黃 琦，季曉娟，徐立鋒

(1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州310023;2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310023)

鄰苯二甲酸酯類(phthalate acid esters，PAEs)增塑劑廣泛應(yīng)用于塑料工業(yè)，普遍存在于食品包裝材料、玩具、醫(yī)用血袋和膠管、個(gè)人護(hù)理用品等數(shù)百種產(chǎn)品中，對(duì)人體的健康有嚴(yán)重的危害。研究表明，PAEs又是一類環(huán)境激素，有類似雌性激素的作用，長(zhǎng)期接觸可干擾內(nèi)分泌，尤其對(duì)于男性，可造成生殖問題［1-3］。PAEs比較容易遷移到環(huán)境中，可通過食品包裝材料遷移到食品中而被人體吸收。近年來，對(duì)于鄰苯二甲酸酯類產(chǎn)生的危害時(shí)有報(bào)道［4］，歐盟、美國(guó)、中國(guó)等國(guó)家和地區(qū)都制定了限制PAEs使用的法律法規(guī)。

黃酒是中國(guó)古老傳統(tǒng)酒種之一，浙江省黃酒尤其是紹興黃酒在國(guó)內(nèi)外久負(fù)盛名。近年來，黃酒中鄰苯二甲酸酯類增塑劑超標(biāo)問題日益引起關(guān)注。黃酒中乙醇含量較高，而乙醇對(duì)PAEs有良好的溶解能力，在黃酒與塑料制品如塑料容器、塑料內(nèi)蓋、塑料接酒桶等的接觸過程中PAEs有遷移到黃酒中的風(fēng)險(xiǎn)。黃酒中 PAEs的測(cè)定方法大多采用 GC-MS 法［5-8］、HPLC 法［9-10］、UPLC 法［11-12］等，這些方法對(duì)儀器要求比較高，而采用微乳毛細(xì)管電動(dòng)色譜法(MEEKC)測(cè)定黃酒中PAEs鮮有報(bào)道。因此，本研究在經(jīng)典微乳體系基礎(chǔ)上加入有機(jī)添加劑乙腈，可分離并同時(shí)測(cè)定12種鄰苯二甲酸酯類增塑劑，將其應(yīng)用于黃酒中PAEs的檢查。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器:SQ-Agilent 7100高效毛細(xì)管電泳儀(美國(guó)Agilent公司);未涂層熔融石英毛細(xì)管:65.2 cm×75 μm，有效長(zhǎng)度57.5 cm(河北永年銳灃色譜器件有限公司);Oasis HLB Glass柱(6 mL/200 mg，美國(guó)Waters公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海予捷儀器有限公司)。

試劑:鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯(DMEP)、鄰苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯(DEEP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二烯丙酯(DAP)、鄰苯二甲酸二異丁酯(DIBP)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP)、鄰苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯(DBEP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DNOP)、鄰苯二甲酸二己酯(DHXP)標(biāo)準(zhǔn)品，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，純度均大于96%;SDS(純度＞98%)，美國(guó)Sigma公司;正己烷(色譜純)，美國(guó)Sigma公司。試驗(yàn)用水為三次重蒸水;試驗(yàn)過程避免接觸塑料容器;黃酒樣品購(gòu)自本地超市。

1.2 溶液的制備

1.2.1 微乳液的制備

緩沖溶液pH值用1 mol/L NaOH和1 mol/L H3PO4溶液調(diào)節(jié)。取SDS、正丁醇、有機(jī)添加劑和油相溶于緩沖液，超聲混合30 min。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液

準(zhǔn)確量取12種鄰苯二甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，用微乳緩沖溶液超聲溶解，定容至100 mL，低溫保存。

1.2.3 樣品的提取、凈化

參考文獻(xiàn)［12］，準(zhǔn)確稱取5.00 g黃酒樣品置25 mL燒杯中，加水稀釋，使乙醇體積分?jǐn)?shù)小于5%。將稀釋液加入活化后的Oasis HLB Glass柱，控制流速1 mL/min，用5 mL 5%甲醇水溶液淋洗，待淋洗液流干，用5 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈?，超聲溶解于微乳緩沖溶液，定容至 1.0 mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，待進(jìn)樣分析。

