潘麗，魏倩，高霞，石影，鄭愛，薛紅麗，李芝蘭,*

1. 蘭州大學公共衛(wèi)生學院，蘭州730000 2. 蘭州市婦幼保健院，蘭州730000

丙烯腈(acrylonitrile，ACN)是石化工業(yè)中合成腈綸纖維等高分子材料的重要中間單體[1]，屬于高毒類有機氰化物。Abo-Salem等[2]用50 mg·kg-1ACN對雄性Wistar大鼠染毒后，發(fā)現血清AST、ALT、直接膽紅素、總膽紅素升高，肝匯管區(qū)炎癥、組織混亂，肝細胞毗鄰的匯管區(qū)出現氣球樣變，淋巴細胞浸潤及脂肪滴，Guang等[3]對大鼠ACN灌胃染毒后，發(fā)現大鼠肝臟組織MDA含量升高，CAT活性降低，GSH含量降低；金娜[4]對小鼠的研究也得到相似的結果，提示ACN可通過擾亂機體的氧化平衡狀態(tài)，誘導實驗動物肝組織損傷。彗星實驗發(fā)現ACN染毒劑量與肝細胞DNA拖尾率存在劑量-反應關系，提示ACN可造成肝細胞DNA損傷[5]。

氧化應激是指因抗氧化機制受損引發(fā)的自由基和活性氧與蛋白、脂質及核酸等體內高分子反應，致使后者的結構功能出現損害的狀態(tài)[6]。內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是指當外界毒物或刺激引起內質網(endoplasmic reticulum，ER)的內環(huán)境發(fā)生改變，導致ER內未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白堆積，ER為了應對其內環(huán)境的改變而發(fā)生的應激反應。最近幾年的相關研究發(fā)現，大多數物質引起的肝臟損傷與氧化應激有關[7-8]，而氧化應激的產物ROS，可通過氧化內質網膜，影響內質網膜上Ca2+離子泵的功能，引起細胞內Ca2+平衡紊亂，誘發(fā)ERS和細胞凋亡[9]，故氧化應激是ERS的敏感因子。體外實驗研究發(fā)現ERS誘導劑毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG)及布雷菲爾德菌素 A(blefeldans A，BFA)誘導的海馬神經元細胞凋亡與細胞內ROS的積累有關，且芹菜素(apigenin，AP)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)、GSH等抗氧化劑可明顯通過抑制ROS的產生而降低TG及BFA引起的ERS，提示TG及BFA誘導海馬神經元細胞ERS是通過ROS的積累產生氧化應激所致，AP可通過抗氧化的作用抑制ERS引起的細胞凋亡和ERS相關蛋白的表達[10]，認為氧化應激可誘導ERS的產生。當發(fā)生ERS時，細胞可依賴相應的信號轉導調節(jié)機制來應對ERS以保證細胞的正常功能。但當應激反應過強，機體無法完成損傷修復時，則啟動相應的凋亡通路誘導細胞凋亡的發(fā)生。NAC是L-半胱氨酸的乙?；衔铮赏ㄟ^干擾自由基的生成和清除已生成自由基來發(fā)揮抗氧化作用，增加機體應對氧化應激的能力。

近年來的研究發(fā)現，許多肝臟疾病的發(fā)病機制與ERS誘導的細胞凋亡相關[11]，而關于ACN引起的肝損傷是否與ERS有關，目前尚未見報道。故本文以ACN對SD大鼠慢性染毒，同時設定N-乙酰半胱氨酸(NAC)干預組，探討ACN慢性染毒引起大鼠肝臟氧化損傷對ERS信號通路的影響，為ACN肝臟毒性機制深入研究提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物及分組

