陳業(yè)文，胡元灝，程龍，劉俏，晏彪，吳喆

湖北科技學院基礎醫(yī)學研究中心，咸寧 437100

可吸入細顆粒物(PM2.5，空氣動力學直徑≤2.5 μm)對人體的不利影響主要取決于粒徑、成分和濃度，并隨季節(jié)變化[1]，其濃度的升高與過敏性疾病的發(fā)病率有著密切的關系[2-3]。Zhang等[4]對我國4個城市(廣州、武漢、蘭州、重慶)8 000余名小學生的調查表明，PM2.5濃度每升高39 μg·m-3，兒童哮喘的發(fā)病率就會增加1.22%；Chen等[5]應用多重Logistic回歸模型分析了我國6個城市(上海、南京、重慶、長沙、烏魯木齊、太原)30 759名學齡前兒童的過敏癥狀個體水平，其結果發(fā)現，PM2.5年平均濃度每升高10 μg·m-3，過敏性鼻炎(OR=1.2，95%可信區(qū)間為1.11～1.29)、哮喘(OR=1.1，95%可信區(qū)間1.03～1.18)的患病率呈正相關。大量研究表明，PM2.5暴露對兒童過敏性疾病具有重要影響[2-5]，然而PM2.5與過敏性疾病的關聯(lián)尚未完全闡明。

已有研究表明，PM2.5能使巨噬細胞功能失調，并最終誘發(fā)哮喘和其他過敏性疾病[6]。PM2.5主要通過呼吸道進入體內，那些粒徑小于0.1 μm的PM2.5還能直接穿透肺泡進入血液循環(huán)系統(tǒng)。巨噬細胞是該系統(tǒng)中重要的一類靶細胞，有研究指出，PM2.5暴露會使肺泡巨噬細胞出現DNA損傷[7]，誘導肺巨噬細胞發(fā)生炎癥反應[8]；但由于PM2.5的成分復雜，含多種有害物質，加之其暴露毒性可能受多種因素影響，因而其致病機理目前尚無定論[9]。當前，提出的PM2.5的毒性機制較多[10]，主要包括氧化應激，炎癥反應以及先天和后天免疫反應，其中氧化應激可能是公認的機制之一，其他機制均與氧化應激相關[11]。PM2.5由于不規(guī)則以及多棱角，首先進入體內后，會對呼吸道上皮細胞、肺泡細胞、血管內皮細胞均有直接的機械損傷[12]，在此過程中，PM2.5與細胞作用會誘導機體釋放活性氧(ROS)，而ROS的過量產生與呼吸、循環(huán)系統(tǒng)的損傷密切相關[13]。

黃虹等[14]利用人體肺部PM濃度模型定量評估了廣州市夏、冬季抽樣人群PM2.5的日均暴露量發(fā)現，冬季的暴露量大于夏季，未成年人接觸PM2.5的量要比老年人、成年人高。一些研究也指出，未成年人在室內所處的時間較室外長[15]，而且室內PM2.5的濃度有可能高于室外[16]，因而，室內PM2.5對未成年人尤其是那些患有過敏癥狀兒童的影響值得關注。本研究從武漢市洪山區(qū)的5戶患有過敏癥狀兒童的室內采集PM2.5，通過檢測不同劑量PM2.5暴露下小鼠腹腔巨噬細胞的氧化應激水平(ROS、GSH、8-OH-dG)，炎癥因子水平(TNF-ɑ、IL-8β)，并同時聯(lián)合VE進行阻斷，以探究其對小鼠巨噬細胞的氧化損傷作用以及VE在此過程中的抗氧化保護作用。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器與試劑

儀器：AirChek XR5000 PM2.5環(huán)境采樣器(美國SKC)，QMA 石英膜(美國Whatman)，Centrivap?真空離心濃縮儀(美國Labconco)，Power wave XS 酶標儀(美國Bio-Tek)，FLX800熒光酶標儀(美國Bio-Tek)，SW-CJ-2D超凈工作臺(中國蘇州凈化)，TE2000-S倒置顯微鏡(日本Nikon)。

