亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        一步法逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶常溫擴(kuò)增技術(shù)(RT-RPA)檢測大豆花葉病毒

        2018-06-20 06:23:44袁俊杰馬新華楊卓瑜盧乃會乾義柯魏梅生李桂芬張永江
        質(zhì)量安全與檢驗檢測 2018年2期
        關(guān)鍵詞:花葉病毒靈敏度特異性

        袁俊杰 魏 霜 龍 陽 馬新華 楊卓瑜 盧乃會乾義柯 魏梅生 李桂芬 張永江*

        (1.湛江出入境檢驗檢疫局 廣東湛江 524000;2.廣東出入境檢驗檢疫局;3.伊犁出入境檢驗檢疫局;4.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院)

        1 前言

        大豆花葉病毒 (Soybean mosaic virus,SMV)在分類學(xué)地位中屬馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus),該病毒主要依靠種子和蚜蟲傳播[1],在我國大豆品種上的種傳率為0%~38%,引起10%~30%的產(chǎn)量下降[2],如果與菜豆莢斑駁病毒混合侵染大豆,則可造成大豆減產(chǎn)85%[3],侵染大豆后引起11種大豆植株病狀,如花葉、葉片皺縮、頂枯致死、矮化畸莢、種粒斑駁等[4],嚴(yán)重影響大豆籽粒外觀品質(zhì)和商業(yè)價值。

        我國不僅是大豆的原產(chǎn)國,也是全球最大的進(jìn)口國,“十一五”期間,我國大豆進(jìn)境量由5 000多萬噸增長至8 000多萬噸,增幅達(dá)到60%。近2年大豆進(jìn)口也一直處于高位增長態(tài)勢[5],隨著進(jìn)口大豆數(shù)量的急劇增加,植物病毒類有害生物傳入我國的風(fēng)險也日益增高,近年來,上海、江蘇、福建、寧波等口岸多次從國外進(jìn)境的大豆種子中截獲到SMV。為防范該病毒隨進(jìn)境大豆種子傳播及擴(kuò)散,迫切需要建立一套準(zhǔn)確快速的檢測方法應(yīng)用于進(jìn)出口快速檢疫。

        PCR技術(shù)由于檢測靈敏度高,適用范圍廣,操作簡便等原因應(yīng)用尤為廣泛,但常見的PCR檢測技術(shù)檢測程序復(fù)雜、需要精密的儀器、檢測時間較長,不利于非實驗室環(huán)境下現(xiàn)場檢測以及基層實驗室的推廣應(yīng)用。恒溫擴(kuò)增技術(shù)是繼PCR技術(shù)后發(fā)展起來的一門新型的體外核酸擴(kuò)增技術(shù),由于在恒定溫度下即可擴(kuò)增,因此不需要熱循環(huán)儀,可用于基層實驗室或現(xiàn)場快速檢測,例如LAMP曾經(jīng)用于大豆花葉病毒檢測。重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification,RPA)是近幾年出現(xiàn)的一種等溫核酸體外擴(kuò)增技術(shù),目前在醫(yī)學(xué)病原菌、轉(zhuǎn)基因的檢測中應(yīng)用比較廣泛[6-10],植物病毒研究中應(yīng)用較少,張娜等[11]曾應(yīng)用于葡萄卷葉伴隨病毒的檢測,特異性強(qiáng),靈敏度高。RPA技術(shù)主要依賴于3種酶:能結(jié)合單鏈寡核苷酸引物的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和DNA聚合酶[12],不需要模板鏈的熱變性、退火和延伸環(huán)節(jié),可以在恒定的低溫條件下完成核酸的快速擴(kuò)增。經(jīng)探索,發(fā)現(xiàn)加逆轉(zhuǎn)錄酶于RPA體系中可以將RNA作為模板合成cDNA后再進(jìn)行擴(kuò)增,實現(xiàn)一步法擴(kuò)增,利于RNA病毒核酸檢測[13-14]。該技術(shù)擺脫了對核酸擴(kuò)增儀的依賴,增大了核酸擴(kuò)增的便捷度。