SPF級成年健康雄性SD大鼠50只，體重250～300 g，由甘肅中醫(yī)藥大學醫(yī)學實驗動物中心提供(動物合格證號：SCXK(甘)2011-0001)，適應性飼養(yǎng)1周后，按照體重隨機分為5組，每組10只，以12.5、25.0、50.0 mg·kg-1ACN[12]灌胃染毒，NAC組先用300.0 mg·kg-1NAC灌胃30 min后再灌50.0 mg·kg-1ACN[13]，以玉米油(0.5 mL·(100 g)-1)作為陰性對照組，1次每天、6天每周，共計13周。大鼠染毒期間實驗室溫度(22±1)℃，濕度50%，晝夜交替各12 h，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 試劑

丙烯腈(分析純，純度>99%)購于天津四通化工廠，NAC購買于美國Amresco公司，GSH、GSH-Px、MDA、SOD、CAT試劑盒購于南京建成生物工程研究所，BCA蛋白定量試劑盒購于上海碧云天生物有限公司，GRP78一抗(兔抗大鼠)、CHOP一抗(小鼠抗大鼠)、caspase-12一抗(兔抗大鼠)購于美國SAB公司，GAPDH一抗(兔抗大鼠)購于美國Abcam公司，β-tubulin一抗(兔抗大鼠)、HRP標記的山羊抗兔二抗、HPR標記的山羊抗小鼠二抗購于Elabscience公司，引物由上海生物工程有限公司設計合成。

1.3 氧化還原相關酶的測定

染毒結束后，處死大鼠。每組隨機選取6只大鼠，稱取100～200 mg肝臟組織按重量(g)：勻漿介質(mL)=1:9的比例充分研磨，低溫離心(4 ℃，2 500 r·min-1，10 min)后分裝上清，按照試劑盒操作說明的步驟完成氧化還原酶指標的測定。

1.4 RT-PCR檢測步驟

實驗開始前將所需實驗器材高壓滅菌，采用Trizol法提取肝臟總RNA，0.1% DEPC水溶解 RNA后測定RNA濃度并定量至500 ng·μL-1備用。根據20 μL RNA反轉錄反應體系(Total RNA 10 μL，RNase Free dH2O 6 μL，5×PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time 4 μL)條件，42 ℃反轉錄反應60 min后70 ℃加熱5 min終止反應，完成肝臟RNA反轉錄為cDNA。采用實時熒光定量PCR檢測肝臟組織GRP78、PERK、CHOP、caspase-12、β-actin mRNA表達水平(引物序列見表1)，PCR反應體系為20 μL，反應條件為95 ℃預變性2 min，95 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，40個循環(huán)。最后采用Pfaffl法分析mRNA的相對表達量[14]。

1.5 Western Blot檢測步驟

提取肝臟組織蛋白進行定量與變性制備蛋白樣品，進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結束后將目的蛋白轉移至PVDF膜上，4 ℃、200 mA轉膜75 min后220 mA轉膜75 min。在TBST配制的5%脫脂奶粉中封閉3 h，4 ℃水平搖床過夜孵育一抗(GRP78、CHOP、caspase-12、GAPDH、β-tubulin*由于實驗中目的蛋白分子量與內參蛋白分子量接近，選擇一個內參蛋白無法區(qū)分，所以實驗選擇GAPDH、β-tubulin 2個內參蛋白。蛋白一抗用含5%脫脂奶粉的TBST稀釋，稀釋比例分別為1:500、1:1000、1:500、1:2000、1:1000)，TBST漂洗5次，每次5 min，室溫水平搖床孵育二抗2 h后(山羊抗兔單克隆二抗稀釋比例為1:2000，山羊抗小鼠單克隆二抗稀釋比例為1:4000，二抗均用5%TBST稀釋)，取出目的蛋白條帶，TBST漂洗5次，每次5 min。將目的蛋白的PVDF膜放置在凝膠成像曝光儀中滴加ECL發(fā)光液曝光，保存目的蛋白條帶，采用Image J圖像分析軟件進行蛋白條帶灰度值分析，目的蛋白相對表達量的計算公式為：

1.6 統計分析

2 結果(Results)