試劑：RPMI 1640 培養(yǎng)基，胎牛血清(Gibco)，二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA，>99.9%，美國Sigma)，硫代巴比妥酸(TBA，分析純)，還原型谷胱甘肽試劑盒(南京建成生物工程研究所)，小鼠8-OH-dG、TNF-α 和IL-8β酶聯(lián)免疫試劑盒(美國eBioscience)，其他化學試劑均為國產分析純。

1.1.2 實驗動物

選用湖北省疾病預防控制中心實驗動物中心提供的SPF級雌性昆明小鼠(6周齡，合格證號：42000600003915)，標準環(huán)境(12 h:12 h光照-黑暗循環(huán)，50%～70% 濕度，溫度為20～25 ℃)飼養(yǎng)1周后取材實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 PM2.5的采集

本研究先對100余戶家庭中10～12歲的兒童進行問卷調查，滿足以下條件：兒童居住時間> 3年，且兒童患有1種或1種以上的過敏性癥狀(如過敏性鼻炎、哮喘)，篩選出5戶家庭作為PM2.5采樣點。用AirChek XR5000 PM2.5采樣器采集，所設置的吸氣流量為1.5 L·min-1，2016年10月至12月期間每日白天無間斷采樣8 h，采樣當時監(jiān)測的室內PM2.5濃度為200～500 μg·m-3，相對濕度范圍為55%～70%，室內溫度變化范圍為17～22 ℃。采集樣品在QMA 石英膜(直徑46.2 mm)上。

1.2.2 PM2.5懸液制備

QMA石英膜經干燥處理后，將濾膜剪成1～2 cm2的小塊，用三蒸水超聲振蕩20 min，去除濾膜。濾液混勻，再經真空離心濃縮儀處理，稱重后，用PBS配成所需濃度，混勻并滅菌，4 ℃保存。實驗時超聲震蕩15 min混勻使用。

1.2.3 巨噬細胞的分離和培養(yǎng)

雌性SPF級KM小鼠實驗前3 d，腹腔注射1 mL 6%可溶性淀粉(可刺激小鼠腹腔產生更多的巨噬細胞)后，按李海濤等[17]的操作步驟獲得巨噬細胞，經HE染色鑒定為巨噬細胞，同時用0.4%臺盼藍(Trypan blue，實驗室常用活體染色劑)染色巨噬細胞5 min，分別3次計數視野內100個細胞中出現藍色細胞的比例，取平均值，巨噬細胞的存活率=1-(4+5+5)/(100×3)=95.3 %。經鑒定后分離出的細胞先鋪板于6孔板2 h后，洗去未貼壁細胞，待細胞計數后調整細胞密度為l×l09個·L-1，移入96孔板中，每孔180 μL，混勻后置于培養(yǎng)箱中待染毒。

1.2.4 PM2.5暴露濃度的選擇與分組

PM2.5與巨噬細胞共培養(yǎng)24 h。PM2.5濃度參考先前的研究[18]選擇為0(對照)，10 μg·mL-1(低劑量)，200 μg·mL-1(高劑量)；50 mg·mL-1的VE作為非酶抗氧化劑。實驗分組如下：(A) 對照組(control, saline)，(B)患過敏癥狀兒童的室內(indoor allergic)10 μg·mL-1PM2.5，(C) 患過敏癥狀兒童的室內(indoor allergic)200 μg·mL-1PM2.5；(D) VE(50 mg·mL-1)；(E)VE(50 mg·mL-1)+患過敏癥狀兒童的室內(indoor allergic)200 μg·mL-1PM2.5。

