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心肌纖維化是多種心血管疾病發(fā)展到一定階段的共同病理改變，是心肌重構(gòu)的主要表現(xiàn)之一，可致心肌僵硬度增加、心室舒張功能減退、心律失常，甚至猝死，是影響心血管疾病預(yù)后極為重要的因素。預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化已成為防治心血管系統(tǒng)疾病的焦點之一。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是最重要的致纖維化生長因子之一[1-2]，可促進細胞的增殖、分化和膠原的合成、結(jié)締組織增生，同時對膠原的降解具有抑制作用[3-4]，Smads蛋白是TGF-β的下游信號分子之一，介導(dǎo)TGF-β1的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。TGFβ/Smads信號通路與心肌纖維化密切相關(guān)，對心肌梗死后纖維化的發(fā)生具有促進作用[5- 6]。扶正化瘀膠囊主要由丹參、桃仁、松花粉、五味子、絞股藍、蟲草菌絲等藥物組成。前期研究證實，扶正化瘀膠囊對心肌纖維化具有改善作用[7]，但其具體作用機制尚不明確。本研究擬制作心肌梗死后心肌纖維化大鼠模型，觀察扶正化瘀膠囊對模型大鼠TGF-β1/Smads通路中主要因子TGF-β1、smad3、smad4、smad7的影響，探討其抗心肌纖維化的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，清潔級，體重220 g～250 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證編號：SCXK(京)2002-0003，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院屏障動物室。

1.2 藥物及試劑 扶正化瘀膠囊(上海黃海制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號151040)；卡托普利片(中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)，批號AAD7212)；Trizol試劑(批號：15596026，Ambion公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：K1662，Thermo Fisher Scientific)；SYBR Select Master Mix (批號：4472908，Applied Biosystems)；目的基因引物由北京賽諾基因組研究所中心有限公司合成；兔源單克隆抗體β-actin(ab8227)，兔源多克隆抗體TGF-β1(ab92486)，兔源單克隆抗體smad 3(ab40854)、兔源單克隆抗體smad4(ab40759)、兔源多克隆抗體smad7(ab190987)、兔源單克隆抗體GAPDH(ab181602)均購自英國abcam公司，RIPA裂解緩沖液(批號：C1053)、蛋白酶抑制劑混合物(型號：P1265)、蛋白質(zhì)定量試劑盒(型號：P1511)、5%脫脂奶粉(型號：P1622)、柯達膠片(型號：E1122)均來源于北京普利萊基因技術(shù)有限公司。超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(編號：B500022，proteintch科技有限公司)；兔二步法免疫試劑盒(型號：PV-9001)、進口山羊血清(型號：ZLI-9022)、抗體稀釋劑(型號：ZLI-9030)、DAB顯色試劑盒(型號：ZLI-9018)均由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 主要儀器 動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司，ALC-V8型)，心電圖儀(CardiMax FX-7202)，Vevo高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)(加拿大VisualSonics Inc公司， TM2100型)，超薄切片機LEIA RM2135(Feica公司)，高倍顯微鏡 BX60(OLYMPUS公司)，圖像采集系統(tǒng)SPOT FLEX(美國 Diagnostic Instrument公司)，千分之一電子天平(中國上海精密科學(xué)儀器有限公司JA1003N型)，4℃離心機(上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司，lolTGL-16G型)，基因擴增儀(美國AB公司，GeneAmp PCRsystem9700型)，安捷倫實時熒光定量PCR儀(美國安捷倫科技公司，Mx3000P型)，DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)，電熱恒溫水浴鍋(北京市長風(fēng)儀器儀表公司，HW.SY11-K型)。

1.4 模型制備 參照文獻[8]制備模型，大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔麻醉后，背位固定，經(jīng)喉行氣管插管術(shù)，連接呼吸機，以80次/min、潮氣量0.7 mL～0.8 mL行人工呼吸。于左胸第三、四肋間打開1.5 cm開口，撕開心包膜后，用眼科彎鑷輕提左心耳，在動脈圓錐與左心耳之間下1 mm處用5/0手術(shù)線結(jié)扎左冠狀動脈前降支，迅速關(guān)胸，逐層縫合。心電圖Ⅱ?qū)?lián)顯示ST段顯著抬高表示結(jié)扎成功。假手術(shù)只穿線不結(jié)扎。