        目前國內(nèi)利用RT-RPA技術(shù)檢測SMV尚未見報道,本研究根據(jù)SMV的外殼蛋白基因序列,設(shè)計特異性RPA引物,建立SMV的RT-RPA檢測方法,并驗證其特異性和靈敏度,旨在建立一種適用于口岸快速檢測SMV的簡單高效方法。

        2 材料與方法

        2.1 材料與試劑

        大豆花葉病毒(Soybean mosaic virus,SMV)、菜豆莢斑駁病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)、南方菜豆花葉病毒(Southern bean mosaic virus,SBMV)、南芥菜花葉病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)及煙草環(huán)斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV) 樣品均保存于中國檢驗檢疫科學(xué)研究院,同時設(shè)置陰性對照(健康大豆種子),樣品經(jīng)PCR檢測和序列測定確認(rèn)后于-80℃凍干保存。植物總RNA提取試劑盒購自天 物科技有限公司;TwistAmp Basic RT為TwistDx Inc公司產(chǎn)品。

        2.2 主要儀器與設(shè)備

        金屬?。‥ppendorf ThermoMixer)、電泳儀(600SI,上海博彩生物科技有限公司)、凝膠成像系統(tǒng)(GBOX-F3,GENE 公司)。

        2.3 方法

        2.3.1 RNA提取

        參照試劑盒操作,提取5種病毒樣品及陰性對照的總RNA,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        2.3.2 引物設(shè)計

        參考RPA引物設(shè)計的要求,根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中SMV的外殼蛋白基因序列(ID:AH012604.2),設(shè)計檢測SMV的RPA引物,擴(kuò)增條帶154 bp。上游引物 SMV-F:5′-AAGATGAATCTTCCAATGGTTGA AGGGAAGATC-3′;下游引物 SMV-R:5′-CAAGC TCATATTCATCTTTAACTGCATTGTACC-3′。 引物由上海生工生物工程有限公司合成。

        2.3.3 RT-RPA檢測

        以2.3.1中制備的RNA為模板,采用SMV-F和SMV-R引物進(jìn)行RT-RPA擴(kuò)增,同時設(shè)置陰性對照。RT-RPA擴(kuò)增體系(50 μL)的配制方法如下:向含有凍干酶粉的反應(yīng)管中加入再水化緩沖液(Rehydration Buffer)29.5 μL,去離子水 12 μL,上、下游引物各 2 μL (終濃度為 0.4 μmol/L), 模板RNA 2 μL,最后再加入醋酸鎂溶液 2.5 μL(280 mmol/L)。將RT-RPA擴(kuò)增體系充分混勻,置于40℃的金屬浴上反應(yīng)40 min。RPA反應(yīng)結(jié)束后,向RTRPA擴(kuò)增產(chǎn)物中加入50 μL苯酚/氯仿溶液,充分混勻后12 000 r/min離心2 min,取上清液5 μL于1.5%瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

        2.3.4 RT-RPA檢測方法特異性評價

        按照2.3.3 RT-RPA檢測反應(yīng)體系,對供試樣品 SMV、BPMV、SBMV、ArMV 及 TRSV 共 5種病毒的RNA進(jìn)行檢測,設(shè)置陰性對照,對所建立的RTRPA檢測方法特異性進(jìn)行評價。

        2.3.5 RT-RPA檢測方法靈敏度評價

        將SMV樣品的總RNA進(jìn)行10倍梯度稀釋,共5個稀釋度,以梯度稀釋的RNA為模板,按照2.3.3所示的反應(yīng)體系進(jìn)行RT-RPA靈敏度實驗。

        3 結(jié)果與分析

        3.1 RT-RPA檢測方法的特異性評價

        特異性評價結(jié)果顯示,SMV樣品能夠檢測到154 bp的特異性條帶,其他4種病毒樣品BPMV、SBMV、ArMV、TRSV及陰性對照均未檢測到條帶。同時將陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送公司測序,將測序結(jié)果在NCBI上比對,結(jié)果顯示與大豆花葉病毒序列同源性高達(dá)99%。證明該方法具有較強(qiáng)的特異性(圖1)。