1.2.5 指標測定

(1)ROS測定：2’,7’-二氯熒光素二乙酸(DCF)被廣泛用于檢測活性氧的生成，用以評估整個氧化應激的潛在毒性[19]。DCFH-DA能穿透細胞膜并被細胞內的水解酯酶分解產生非熒光的DCFH。ROS含量通過監(jiān)測這種熒光變化來衡量，具體方法參考文獻[20]。最終的反應混合物置于黑暗環(huán)境下5 min，然后選擇激發(fā)波長485 nm和發(fā)射波長520 nm，用FLx800熒光酶標儀檢測。

(2)GSH測定：谷胱甘肽可以在黑暗中與二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)反應形成黃色化合物，GSH試劑盒可用來檢測這種顏色變化。然后用酶標儀檢測412 nm 波長下吸光值，根據標準曲線，計算GSH含量(μmol·mL-1)= OD412/0.0023,R2=0.997。

(3)MDA測定：MDA可與TBA反應形成穩(wěn)定的發(fā)色團，實驗方法簡言之，2 mL 0.6% TBA溶解液(10% TCA助溶)與0.5 mL細胞懸液混合，沸水浴15 min，會有粉紅色混合物沉淀生成。隨后快速冷卻，10 000 g離心5 min，收集的上清液，用酶標儀檢測450、532、600 nm 波長下吸光值，MDA 含量(μmol·mL-1)=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450。

(4)DNA損傷分析：暴露后的細胞上清液中所含的8-OH-dG含量使用ELISA試劑盒測定，試劑盒敏感度為0.5 ng·mL-1。

(5)TNF-α和IL-8β的檢測：本實驗中巨噬細胞上清液中TNF-α 和IL-8β的含量通過ELISA試劑盒檢測，TNF-α、IL-8β試劑盒靈敏度都為8.0 pg·mL-1。

1.2.6 統(tǒng)計學分析

數據采用平均值(mean)±標準差(SEM)。組間的差異分析通過單向方差分析(ANOVA)結合t檢驗(Tukey test)確定，P< 0.05、P< 0.01為差異顯著。統(tǒng)計圖表使用GraphPad Prism 5.0軟件繪圖。

2 結果(Results)

2.1 PM2.5影響小鼠腹腔巨噬細胞的形態(tài)

圖1顯示PM2.5暴露24 h后小鼠腹腔巨噬細胞的形態(tài)變化，對照組的巨噬細胞呈圓型或橢圓(圖1A)，有偽足狀突起，而PM2.5暴露組的巨噬細胞偽足狀突起消失或并不明顯(圖1B、1C)；且隨著PM2.5濃度的增大，核質比明顯增大(圖1B、1C)。從圖1E可以看出，與200 μg·mL-1PM2.5組比較，VE (50 mg·mL-1) + 200 μg·mL-1PM2.5組雖有一定程度的皺縮，但巨噬細胞的數量明顯較多。

圖1 PM2.5暴露24 h后巨噬細胞的形態(tài)圖(Giemsa染色，×20)注：(A)對照組(control, saline)，(B)患過敏癥狀兒童的室內(indoor allergic)10 μg·mL-1 PM2.5，(C)患過敏癥狀兒童的室內(indoor allergic)200 μg·mL-1 PM2.5；(D)VE(50 mg·mL-1)；(E)VE(50 mg·mL-1)+患過敏癥狀兒童的室內(indoor allergic)200 μg·mL-1 PM2.5。Fig. 1 Morphology of macrophages after exposure to PM2.5 for 24 h (stained with Giemsa, ×20 magnification)Note: (A) Control (saline); (B) allergic 10 μg·mL-1 PM2.5; (C) allergic 200 μg·mL-1 PM2.5; (D) VE (50 mg·mL-1); (E) VE (50 mg·mL-1) + allergic 200 μg·mL-1 PM2.5.