1.5 分組與給藥方法 模型成功后，隨機分為模型組、扶正化瘀組、卡托普利組，每組6只。按體表面積折算大鼠的等效劑量[9]，即扶正化瘀膠囊0.4 g/(kg·d)，卡托普利2.25 mg/(kg·d)灌胃，模型組和假手術(shù)組給予等量去離子水，每日1次，連續(xù)8周。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 超聲心動圖評價急性心肌梗死(AMI)大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能 8周后，采用超聲心動圖檢查各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)：室間隔收縮末期厚度(IVSTs)、室間隔舒張末期厚度(IVSTd)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)、左室射血分數(shù)(LVEF)、左室短軸縮短分數(shù)(LVFS)。

1.6.2 免疫組化法檢測大鼠心肌組織TGF-β1蛋白的表達 取梗死邊緣區(qū)心肌組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片。梯度乙醇脫蠟，3%H2O2室溫孵育15 min，微波修復(fù)后0.01%PBS漂洗5 min×3次，山羊血清封閉30 min，滴加TGF-β1(1∶100)一抗，置濕盒中4℃孵育過夜。加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗?jié)窈兄惺覝胤跤?0 min，DAB顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察顯色情況，自來水終止反應(yīng)。梯度酒精和二甲苯脫水透明，中性樹脂封片。陰性對照除用PBS代替一抗進行孵育外，其余步驟相同，圖像經(jīng)image Pro plus6.0分析軟件采集數(shù)據(jù)，每組6張切片，每張切片隨機選擇5個視野，計算陽性區(qū)域所占總面積。

1.6.3 Western blot法檢測大鼠心肌組織中的Smads蛋白的表達情況 按蛋白抽提試劑盒說明書提取總蛋白，BCA法定量。取50 μg蛋白，經(jīng)十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳進行分離，冰水混合物中恒流250 mA 2 h轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入兔源單克隆或多克隆抗體smad3(1∶5000)、smad4(1∶5000)、smad7(1∶4 000)4 ℃搖動孵育過夜。室溫洗膜后，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG抗體。洗去未結(jié)合的二抗，滴加化學(xué)發(fā)光劑ECL進行發(fā)光顯影。以β-actin(1∶10 000)為內(nèi)參照?；叶葤呙韬笥肐mage J軟件分析條帶的灰度值，結(jié)果以目的蛋白/內(nèi)參的比值表示。

1.6.4 實時熒光定量PCR法檢測各組大鼠心肌組織TGFβ/smads mRNA的表達 采用Trizol試劑提取總RNA，紫外分光光度計測定吸光度A260/A280，計算其濃度及純度。采用二步法進行mRNA表達的檢測。反轉(zhuǎn)錄按試劑盒說明書操作，取2 μg總RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶M-MuLV和引物olig(dT)15條件下進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA鏈。以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為25 μL，含1 μL cDNA，10 μmol/L上下游引物各1 μL，2×SYBER Green PCR mix 12.5 μL，不足的體積以無RNA酶的水補齊。以GAPDH作為內(nèi)參照。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔。循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性95 ℃×10 min，變性95 ℃×1 min，退火55 ℃×30 s，延伸72 ℃×20 s，共40個循環(huán)。TGF-β1引物：sense 5’-AGGGCTACCATGCCAACTTC-3’，antisense 5’-CCACGTAGTAGACGATGGGC-3’；smad3引物：sense 5’-ATACGGATGTTCAAGTTCG-3’，antisense 5’-ACTGGGTCCTCTTTGGTTTT-3’；smad4引物：sense 5’-CTTGGGGCAAGACTGCAAAC-3’，antisense 5’-GGTACAGTCAATGCGTCCCA-3’；smad7引物：sense 5’-GAAGTCAAGAGGCTGTGTTGC-3’，antisense 5’-CAGGCTCCAGAAGAAGTTGG-3’；GAPDH引物：sense 5’-AGTTCAACGGCACAGTCAAG-3’，antisense 5’-TACTCAGCACCAGCATCACC-3’。所得Ct值按照2-△△Ct法均一化處理后進行統(tǒng)計。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠超聲心動圖指標(biāo)結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組左心室室壁收縮運動減弱乃至消失，左心室腔明顯增大；IVSTd、IVSTs變薄，LVDs、LVDd增大，LVEF、LVFS明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，扶正化瘀組和卡托普利組室壁收縮情況有所增強，左心室腔擴張程度減弱，LVEF、LVFS明顯增高(P<0.05)；扶正化瘀組IVSTs變厚，LVDs變小(P<0.05)，IVSTd變厚，LVDd減小，但無統(tǒng)計學(xué)意義；卡托普利組IVSTd、IVSTs變厚，LVDs減小(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心臟超聲心動圖指標(biāo)比較(±s)