        圖1 SMV的RT-RPA特異性檢測結(jié)果

        3.2 RT-RPA檢測方法的靈敏度評價

        對SMV的RT-RPA檢測方法靈敏度檢測結(jié)果顯示(圖2),RPA 檢測方法反應(yīng)時間設(shè)置在40 min,當(dāng)稀釋度為10-4時,可以檢測約154 bp的目的條帶,當(dāng)稀釋度為10-5時,未能擴(kuò)增到目的條帶。

        圖2 SMV的RT-RPA檢測靈敏度

        4 結(jié)論與討論

        大豆花葉病毒是一種在全世界廣泛分布并且破壞性極大的植物病毒,可以導(dǎo)致大豆產(chǎn)量驟減以及種質(zhì)的衰退,每年都會導(dǎo)致許多大豆主產(chǎn)國的巨大經(jīng)濟(jì)損失。由SMV引發(fā)的大豆花葉病已經(jīng)在我國大豆產(chǎn)區(qū)大量發(fā)生,目前對該病毒防治方法主要依賴于化學(xué)防治及培育抗性品種,化學(xué)防治對環(huán)境產(chǎn)生巨大危害,而隨著大豆進(jìn)口量的激增,全球范圍內(nèi)大豆種質(zhì)出現(xiàn)資源交流,新型病毒株系的出現(xiàn)和致病力強(qiáng)弱的變化也給我國大豆抗 SMV育種工作帶來了巨大挑戰(zhàn)[15],因此在口岸檢疫部門建立快速、靈敏、簡單、高效的SMV檢測技術(shù),防范該病毒隨進(jìn)境大豆種子的傳入傳播,對保護(hù)我國大豆生產(chǎn)和種質(zhì)資源的安全具有重要意義。

        相比其他的植物病毒檢測方法,本研究建立的RT-RPA方法擁有以下優(yōu)點:(1)引物設(shè)計簡單。僅需1對引物即可完成擴(kuò)增,相比LAMP恒溫擴(kuò)增技術(shù)簡單,不需要復(fù)雜的引物設(shè)計過程;(2)常溫擴(kuò)增,不需要昂貴的熱循環(huán)儀。配備一臺小型的水浴鍋或者金屬浴等溫條件下就能實現(xiàn)核酸解鏈,并且逆轉(zhuǎn)錄和RPA恒溫擴(kuò)增反應(yīng)在同一反應(yīng)管中連續(xù)進(jìn)行,有效避免了RNA酶對反應(yīng)體系的污染。適合現(xiàn)場、野外檢測。(3)反應(yīng)時間短。目的DNA片段在短時間內(nèi)(15~30 min) 即可得到指數(shù)級積累。(4)結(jié)果易于判斷。產(chǎn)物根據(jù)引物設(shè)計位點有特定大小的條帶,相比LAMP產(chǎn)物的彌散帶結(jié)果更容易判斷。RPA技術(shù)檢測時只需配以瓊脂糖凝膠電泳1 h內(nèi)即可獲得準(zhǔn)確的結(jié)果,操作簡單,能夠特異性檢測到供試帶毒樣品中的SMV條帶,對其他幾種植物病毒的檢測結(jié)果均為陰性,說明該方法特異性高。RPA檢測 SMV的靈敏度為10-4稀釋度樣品提取液,和已報導(dǎo)的普通PCR、組織印跡與RT-PCR[16]、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)[17]等檢測技術(shù)的靈敏度相當(dāng),說明RPA技術(shù)可作為現(xiàn)場快速篩查SMV的有效手段。

        當(dāng)然RPA作為一種新興的檢測技術(shù),應(yīng)用于SMV的檢測還存在一些問題。首先,在引物設(shè)計過程中遇到兩方面的難點。一是SMV病株分子變異普遍,存在許多株系[18],在設(shè)計SMV特異性擴(kuò)增引物時應(yīng)盡可能多的覆蓋這些株系,否則容易產(chǎn)生漏檢現(xiàn)象。二是為了增強(qiáng)檢測方法的特異性,設(shè)計引物時不僅僅要考慮到SMV不同株系的種內(nèi)保守性,還要兼顧其與其他大豆病毒的種間差異性,這就縮小了引物設(shè)計的范圍。其次,RPA體系對于蛋白活性要求比較高,必須保證體系中任意1種酶均有活性,否則將導(dǎo)致RPA體系停止工作;最后,RPA擴(kuò)增體系中存在大量蛋白酶,使得RPA擴(kuò)增產(chǎn)物必須除去蛋白后才能電泳或進(jìn)行后續(xù)試驗[19]。

