陳冠武 蔡 穎* 王鳳軍 周廣彪 許如蘇 蘇建暉 張崢嶸 陳冬娥

（1.汕頭出入境檢驗檢疫局 廣東汕頭 515000；2.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術學院）

1 前言

變形桿菌屬（Proteus）細菌包括5個種：普通變形桿菌（P．vulgaris）、奇異變形菌（P．mirabilis）、潘氏變形桿菌（P．pennea）、產(chǎn)粘液變形桿菌（P．myxofaciens）和 P．hauseri[1]。 美國藥典（USP<1111>）、歐洲藥典（EP 5.1.4）對變形桿菌屬有明確的檢測要求，我國CHINET監(jiān)測（中國細菌耐藥性監(jiān)測）也將變形桿菌屬列為監(jiān)測菌類之一。變形桿菌還是引起食源性疾病的重要病原之一[2]?！斑w徙生長現(xiàn)象”是變形桿菌在合適條件下固有的生長特性，無論在國內(nèi)外微生物學經(jīng)典論著[1，3-4]，還是在文獻上[5-8]都有明確的描述，而該屬細菌也因此而命名。但經(jīng)文獻和標準檢索，尚未發(fā)現(xiàn)將“遷徙生長現(xiàn)象”應用于變形桿菌屬檢測鑒定的文獻和技術規(guī)范，可能的原因是在通常的培養(yǎng)條件下，這種特性并非能夠一直表現(xiàn)得那么穩(wěn)定和典型。筆者根據(jù)經(jīng)驗積累，并通過摸索，創(chuàng)新性地開發(fā)了 “克氏雙糖鐵長斜面遷徙生長試驗”，能使變形桿菌的“遷徙生長現(xiàn)象”特性穩(wěn)定、典型表現(xiàn)，而且易于判斷。筆者采用多種細菌菌株、人工染菌模擬樣品等，驗證了該方法能夠有效地應用于變形桿菌的初篩檢驗。

2 材料與方案

2.1 試驗材料

本研究共選用了96株實驗用菌，包括60株變形桿菌實驗菌株和36株非變形桿菌實驗菌株，其中，有購自ATCC（美國菌種保藏中心）、CMCC（中國醫(yī)學細菌保藏管理中心）、CICC（工業(yè)微生物菌種保藏管理中心）、AS（中國普通微生物菌種保藏中心）菌種保藏中心的標準菌株，有汕頭檢驗檢疫技術中心動檢實驗室日常檢驗分離鑒定的參考菌株和其他實驗室提供（經(jīng)鑒定）的參考菌株。變形桿菌屬實驗用菌編號在文中以“P+數(shù)字”表示代號，具體見表1；非變形桿菌實驗菌株主要選擇生化上與變形桿菌屬較為“近親”、或環(huán)境中常見菌種，以“N+數(shù)字”表示代號，具體見表2。

表2 36株非變形桿菌實驗菌株清單

2.2 主要設備與儀器、試劑

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱 （上海博迅實業(yè)有限公司），CLASSⅡA/B3型生物安全柜（美國FORMA公司），HV-85型自動高壓滅菌器 （日本HIRAYAMA公司），細菌菌濁儀和VITEK 2 Compact微生物鑒定儀（法國生物梅里埃公司）等。

克氏雙糖鐵干粉培養(yǎng)基（同時選用了3個廠家：北京陸橋技術有限公司、廣東環(huán)凱科技有限公司、青島日水生物技術有限公司的產(chǎn)品；制成克氏雙糖鐵長斜面，在下文簡稱北克、廣克、青克）、腦心浸液干粉培養(yǎng)基（BAI）、麥康凱培養(yǎng)基（MAC）、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基（下文簡稱桿顯）、營養(yǎng)瓊脂（NA）、血平板等均購自廣東環(huán)凱科技有限公司，API 20E生化試劑盒、氧化酶試劑、革蘭氏染色液均購自法國生物梅里埃公司，無抑菌劑、無表面活性劑化妝品基礎膏（下文簡稱基質(zhì)）購自廣東金奇日化有限公司。

3 實驗方法

3.1 實驗菌株的遷徙生長試驗

（1）按標準GB 4789.28的要求配制克氏雙糖鐵長斜面培養(yǎng)基（底層高度約2cm、斜面長度約6cm），在2周時間內(nèi)使用。3個廠家的干粉培養(yǎng)基按配制比例制成的斜面（北克、廣克、青克）后，在斜面的底部與試管壁之間都有約100 μL冷凝液，通常放置4℃冰箱4周內(nèi)不會完全變干。

（2）所有實驗菌株均從磁珠凍存管各取1顆放入10 mL BAI中、置于 36±1℃復蘇增菌約 18 h，肉湯濁度均達2。

（3）用移液槍分別吸各菌種500 μL菌液，小心地將吸管伸入到斜面底部冷凝液中輕輕接入菌液，操作時移液槍吸頭不能碰到培養(yǎng)基，3個廠家的克氏雙糖鐵長斜面同時接種操作。置于36±1℃、培養(yǎng)24 h和 48 h。