2.2 各組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)TGF-β1表達的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠梗死邊緣區(qū)TGF-β1蛋白表達明顯增加(P<0.01)；扶正化瘀方組、卡托普利組TGF-β1蛋白表達較模型組減少(P<0.01)。詳見圖1、表2。

圖1各組大鼠梗死邊緣區(qū)TGF-β1蛋白表達(×40)

表2 各組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)TGF-β1的表達(±s) μm2

2.3 各組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)smad3、smad4和smad7蛋白表達的影響 與假手術(shù)組相比，模型組smad3、smad4蛋白表達呈增多趨勢，smad7蛋白表達則呈減少趨勢；與模型組比較，扶正化瘀組、卡托普利組smad3、smad4蛋白的表達呈下降趨勢，smad7蛋白的表達呈增高趨勢，僅卡托普利組與模型組比較，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖2、表3。

1為假手術(shù)組； 2為模型組 ； 3為扶正化瘀方組； 4為卡托普利組。

表3 各組大鼠梗死邊緣區(qū)smad3、smad4、smad7蛋白表達比較(±s)

2.4 各組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)TGF-β1、smad3、smad4和smad7mRNA水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)TGF-β1、smad3、smad4 mRNA表達水平升高(P<0.05 或P<0.01)，smad7 mRNA表達水平下降(P<0.05)。與模型組相比，扶正化瘀組和卡托普利組TGF-β1、smad3、smad4的mRNA水平降低 (P<0.05 或 P<0.01)，smad7的mRNA水平增加(P<0.05或P<0.01)。詳見表4。

表4 各組大鼠TGF-β1、smad3、smad4和smad7 mRNA表達水平(±s，2-△△Ct)

3 討 論

超聲心動圖是評估心血管局部纖維化及心肌功能的一項重要無創(chuàng)性診斷技術(shù)[10]，可從回聲增強及運動能力減弱來定性評價心肌瘢痕的形成[11]。實驗結(jié)果顯示，模型大鼠左心室室壁收縮運動減弱乃至消失，室間隔變薄，左心室腔明顯增大，而代表左室收縮功能的LVEF和LVFS顯著下降，提示急性心肌梗死后，模型大鼠有心肌纖維化發(fā)生，出現(xiàn)了離心性左室重構(gòu)和左心室功能障礙。與模型組相比，扶正化瘀膠囊和卡托普利可明顯改善心臟結(jié)構(gòu)和功能，提示二者對大鼠急性心肌梗死后的心肌纖維化心室重構(gòu)、心功能降低都有較好的改善作用。

心肌纖維化是心肌細胞外基質(zhì)過度沉積導(dǎo)致的心臟病理性改變。有研究發(fā)現(xiàn)，心肌纖維化與各種生長因子如TGF-β1產(chǎn)生和分泌密切相關(guān)。TGF-β1超家族是一類重要的生長因子，不僅介導(dǎo)細胞的生長、增殖、分化，而且在創(chuàng)傷愈合、細胞外基質(zhì)的形成等方面具有重要作用。TGF-β1信號通路被認為是組織修復(fù)和纖維化的重要通路[12]。TGF-β1作為心血管系統(tǒng)最重要的異構(gòu)體，參與了心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。外傷、AngⅡ、醛固酮、炎癥刺激等病理情況下，TGF-β1被活化，促使心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，加速細胞外基質(zhì)的合成與分泌，并抑制膠原的降解從而導(dǎo)致心肌纖維化進行性加重[13]。Smads是TGF-β1信號通路中下游主要效應(yīng)分子，包括受體激活型Smads(R-smads)如smad1、smad2、smad3、smad5、smad8，共同通路型smads(Co-smads)如smad4，抑制型smads(I-smads)如smad6、smad7。其中smad2、smad3、smad4、smad7主要參與纖維化的過程。在TGF-β1信號通路中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通過Smad2、Smad3蛋白介導(dǎo)，活化的TGF-β1與細胞膜上的TβR受體結(jié)合形成二聚體復(fù)合物，該二聚體復(fù)合物C末端發(fā)生磷酸化后，與R-Smads蛋白的MH2端結(jié)構(gòu)結(jié)合磷酸化Smad2、Smad3蛋白，磷酸化的Smads蛋白與Co-Smads形成多聚體復(fù)合物共同進入核內(nèi)參與調(diào)控相關(guān)基因的表達[14]。Smad4是TGF-β1必要的信號中轉(zhuǎn)分子，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起承接作用，Smad4不會直接與受體發(fā)生相互作用，但是能直接與DNA結(jié)合來調(diào)控有關(guān)基因的表達；Smad7作為負性調(diào)控因子，可競爭性的與TGFβ受體(TβR)結(jié)合形成受體復(fù)合物，阻止R-Smads的磷酸化，阻斷TGF-β1的細胞內(nèi)效應(yīng)，從而抑制纖維化的發(fā)生[15]。