1.3 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)前分別用0.5 mol/L NaOH、水和緩沖溶液沖洗毛細(xì)管5 min，2次運(yùn)行之間按上述條件重復(fù)沖洗。分離電壓20 kV，進(jìn)樣時(shí)間6 s，進(jìn)樣壓力5.0 kPa，溫度20℃，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 微乳體系的組成

MEEKC中經(jīng)典的微乳體系由質(zhì)量濃度為33.1 mg/mL的SDS、66.1 mg/mL的正丁醇、8.1 mg/mL的正辛烷和體積分?jǐn)?shù)為89.3%的10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值為8.5)組成［13］。pH值會(huì)影響分離度，有機(jī)添加劑能明顯改善分離選擇性，而SDS濃度和水相電解質(zhì)濃度會(huì)對(duì)分離時(shí)間產(chǎn)生影響［14］。在12種鄰苯二甲酸酯類增塑劑中，DIBP、BBP、DBEP和DBP 4種增塑劑較難分離。因此，本試驗(yàn)以經(jīng)典微乳體系作為研究起點(diǎn)，對(duì)影響結(jié)構(gòu)相近物分離的因素進(jìn)行優(yōu)化，使12種鄰苯二甲酸酯類增塑劑得以分離。

2.1.1 緩沖液體積分?jǐn)?shù)

在2～10 mmol/L范圍內(nèi)，隨著磷酸鹽體積分?jǐn)?shù)的增加，12種PAEs的分離度有所改善，工作電流有所增大，但遷移時(shí)間沒有明顯變化。為減少工作電流，選擇6 mmol/L的磷酸鹽-硼砂緩沖液。

2.1.2 pH 值

pH值對(duì)12種PAEs分離度的影響見圖1。由圖1可知，12種PAEs的遷移時(shí)間隨著pH值的增大而有所增加，相鄰PAEs的分離度有所改善。在pH值為9.0時(shí)，12種PAEs均能獲得較好峰形和適宜的分離時(shí)間。綜合考慮分離度、靈敏度和適宜的出峰時(shí)間，選擇pH值為9.0。

圖1 pH值對(duì)分離的影響Fig.1 Effect of pH values on separation

2.1.3 SDS 質(zhì)量濃度

SDS對(duì)形成穩(wěn)定均一的微乳液是非常重要的，并可影響分離的效果。當(dāng)SDS質(zhì)量濃度過高時(shí)，電泳的電流會(huì)產(chǎn)生較大的焦耳熱，工作電流也隨之增加;當(dāng)SDS質(zhì)量濃度降到20 mg/mL時(shí)，微乳液會(huì)變渾濁，導(dǎo)致分離體系不穩(wěn)定。結(jié)合分析時(shí)間和分離效率，仍采用質(zhì)量濃度為33.1 mg/mL的SDS。

2.1.4 有機(jī)添加劑的影響

體積分?jǐn)?shù)為20%以內(nèi)的乙腈和甲醇常作為MEEKC的有機(jī)添加劑［14］。有機(jī)添加劑可以改變被分析物在油相和水相的分配系數(shù)，增加時(shí)間窗口、改善峰形、提高柱效。對(duì)較難分離的 DIBP、BBP、DBEP和DBP，添加乙腈后可明顯改善分離度。由圖2可知，不同乙腈體積分?jǐn)?shù)(4%、8%、12%、16%)對(duì)4種PAEs的分離有明顯改善，綜合考慮出峰時(shí)間和分離度，本試驗(yàn)選擇添加體積分?jǐn)?shù)為12%的乙腈。

圖2 乙腈體積分?jǐn)?shù)對(duì)4種PAEs分離的影響Fig.2 Effect of acetonitrile volume fraction on separation of 4 PAEs

2.1.5 電泳條件

電壓在15～30 kV范圍內(nèi)，隨著電壓的升高，12種PAEs的遷移時(shí)間會(huì)減少，高電壓會(huì)引起焦耳熱問題，因此，選擇分離電壓20 kV。當(dāng)分離溫度為20℃時(shí)，能獲得較好的重現(xiàn)性。

