gè)采樣點(diǎn)，采樣深度為土壤表層0～20 cm。取回土樣，將同距離、不同方位采樣點(diǎn)處的樣品混合，將土塊壓碎，除去石塊、植物殘根等雜物，將土壤鋪成薄層，在陰涼處自然風(fēng)干。風(fēng)干后的土樣用陶瓷研碎后，過篩(篩孔直徑2 mm)，除去2 mm以上的砂礫和植物殘根，用四分法反復(fù)多次棄去多余樣品，用瑪瑙研缽繼續(xù)研細(xì)，然后過-0.025 mm篩，充分混勻后備用[21]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重金屬含量的測(cè)定

土壤樣品采用硝酸-鹽酸-高氯酸分解體系法分解。稱取0.5 g(準(zhǔn)確到0.1 mg)風(fēng)干土樣于50 mL燒杯中，再用少量去離子水濕潤(rùn)，加硝基鹽酸5 mL，加熱保持微沸至有機(jī)物劇烈反應(yīng)后，加高氯酸1 mL繼續(xù)加熱至樣品分解呈灰白色，再用0.12 mol/L的硝酸溶解。待溶液冷卻后用50 mL容量瓶定容，再過濾一兩次，得澄清透明溶液，轉(zhuǎn)移至聚乙烯塑料瓶中保存待測(cè)。

取適量土壤消解液，用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)量其中的重金屬(Cr6+、Pb、Hg等)含量[22]，與土壤背景值對(duì)照。

1.2.2 土壤微生物(細(xì)菌、放線菌、霉菌)的培養(yǎng)

土壤微生物(細(xì)菌、放線菌、霉菌)的培養(yǎng)與分離見表1[23]。

圖1 采樣點(diǎn)分布

樣品來源分離對(duì)象分離方法稀釋度培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度/℃培養(yǎng)時(shí)間/d土樣細(xì)菌稀釋分離10-6牛肉膏蛋白胨30～371～2土樣放線菌稀釋分離10-3高氏一號(hào)285～7土樣霉菌稀釋分離10-3馬丁氏28～303～5

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣品理化性質(zhì)

根據(jù)土樣的采集情況和相關(guān)文獻(xiàn)，土壤樣品的理化性質(zhì)具體包括土壤的pH值、含水率、土壤有機(jī)質(zhì)、陽(yáng)離子交換量、重金屬總量、重金屬有效態(tài)等，具體見表2。

在研究重金屬對(duì)土壤微生物生長(zhǎng)代謝的過程中，對(duì)其起主要影響作用的是重金屬的有效態(tài)形式，因此以重金屬有效態(tài)為研究對(duì)象。

2.2 土壤重金屬有效態(tài)量隨距離變化分析

從圖2可以看出，土壤中重金屬汞的有效態(tài)含量隨距離煤矸石山距離的增大先下降較為迅速，從50 m以后下降緩慢。w(Hg)的最高值達(dá)到1.08 mg/kg。用GB15618—1995中土壤二級(jí)環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)值(Hg≤0.3 mg/kg)作為參照值，可發(fā)現(xiàn)前兩個(gè)采樣點(diǎn)土壤汞含量已超過此背景值，可見此處土壤已受到較嚴(yán)重的汞污染?？赡芘c重金屬汞在土壤中遷移能力或周圍土壤環(huán)境及其種植的植物有關(guān)。

表2 供試土壤的理化性質(zhì)

圖2 土壤中重金屬隨距離變化

對(duì)于鉛含量，總體來講隨距煤矸石山距離的增大呈下降趨勢(shì)。但是在0～10 m內(nèi)下降趨勢(shì)明顯，10 m后隨距離增大鉛含量基本維持在50 mg/kg左右。用GB15618—1995中土壤二級(jí)環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)值(Pb≤ 250 mg/kg)作為參照值，可見此處土壤中鉛含量并沒有超過這一值，可能與煤礦開采較晚以及當(dāng)?shù)貧夂蚧蛲寥拉h(huán)境有關(guān)。