本實驗結(jié)果顯示，模型大鼠梗死邊緣區(qū)TGF-β1、smad3、smad4及其mRNA表達增加，而smad7及其mRNA表達減少，提示冠脈結(jié)扎8周后，TGF-β1/smads信號通路中促纖維化因子表達增強、抑制纖維化形成的因子減少。給予扶正化瘀膠囊或卡托普利治療后，可提高模型大鼠梗死邊緣區(qū)smad7及其mRNA的表達，降低TGF-β1、smad3、smad4及其mRNA表達。

扶正化瘀膠囊或卡托普利抑制心肌纖維化的作用與其調(diào)控TGF-β1/smads信號通路，增強抑制纖維化的作用密切相關(guān)。但扶正化瘀膠囊是否以TGF-β1/smads信號通路作為抑制膠原產(chǎn)生的中間環(huán)節(jié)以及是否存在其他的靶基因尚待進一步研究。

參考文獻：

[1] Bomb R,Heckle MR,Sun Y,et al.Myofibroblast secretome and its auto-/paracrine signaling[J].Expert Rev Cardiovasc Ther,2016,14(5):591-598.

[2] Akiyama-Uchida Y,Ashizawa N,Ohtsuru A,et al.Norepinephrine enhances fibrosis mediated by TGF-beta in cardiac fibroblasts[J].Hypertension,2002,40(2):148-154.

[3] Gabbiani G.The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases[J].J Pathol,2003,200(4):500-503.

[4] Eckes B,Zigrino P,Kessler D,et al.Fibroblast-matrix interactions in wound healing and fibrosis[J].Matrix Biol,2000,19(4):325-332.

[5] Hao J,Ju H,Zhao S,et al.Elevation of expression of Smads 2,3,and 4,decorin and TGF-beta in the chronic phase of myocardial infarct scar healing[J].J Mol Cell Cardiol,1999,31(3):667-678.

[6] Brooks WW,Conrad CH.Myocardial fibrosis in transforming growth factor beta(1)heterozygous mice[J].J Mol Cell Cardiol,2000,32(2):187-195.

[7] 吳愛明,翟建英,張冬梅，等.扶正化瘀膠囊對心肌梗死大鼠心肌纖維化的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展,2013,13(14):2618-2621.

[8] 劉振,劉玲玲,楊廷桐.兩種大鼠心肌梗死模型的比較研究[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2010,31(4):19-25.

[9] 徐淑云,卞如濂,陳修.藥理實驗方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:203.

[10] 周秘,尹立雪.心肌纖維化的超聲心動圖可視化觀測研究進展[J].四川醫(yī)學(xué),2016,37(1):16-20.

[11] 郭應(yīng)坤,李真林,郜發(fā)寶.心肌纖維化的分子影像學(xué)評價[J].中華核醫(yī)學(xué)與分子影像雜志,2013,33(5):398-400.

[12] Leask A.Potential therapeutic targets for cardiac fibrosis TGFβ,angiotensin,endothelin,CCN2,and PDGF,partners in fibroblast activation[J].Circ Res,2010,106(11):1675-1680.

[13] Terrell TG,Working PK,Chow CP,et al.Pathology of recombinant human transforming growth factor-beta 1 in rats and rabbits[J].Int Rev Exp Pathol,1993,34(Pt B):43-67.

[14] Tandon A,Tovey JC,Sharma A,et al.Role of transforming growth factor Beta in corneal function,biology and pathology[J].Curr Mol Med,2010,10(6):565-578.

[15] Wang B,Omar A,Angelovska T,et al.Regulationu of collagen synthesis by inhibitory Smad7 in cardiac myofbroblasts[J].Am Physiol Heart Circ Physiol,2007,293(2):1282-1290.