（4）斜面菌苔的驗證：分別用接種環(huán)在所有實驗菌株的克氏雙糖鐵斜面頂往下≤1 cm位置斜面的表面做向上刮取動作2次，分別劃線接種于血平板，置于36±1℃培養(yǎng)24 h和48 h。

3.2 遷徙生長試驗的靈敏度試驗

選擇 P1、P3、P5、P7 4 株普通變形桿菌；P8、P9 2 株潘氏變形桿菌；P10、P21、P27、P28、P29、P31 6株奇異變形桿菌共12株作為代表菌株，做遷徙生長鑒定法的靈敏度試驗。

分別挑取上述12株代表菌的菌苔，各制出1.0麥氏度的菌濁液，然后以10倍數(shù)稀釋，分別取10-6、10-7、10-8、10-9稀釋液進行檢測。按2.1的方法操作，置于36±1℃培養(yǎng)24 h。上述操作的同時，各菌株稀釋液按吸取量500 μL菌液進行菌落計數(shù)。

3.3 人工染菌模擬化妝品樣品試驗

3.3.1 檢測樣制作

選部分代表性實驗菌菌苔調(diào)制成1.0麥氏度菌液，參照《化妝品安全技術規(guī)范》[9]的增菌方法，以“無表面活性劑化妝品基礎膏（基質(zhì)液）0.5 g+干擾菌N 各 50 μL+變形桿菌 P 50 μL+SCDLP 4.5 mL”混合均勻，制出若干檢測模擬化妝品樣品增菌液（詳見表3），按2.1在3種培養(yǎng)基（北克、廣克、青克）上進行遷徙生長試驗。

表3 人工染菌模擬化妝品樣品配方列表

3.3.2 斜面菌苔的驗證

按2.1的方法，分別將菌苔醮取物劃線接種于MAC、桿顯平板，36±1℃培養(yǎng)24 h后觀察平板上菌落特點。

4 結(jié)果與分析

4.1 實驗菌株遷徙生長試驗

結(jié)果見表4。變形桿菌和非變形桿菌遷徙生長試驗典型結(jié)果見圖1。接種變形桿菌的克氏雙糖鐵長斜面，肉眼可見整個斜面被漫延性生長 （四周擴散）的灰白色菌苔基本覆蓋，呈陽性反應；而接種非變形桿菌的，菌株都未表現(xiàn)出向上的蔓延生長，有個別菌株出現(xiàn)了沿斜面向上浸潤生長 （液體附在固體表面上的漸漸滲入）的現(xiàn)象，其向上生長的菌苔沒有超過冷凝液面上1 cm（低于1/4斜面高度），呈陰性反應。陽性與陰性的遷徙試驗結(jié)果區(qū)分度明顯。

（續(xù)表4）

圖1 變形桿菌和非變形桿菌遷徙生長試驗典型結(jié)果

斜面菌苔的驗證結(jié)果：培養(yǎng)24 h、48 h后，在所有變形桿菌實驗菌株的血平板上均出現(xiàn)覆蓋膜樣生長的菌苔，并有惡臭味，所有非變形桿菌實驗菌株的血平板上均無菌生長。

4.2 遷徙生長試驗的靈敏度試驗

遷徙生長試驗的靈敏度試驗結(jié)果見表5。其中，P9號菌株遷徙生長試驗的靈敏度試驗結(jié)果見圖2。由表5可見，在菌落計數(shù)為10 CFU/500 μL以下時，遷徙生長試驗仍能呈現(xiàn)陽性結(jié)果。

表5 遷徙生長試驗的靈敏度試驗結(jié)果（CFU/500 μL）

圖2 P9號菌株遷徙生長試驗的靈敏度試驗結(jié)果

4.3 人工模擬樣品遷徙生長試驗結(jié)果

4.3.1 試驗結(jié)果

試驗結(jié)果見表6、圖3。由表6、圖3可見，干擾菌對模擬樣品中變形桿菌遷徙試驗結(jié)果沒有影響。

表6 人工染菌模擬樣品遷徙生長試驗結(jié)果

圖3 人工模擬樣品遷徙生長試驗結(jié)果

4.3.2 斜面菌苔驗證結(jié)果

12個樣品劃線接種于MAC、桿顯平板培養(yǎng)24 h后，生長良好，在MAC平板上均為形態(tài)一致的無色半透明或透明、圓形菌落，大小1～2 mm，菌落生長處平板顏色由桔黃色變無色；在桿顯平板上均為形態(tài)一致的桔黃色至淺褐色菌落，大小1～3 mm，菌落生長處的培養(yǎng)基有的會變成黃色。經(jīng)生化鑒定分離菌都符合所加入的變形桿菌生化特征。