        傳統(tǒng)的種傳大豆病毒檢測需要檢測種子形成的植株[20-21],這是因為發(fā)病的大豆葉片中含有大量病毒及病毒RNA,而大豆種子較大豆發(fā)病葉片病毒含量較少,另一方面,大豆種子中富含多糖及蛋白質(zhì)等物質(zhì),從種子中直接提取,RNA質(zhì)量和純度均不高,影響后續(xù)檢測,因此以往對進(jìn)境大豆的病毒檢測經(jīng)常需要將疑似帶毒種子進(jìn)行隔離培養(yǎng)直至長出葉片,再對葉片進(jìn)行檢測得到確切結(jié)果,檢測周期長,耗時耗力。本研究建立的RT-RPA方法可直接對干種子進(jìn)行檢測,且特異性強(qiáng)、靈敏度高,方便快捷,對于進(jìn)境大豆的檢測具有快速的優(yōu)越性。

        5 結(jié)語

        我國煉油業(yè)規(guī)模巨大,大豆需求量大,需要長期大量的從國外進(jìn)口,但是各種植物病害不斷出現(xiàn),嚴(yán)重威脅著我國農(nóng)林產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。RPA技術(shù)操作方便,特異性強(qiáng)、檢測靈敏度高,擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方便,雖然存在一定的缺點,但隨著RPA技術(shù)的不斷發(fā)展、進(jìn)一步完善以及檢測步驟的改良,將有望在大豆花葉病毒的田間診斷、預(yù)測預(yù)報和大豆脫毒苗的生產(chǎn)等研究領(lǐng)域得到更加廣泛的應(yīng)用,在我國植物病毒快速檢測和一線國門檢疫提供有效的技術(shù)支持。

        [1]楊向東,牛陸,張偉,等.RNAi介導(dǎo) SMV-P3基因沉默增強(qiáng)大豆對花葉病毒病的抗性[J].作物學(xué)報,2016,42(11):1647-1655.

        [2]陳永萱,薛寶娣,浦冠勤.大豆花葉病毒(SMV)種子帶毒的研究[J].中國病毒學(xué),1987,(3):66-71.

        [3]張明哲,李可,周宏斌,等.一種快速檢測菜豆莢斑駁病毒的新方法[J]. 植物保護(hù)學(xué)報,2012,39(1):91-92.

        [4]王連錚,王金陵.大豆遺傳育種學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,1992:208-243.

        [5]王健超.進(jìn)境大豆檢驗檢疫現(xiàn)狀分析與建議 [J].大豆科技,2015,34(6):34-36.

        [6]Xu C,Li L,Jin W,et al.Recombinase polymerase amplification(rpa) of camv-35s promoterand nosterminatorforrapid detection of genetically modified crops[J].International Journal of Molecular Sciences,2014,15(10):18,197-198,205.

        [7]鄧婷婷,黃文勝,程奇,等.重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因水稻中的 Cry1Ab/c 基因[J]. 中國食品學(xué)報,2015,15(3):187-193.

        [8]Euler M,Wang Y,Nentwich O,et al.Recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of rift valley fever virus[J].Journal of Clinical Virology the Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology,2012,54 (4):308-312.

        [9]Milena E,Yongjie W,Peter O,et al.Recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of francisella tularensis[J].Journal of Clinical Microbiology,2012,50(7):2234-2238.

        [10]Boyle D S,Lehman D A,Lorraine L,et al.Rapid detection of hiv-1 proviral dna for early infant diagnosis using recombinase polymerase amplification[J].Mbio,2013,4(2):49-52.

        [11]張娜,乾義柯,魏霜,等.基于重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA)的葡萄卷葉伴隨病毒 3號檢測方法[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,53(2):302-308.

        [12]吳耀東,徐民俊,鄭文斌,等.重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)及其在動物病原快速檢測中的應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)報,2016,36(10):1797-1800.