2.1.6 MEEKC 分離條件

通過對(duì)各因素的考察，最終確定的微乳體系為:質(zhì)量濃度為33.1 mg/mL的SDS、66.1 mg/mL的正丁醇、8.1 mg/mL的正辛烷，體積分?jǐn)?shù)為12%的乙腈、77.3%的6 mmol/L磷酸鹽-硼砂緩沖液(pH值為9.0)。分離電壓20 kV，分離溫度20℃，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。在該色譜條件下，12種PAEs標(biāo)準(zhǔn)混合液微乳毛細(xì)管電動(dòng)色譜分離譜圖見圖3，較難分離的DIBP、BBP、DBEP和DBP達(dá)到基線分離。空白黃酒樣品在12種PAEs的出峰時(shí)間范圍內(nèi)無干擾，檢出PAEs的黃酒樣品譜圖見圖4。

圖3 12種PAEs標(biāo)準(zhǔn)混合液的分離譜圖Fig.3 Electropherogram of 12 PAEs by MEEKC

圖4 檢出PAEs的黃酒樣品的微乳電動(dòng)色譜分離譜圖Fig.4 Electropherogram of PAEs in rice wine sample by MEEKC

2.2 樣品的提取、凈化

黃酒中乙醇含量較高，對(duì)PAEs的溶解性較好，需要先降低樣品中酒精含量，清除基質(zhì)中的氨基酸等干擾物。本研究采用文獻(xiàn)［12］的固相提取方法對(duì)黃酒樣品提取、凈化，檢測(cè)時(shí)樣品對(duì)12種PAEs無干擾。

2.3 線性范圍和檢出限

采用外標(biāo)定量法，得到12種 PAEs的線性回歸方程和檢出限(LOD，S/N=3)，結(jié)果見表1。GB 9685—2008《食品容器、包裝材料用添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定食品容器、包裝材料的添加劑中，DBP遷移到食品中的最大量不得超過0.3 mg/kg，DEHP遷移到食品中的最大量不得超過1.5 mg/kg［15］，分別相當(dāng)于1.5μg/mL和7.5μg/mL，高于該方法的檢出限，因此該方法滿足我國(guó)衛(wèi)生部對(duì)食品、食品添加劑中PAEs的最大殘留量檢測(cè)要求。

表1 校準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限Table 1 Calibration curve，linear range and LOD

表1 (續(xù))

2.4 重現(xiàn)性

PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/mL)的日內(nèi)和日間精密度測(cè)定結(jié)果見表2，12種PAEs的遷移時(shí)間和峰面積重現(xiàn)性良好。

表2 方法重現(xiàn)性(n=6)Table 2 Reproducibility(n=6)%

2.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

對(duì)不含PAEs的黃酒樣品，測(cè)定其分別在10、200μg/mL的添標(biāo)水平下的加標(biāo)回收率，結(jié)果見表3。

表3 方法回收率和精密度(n=6)Table 3 Recovery and precision rates(n=6) %

2.6 樣品的檢測(cè)

對(duì)市場(chǎng)上10種黃酒品牌(每種品牌6批)測(cè)定，有1個(gè)品牌樣品檢出DMP、DEP、DIBP、DBP和DEHP 5種PAEs，有1個(gè)品牌樣品檢出DMP、DBP和DEHP等3種PAEs，有2個(gè)品牌樣品檢出DIBP和DEHP等2種PAEs，其余品牌中未檢出PAEs。

3 結(jié)論

本研究在常用微乳毛細(xì)管電動(dòng)色譜的微乳體系中添加乙腈，可使2種PAEs達(dá)到基線分離。試驗(yàn)所用儀器易于普及，試驗(yàn)所用試劑環(huán)境友好。本研究所建立的MEEKC方法能檢測(cè)黃酒中的12種PAEs，方法檢測(cè)限低至0.5μg/mL，精密度和準(zhǔn)確度良好，能滿足黃酒樣品中常見PAEs的限量檢測(cè)要求。

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