5 結(jié)論與討論

《伯杰氏細菌鑒定手冊》第8版[3]中第八部分腸桿菌科變形菌屬中，雖然沒有將“遷徙生長現(xiàn)象”在變形菌屬予以描述，但手冊的補充評注中將普通變形桿菌（P．vulgaris）和奇異變形桿菌（P．mirabilis）清楚描述“在固體培養(yǎng)基上有顯著的自發(fā)群集的特性；運動細胞的一薄層以旋轉(zhuǎn)和帶狀的改變排列……”；雖然該版本將沒有“遷徙生長現(xiàn)象”特性的摩氏變形桿菌、無恒變形桿菌、雷氏變形桿菌也劃歸為變形桿菌屬，但作為《伯杰氏細菌鑒定手冊》更新版的《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》第2版[4]，將他們同時分別歸類為摩根氏菌屬、普羅威登斯菌屬、雷特菌屬，稱為同模式異名（homotypic synonym）。本研究結(jié)果顯示這種“遷徙生長現(xiàn)象”是變形桿菌屬中普通變形桿菌、奇異變形菌、潘氏變形桿菌固有的，與其他細菌明顯不同的特征性特點。

本試驗應用克氏雙糖鐵培養(yǎng)基（乳糖∶葡萄糖為10∶1）而沒有應用TSI三糖鐵培養(yǎng)基（乳糖∶蔗糖∶葡萄糖為10∶10∶1），是因為后者比前者多含蔗糖，普通變形桿菌和潘氏變形桿菌都能分解蔗糖使斜面變黃、部分菌株除產(chǎn)硫化氫還會出現(xiàn)底層培養(yǎng)基離底，而奇異變形桿菌因不能分解蔗糖斜面為橘紅色或紅色；在克氏雙糖鐵上3種變形桿菌在斜面上都是一致的橘紅色或紅色，底層產(chǎn)酸產(chǎn)硫化氫但不會出現(xiàn)離底或培養(yǎng)基破裂的現(xiàn)象。本試驗也沒有像文獻[10]那樣采用普通營養(yǎng)瓊脂斜面，因為變形桿菌在普通營養(yǎng)瓊脂斜面上沒有糖發(fā)酵及產(chǎn)酸產(chǎn)硫化氫特點，而且沿斜面產(chǎn)生菌苔遷徙生長沒有克氏雙糖培養(yǎng)基明顯，對于變形桿菌的鑒定效果不好。因此，本文最終選擇應用克氏雙糖鐵斜面作為檢測載體。為了防止國產(chǎn)試劑配方差異導致結(jié)果不穩(wěn)定，選用國內(nèi)市場占有率較高的3個廠家的克氏雙糖試劑制成斜面，同時進行以上3個實驗。結(jié)果表明，所有變形桿菌實驗菌株均從斜面底的冷凝液中向上長出灰白色菌苔，并沿斜面向上蔓延生長，可覆蓋整個斜面，且“動力十足”地向下往斜面底層生長并產(chǎn)硫化氫，為遷徙生長試驗陽性；非變形桿菌實驗菌株中，多數(shù)未出現(xiàn)肉眼可見的向上生長現(xiàn)象，個別出現(xiàn)輕微向上浸潤生長現(xiàn)象 （液體附在固體表面上的漸漸滲入現(xiàn)象），且不會超過冷凝水液面之上1 cm（小于斜面高度1/4位置），遷徙生長現(xiàn)象均呈陰性。遷徙生長試驗的靈敏度試驗結(jié)果表明，檢測低限可至少達到 3～7 CFU/500 μL，與文獻中 PCR 檢測方法相當[11]。

變形桿菌屬細菌遷徙生長的影響因素與特定的酸堿度環(huán)境等有關，它的螺紋遷徙生長現(xiàn)象產(chǎn)生可能與其遺傳特性和地球的自轉(zhuǎn)有關[8]、瓊脂濃度和表面水分含量有關[6]、與細菌的傳代次數(shù)無關[7]、35℃、培養(yǎng)4 h就能開始遷徙生長[12]。實驗結(jié)果顯示，在克氏雙糖鐵長斜面36±1℃、培養(yǎng)24 h，變形桿菌能很好地顯示其遷徙生長特性。

本研究結(jié)果表明，應用本研究開發(fā)的克氏雙糖鐵遷徙生長試驗方法，能充分展示變形桿菌的遷徙生長特性，并且能方便、明顯地與其他細菌區(qū)分出來。人工染菌模擬樣品試驗結(jié)果表明，將化妝品樣品的首次增菌液按本文方法進行遷徙生長試驗，可以很方便地篩查出樣品中含有的微量變形桿菌。所以，遷徙生長現(xiàn)象可應用于實際樣品檢測。本文首創(chuàng)的“遷徙生長試驗”可應用于食品、化妝品等樣品變形桿菌的初篩檢測，既可以首次增菌液是否產(chǎn)生遷徙生長現(xiàn)象作為是否含有變形桿菌的初篩判斷依據(jù)之一，也可以在細菌分純培養(yǎng)后的遷徙生長試驗陽性作為變形桿菌的特征性生化鑒定項目之一。

本研究首創(chuàng)的“遷徙生長試驗”操作簡單、成本低廉、易于判斷結(jié)果，可作為變形桿菌屬檢測的初篩項目或特征性生化鑒定項目之一。

致謝：向為本試驗提供部分實驗菌種的天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院感染性疾病研究所和深圳龍崗區(qū)疾控中心表示衷心感謝！

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