土壤中Cr6+含量隨距離煤矸石山距離的增大呈下降趨勢(shì)。距離煤矸石125 m處土壤中Cr6+含量與0 m處相比約減少了6.49倍。用GB15618—1995中土壤二級(jí)環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)值(Cr6+≤0.3 mg/kg)作為參照值，可以發(fā)現(xiàn)前四個(gè)采樣點(diǎn)土壤Cr6+含量已超過此背景值，可見此處土壤已受到較嚴(yán)重的Cr6+污染。土壤中Cr6+含量的分布是礦渣內(nèi)細(xì)小顆粒物隨風(fēng)遷移的結(jié)果，在風(fēng)向和風(fēng)速一定的情況下，主要受距離矸石山遠(yuǎn)近的影響[24]：距離矸石山愈近，礦渣堆內(nèi)的細(xì)小顆粒物在隨風(fēng)遷移時(shí)在此部位沉積的就愈多，而礦渣內(nèi)細(xì)小顆粒物中Cr6+含量較高，Cr6+在此部位的富集就愈多，土壤中Cr6+含量也就增加的愈多；距離矸石山愈遠(yuǎn)，礦渣內(nèi)的細(xì)小顆粒物沉積的就愈少，土壤中Cr6+含量的增加也就愈少。

2.3 土壤微生物含量分析

土壤中的菌類數(shù)量變化見圖3。

2.4 重金屬?gòu)?fù)合污染對(duì)細(xì)菌、放線菌、霉菌生長(zhǎng)影響的相關(guān)回歸分析

從圖3菌類數(shù)量變化可以看出，各采樣點(diǎn)處細(xì)菌菌落數(shù)均低于對(duì)照點(diǎn)，在其他影響因素不變的情況下，細(xì)菌對(duì)重金屬的敏感性最強(qiáng)，對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，使得細(xì)菌不能正常生長(zhǎng)[25-27]。由回歸方程Y=12.5+0.165X1+0.621X2-0.085X3及方差分析表3可以看出，土壤重金屬有效態(tài)含量對(duì)細(xì)菌數(shù)量的變化產(chǎn)生了顯著影響，三種重金屬中，Pb是影響細(xì)菌含量變化的主要因素，Pb含量每變化一個(gè)單位，細(xì)菌數(shù)量平均變化0.621個(gè)單位。并且，在重金屬對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用的情況下，Pb與細(xì)菌數(shù)量基本呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系(圖4)，是由于采樣點(diǎn)處土壤理化性質(zhì)不符合細(xì)菌生長(zhǎng)所需最適環(huán)境(如最適pH值為6.5～7.5)造成的。有研究表明：重金屬Pb對(duì)土壤酶具有明顯的抑制作用[26]。重金屬破壞了土壤酶活性從而導(dǎo)致微生物生存環(huán)境惡劣，細(xì)菌數(shù)明顯呈下降趨勢(shì)。

圖3 菌類數(shù)量變化圖

變異來源平方和自由度均方F回歸96.654332.21820.681??剩余68.546441.558總和165.20047

注：F3，44，0.01=4.331，F(xiàn)> F3，44，0.01,差異極顯著。

由回歸方程Y=26.485+0.068X1-0.624X2-0.818X3和方差分析表4可以看出，土壤重金屬有效態(tài)含量對(duì)放線菌數(shù)量的變化產(chǎn)生了顯著影響，超過了1%的極顯著水平，反映了土壤中重金屬的積累，特別是Pb和Hg，對(duì)放線菌的負(fù)面制約作用。由圖5放線菌受Pb和Hg影響曲線圖(Hg的含量較低，為方便起見，作圖時(shí)放大10倍)可看出，0 m由于“邊際效應(yīng)”，放線菌數(shù)與重金屬有效態(tài)含量呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢(shì)；除0 m以外，其他采樣點(diǎn)處Hg與放線菌變化呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。原因可能是微生物對(duì)不同金屬毒性的敏感性差異，高濃度的重金屬會(huì)導(dǎo)致微生物抗逆性增強(qiáng)，引起種群數(shù)量變化，從而降低微生物數(shù)量；低濃度的重金屬可以促進(jìn)土壤微生物的生長(zhǎng)和繁殖，從而提高微生物數(shù)量，這與韓桂琪等[16]的研究結(jié)果相似。因此，重金屬Hg是影響放線菌數(shù)量變化的主要重金屬元素。