        [13]Mekuria TA,Zhang S,Eastwell KC.Rapid and sensitive detection of Little cherry virus 2 using isothermal reverse transcription recombinase polymerase amplification[J].Journal of Virological Methods,2014,205(1):24-30.

        [14]Abd El Wahed A,El-DeebA,El-TholothM,et al.A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapiddetection of foot-and-mouth disease virus[J].PLoS One,2013,8(8):e71642.

        [15]楊向東,牛陸,張偉,等.RNAi介導(dǎo)SMV-P3基因沉默增強(qiáng)大豆對花葉病毒病的抗性[J]. 作物學(xué)報,2016,42(11):1647-1655.

        [16]戰(zhàn)勇,喻德躍.大豆花葉病毒的組織印跡與 RT-PCR檢測[J].大豆科學(xué).2010,29(6):916-919.

        [17]張雯娜,李晉玉,田金艷,等.逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)快速檢測大豆花葉病毒[J]. 大豆科學(xué),2014,33(3):422-428.

        [18]尚佑芬,趙玖華,楊崇良.黃淮區(qū)大豆花葉病毒株系組成與分布[J].植物病理學(xué)報,1999,(2):115-119.

        [19]張娜,乾義柯,魏霜,等.基于重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA)的葡萄卷葉伴隨病毒3號檢測方法 [J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,53(2):302-308.

        [20]Milena E,Yongjie W,Peter O,et al.Recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of francisella tularensis[J].Journal of Clinical Microbiology,2012,50(7):2234-2238.

        [21]Boyle D S,Lehman D A,Lorraine L,et al.Rapid detection of hiv-1 proviral dna for early infant diagnosis using recombinase polymerase amplification[J].Mbio,2013,4(2):49-52.

        猜你喜歡
        花葉病毒靈敏度特異性
        導(dǎo)磁環(huán)對LVDT線性度和靈敏度的影響
        地下水非穩(wěn)定流的靈敏度分析
        精確制導(dǎo) 特異性溶栓
        藜草花葉病毒的研究概述
        中國蔬菜(2016年8期)2017-01-15 14:23:34
        BOPIM-dma作為BSA Site Ⅰ特異性探針的研究及其應(yīng)用
        重復(fù)周圍磁刺激治療慢性非特異性下腰痛的臨床效果
        穿甲爆破彈引信對薄弱目標(biāo)的靈敏度分析
        我國甜菜花葉病毒基因與馬鈴薯Y病毒屬其它家族序列的比較與分析
        中國糖料(2015年6期)2015-11-25 08:40:58
        兒童非特異性ST-T改變
        芯片技術(shù)檢測黃瓜花葉病毒、煙草花葉病毒和馬鈴薯Y病毒
        一区二区三区婷婷在线| a级国产乱理伦片| 国自产精品手机在线观看视频| 国产精品后入内射日本在线观看 | 日韩精品有码在线视频| 亚洲国产日韩一区二区三区四区| 丰满少妇弄高潮了www| 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠| 国产精品久久久一本精品| 亚洲国产一区二区,毛片| 国产成人精品免费视频大全软件| 久久久久久国产精品无码超碰动画| 五月中文字幕| 国产一级黄色性生活片| 在线久草视频免费播放| 香蕉久久一区二区不卡无毒影院| 欧美日韩精品| 亚洲AV成人无码久久精品四虎| 国产一区二区三区再现| 久久精品国产免费观看三人同眠| 色www永久免费视频| 欧美va亚洲va在线观看| 国产在线观看网址不卡一区| 中文字幕av长濑麻美| 中国女人内谢69xxxx免费视频| 亚洲中文无码久久精品1| 丝袜美腿av免费在线观看| 国产禁区一区二区三区| 四虎影视永久地址www成人| 国产精彩视频| 国产一区二区三区护士| 久久婷婷五月综合色欧美| 亚洲av成本人无码网站| 一区二区三区在线蜜桃| 国产精品一区二区三区专区| 性色av无码久久一区二区三区| 在线视频青青草猎艳自拍69| 成人免费播放视频影院| 一本大道av伊人久久综合 | 国产精品国产三级国av| 日本女优在线观看一区二区三区 |