圖2 PM2.5對小鼠巨噬細胞ROS的影響 (n = 5)注：與對照組比較，**P < 0.01；與混合組(PM2.5+ VE)比較，# # P< 0.01。Fig. 2 ROS level of macrophages induced by different concentrations of PM2.5 after 24 h (n=5)Note: **P< 0.01, compared with control; # # P< 0.01, VE (50 mg·mL-1) + 200 μg·mL-1 PM2.5 group compared with 200 μg·mL-1 PM2.5 group.

圖3 PM2.5對小鼠巨噬細胞GSH的影響(n = 5)注：與對照組相比，**P< 0.01。Fig. 3 GSH level of macrophages induced by different concentrations of PM2.5 after 24 h (n=5)Note: ** P< 0.01, compared with control.

2.2 PM2.5誘導ROS生成和GSH衰減

ROS是氧化應激最重要的生物標志物，而GSH是氧化應激過程中的清除劑，可以清除活性氧分子(如·OH等)，防止氧化，但自身也會隨之被消耗。細胞內PM2.5誘導ROS生成的結果如圖2所示，ROS水平在PM2.5暴露24 h后增加非常顯著(P< 0.01)。與200 μg·mL-1PM2.5組比較，VE (50 mg·mL-1) + allergic 200 μg·mL-1PM2.5組ROS含量下降，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)。從圖3可以看出，與對照組比較，200 μg·mL-1PM2.5組GSH含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)；與200 μg·mL-1PM2.5組比較，VE (50 mg·mL-1) + 200 μg·mL-1PM2.5組GSH含量升高。

2.3 PM2.5誘導脂質過氧化

ROS過量誘導的另一個主要結果是會導致脂質過氧化反應，而脂質過氧化會進一步損傷細胞。MDA是脂質過氧化的終產物，因而MDA濃度的變化可以指示脂質過氧化的損傷程度。從圖4可以看出，10 μg·mL-1和200 μg·mL-1PM2.5組的MDA水平增加顯著(P< 0.01)。與200 μg·mL-1PM2.5組比較，VE (50 mg·mL-1) + 200 μg·mL-1PM2.5組MDA含量下降，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)。

2.4 PM2.5誘導DNA損傷

8-OH-dG作為DNA氧化損傷的敏感指標，可用來反映PM2.5誘導DNA損傷的程度。如圖5所示，與對照組比較，200 μg·mL-1PM2.5組的8-OH-dG水平增加，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。

2.5 PM2.5誘導炎癥因子釋放

TNF-α和IL-8β，是2種非常重要的炎癥因子，通過檢測它們含量的變化可以間接評估PM2.5對巨噬細胞炎癥反應的影響。TNF-α的結果如圖6所示，與對照組比較，200 μg·mL-1PM2.5組的有顯著差異(P< 0.01)，與200 μg·mL-1PM2.5組比較，VE (50 mg·mL-1) + 200 μg·mL-1PM2.5組TNF-α水平有降低的趨勢。IL-8β的結果如圖7所示，該結果顯示的趨勢與TNF-α的相同，即與對照組相比，200 μg·mL-1PM2.5組的發(fā)生了顯著變化(P< 0.05)。

圖4 PM2.5對巨噬細胞MDA的影響(n = 5)注：與對照組比較，**P< 0.01；與混合組(PM2.5+ VE)比較，# # P< 0.01。Fig. 4 MDA level of macrophages induced by different concentrations of PM2.5 after 24 h (n=5)Note: **P< 0.01, compared with control; # #P< 0.01, VE (50 mg·mL-1) + 200 μg·mL-1 PM2.5 group compared with 200 μg·mL-1 PM2.5 group.

圖5 PM2.5對巨噬細胞8-OH-dG的影響 (n=5)注：與對照組相比，* P< 0.05。Fig. 5 8-OH-dG level of macrophages induced by different concentrations of PM2.5 after 24 h (n = 5)Note: *P< 0.05, compared with control.