圖4 細(xì)菌受鉛含量變化圖

變異來源平方和自由度均方F回歸10.63833.5464.182??剩余116.1621370.848總和126.800140

注：F3。137，0.01=3.011，F(xiàn)> F3，137，0.01，差異極顯著。

圖5 放線菌受Hg、Pb影響變化曲線圖

由回歸方程Y=17.905-0.099X1-6.55X2-2.456X3和方差分析表5可以看出，土壤重金屬有效態(tài)含量對(duì)霉菌數(shù)量的變化產(chǎn)生了顯著影響，顯著性水平達(dá)99%以上。由圖6霉菌受Hg和Pb影響曲線圖(Hg的含量較低，為方便起見，作圖時(shí)放大10倍)可以看出，Hg與霉菌變化呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系，是由于高濃度的重金屬破壞了霉菌的生存環(huán)境，抑制了霉菌正常新城代謝，影響霉菌的正常生長(zhǎng)；10 m之后Hg的濃度明顯降低，霉菌數(shù)量顯著增加，而后逐漸趨于穩(wěn)定。原因可能是土壤環(huán)境在重金屬的脅迫下，土壤微生物群體組成或結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的變化，而低濃度的重金屬對(duì)土壤環(huán)境影響較小，霉菌對(duì)重金屬的耐性增強(qiáng)，其對(duì)霉菌的抑制作用減弱，使得霉菌數(shù)量相對(duì)有所增加，這與向彬等[26]的研究結(jié)果類似。因此，Hg為影響霉菌數(shù)量變化的主要重金屬元素。

表5 重金屬對(duì)霉菌影響的正交試驗(yàn)方差分析表

注：F3，69，0.01=4.099，F(xiàn)> F3，69，0.01，差異極顯著。

圖6 霉菌受Hg、Pb影響變化曲線圖

3 結(jié) 論

1) 在煤矸石污染源的作用下，土壤中重金屬Pb和Hg的含量全部超出《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB15618—1995)中的一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，重金屬Hg在0 m和10 m處的含量甚至超出二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的要求。其中，w(Pb)的最高值達(dá)到114.247 mg/kg，大大超過GB15618—1995中的一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(35 mg/kg)；w(Hg)的最高值達(dá)到1.08 mg/kg。

2) 鉛在土壤中的含量在0 ～10 m處下降明顯，但高于土壤二級(jí)環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)值。隨距離煤矸石山距離的增大，土壤中Cr6+含量急劇下降。土壤中的鉛、鉻進(jìn)入土壤后主要和土壤中的碳酸鹽、有機(jī)質(zhì)和氧化物結(jié)合，受土壤pH值等影響。

3) 在煤矸石堆的影響下，土壤中重金屬(Cr6+、Pb、Hg)對(duì)土壤微生物(細(xì)菌、放線菌、霉菌)產(chǎn)生影響。隨著重金屬含量的降低，土壤微生物受其影響程度減弱。由相關(guān)回歸分析可見，在99%置信區(qū)間下計(jì)算所得的F值均大于臨界值，說明這三種重金屬對(duì)微生物的影響極顯著。Pb對(duì)細(xì)菌的影響最為顯著，而Cr6+和Hg對(duì)其影響較弱；放線菌同時(shí)受Pb和Hg兩種重金屬的影響，其中Hg對(duì)其影響最為顯著；Hg、Pb較之Cr6+對(duì)霉菌的影響更為顯著，而且Hg有效態(tài)含量與霉菌數(shù)量變化成明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系。

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