圖6 PM2.5對巨噬細胞TNF-α的影響(n = 5)注：與對照組相比， ** P< 0.01。Fig. 6 TNF-α level of macrophages induced by different concentrations of PM2.5 after 24 h (n = 5)Note: ** P< 0.01, compared with control.

圖7 PM2.5對巨噬細胞IL-8β的影響 (n = 5)注：與對照組相比，*P< 0.05。Fig. 7 IL-8β level of macrophages induced by different concentrations of PM2.5 after 24 h (n = 5)Note:* P< 0.05, compared with control.

3 討論(Discussion)

近些年國外的權威研究調查表明[21]，主要空氣污染物包括PM2.5與兒童過敏性疾病之間存在著一定的聯(lián)系：過敏性癥狀與PM2.5的暴露程度有關[22]。Rojasbracho等[23]的研究表明，室內PM2.5濃度與個人行為顯著相關，更高的污染風險可能對個體健康產生較為嚴重的影響。根據本實驗結果，暴露于更高水平的室內PM2.5有可能會增加細胞損傷的風險。細胞形態(tài)學結果顯示，小鼠腹腔巨噬細胞的數量會隨著PM2.5暴露濃度的增加而降低，其多偽足狀突起的形態(tài)特征逐漸消失。PM2.5暴露劑量由10 μg·mL-1增加到200 μg·mL-1，反映氧化應激和炎癥反應的指標也均表現出一定的劑量依賴關系，隨著ROS含量的累積，還原性GSH的含量相應地損耗，脂質過氧化產物MDA含量增加，8-OH-dG水平增加，IL-8、TNF-α的表達量增加。

研究表明，通過氧化應激介導的炎癥反應可能是PM2.5潛在毒性的致病機制之一[11]。有研究指出，PM2.5自身含有大量的半醌類自由基，且這些自由基通過激活ROS聚集對DNA造成損傷[24]。ROS可以由細胞接觸PM2.5后直接通過氧化還原生成，也可以間接通過細胞與PM2.5交互作用生成[11]。細胞受到外來異物PM2.5刺激后，伴隨ROS的積累，細胞會出現不同程度的損傷，機體隨之會作出即時的反應，激活免疫細胞(如巨噬細胞)釋放出大量的促炎癥細胞因子，如IL-8、TNF-α[25]。這些細胞因子的及時分泌對機體免受PM2.5傷害是有利的，然而，長期的炎癥反應則相當不利，如：低濃度TNF-α對機體的自我平衡功能(如組織修復、啟動凋亡)是重要的，而其整體水平隨炎癥的增強而增強，TNF-α的過剩則可能會導致嚴重的組織損傷[26]。許多呼吸道疾病(哮喘、慢性阻塞性肺病)可以追溯到炎癥相關細胞因子高水平的活化[27]，氧化應激過程通過協(xié)同作用能有效激活促炎癥因子(如IL-8、TNF-α等)的表達，涉及的信號通路主要有激活氧化還原致敏因子的蛋白激酶(MAPK)途徑和核轉錄因子(nuclear factor-κB，NF-κB)途徑[28]。如：在呼吸系統(tǒng)疾病(如慢性呼吸疾病和哮喘)中，PM2.5能通過核轉錄因子依賴(NF-κB-dependent)途徑、核轉錄因子抑制(IκB-independent)途徑促進IL-8的釋放[11]。

本研究顯示，較高劑量(≥200 μg·mL-1)PM2.5暴露后的小鼠巨噬細胞出現氧化損傷，并伴有炎癥反應；VE在該應激過程中起著一定的保護作用。雖然實驗小鼠與人體存在差異，但結果仍有一定參考價值；由于PM2.5的復雜性，其造成損傷的機制有待進一步研究。

通訊作者簡介：晏彪(1988-)，男，碩士，助教，主要從事環(huán)境醫(yī)學和環(huán)境毒理學方面的研究。

共同通訊作者簡介：吳喆(1983-)，女，碩士，講師，主要研究方向為基礎醫(yī)學。

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