2.1 ACN染毒及NAC干預對大鼠肝臟抗氧化能力及脂質過氧化的影響

單因素方差分析結果顯示，低、中ACN組大鼠肝臟GSH含量與對照組比較均降低(P<0.05)；低ACN組大鼠肝臟GSH-Px活力與對照組比較升高(P<0.05)。低、高ACN組大鼠肝臟SOD活力及MDA含量與對照組比較均升高(P<0.05)。中、高ACN組大鼠肝臟CAT活力與對照組比較均降低(P<0.05)。NAC干預后可逆轉ACN誘導的大鼠肝臟GSH含量、MDA含量及SOD活力的改變。結果見表2。

2.2 ACN染毒及NAC干預對大鼠肝臟ERS相關基因表達水平的影響

RT-PCR結果顯示，高ACN組大鼠肝臟GRP78、CHOP、caspase-12 mRNA表達水平與對照組比較均升高(P<0.05)；低、中ACN組大鼠肝臟GRP78、CHOP mRNA表達水平與對照組比較均升高(P<0.05)。NAC干預后，大鼠肝臟CHOP、caspase-12 mRNA表達水平與高ACN組比較均降低(P<0.05)。結果見表3。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

表2 丙烯腈(ACN)染毒及N-乙酰半胱氨酸(NAC)干預對大鼠肝臟抗氧化能力及脂質過氧化的影響Table 2 Effects of acrylonitrile (ACN) on oxidative damage and lipid peroxidation and the intervention in effects of N-acetylcysteine (NAC) in rats liver

注：與對照組比較，*P<0.05，與高ACN組比較，#P<0.05。

Note: compared with control,*P<0.05; compared with high ACN group,#P<0.05.

表3 ACN染毒及NAC干預對大鼠肝臟內質網應激(ERS)相關基因表達水平的影響Table 3 Effect of ACN on expression of endoplasmic teticulum stress (ERS) related genes and the intervention in effects of NAC in rats liver

注：與對照組比較，*P<0.05，與高ACN組比較，#P<0.05。

Note: compared with control,*P<0.05; compared with high ACN group,#P<0.05.

2.3 ACN染毒及NAC干預對大鼠肝臟ERS相關蛋白表達水平的影響

Western Blot結果顯示，高ACN組大鼠肝臟GRP78、CHOP、caspase-12蛋白表達水平與對照組比較均升高。NAC干預后，大鼠肝臟GRP78、CHOP、caspase-12蛋白表達水平與高ACN染毒組比較均降低。結果見表4。

3 討論(Discussion)

圖1 ACN染毒及NAC干預對大鼠肝臟內質網應激相關蛋白表達水平的影響的免疫印記圖Fig. 1 Western Blot analysis on effect of ACN on expression of ERS related proteins and the intervention in effects of NAC in rats liver

分組(Groups)GRP78CHOPcaspase-12對照組(Control)0.47±0.080.76±0.060.75±0.08高ACN組(50.0 mg·kg-1 ACN)0.93±0.13*1.05±0.10*1.07±0.13*NAC組(300 mg·kg-1 NAC+50 mg·kg-1 ACN)0.60±0.20#0.77±0.12#0.86±0.16#F16.14620.22110.179P0.0000.0000.002

注：與對照組比較，*P<0.05，與高ACN組比較，#P<0.05。

Note: compared with control,*P<0.05; compared with high ACN group,#P<0.05.

內質網是機體內蛋白質合成、折疊及運輸場所，也是細胞內Ca2+儲存的主要場所[19]。在紫外線、缺氧、營養(yǎng)物質缺乏、病毒、氧化應激、毒性物質等各類理化因素存在的情況下可損傷內質網的功能從而誘發(fā)ERS[20]。正常狀態(tài)下，內質網中存在的分子伴侶葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein，GRP78)與內質網膜上的雙鏈RNA樣內質網激酶(double-stranded RNA like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、活化轉錄因子6(activating transcription factor-6，ATF6)和肌醇需要酶1(inositol-requiring enzyme-1，IRE1)3種跨膜蛋白相互結合而沒有活性，當ERS發(fā)生時，大量的未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白將會在內質網腔內聚集而擾亂內質網的正常功能，此時GRP78將與3種跨膜蛋白發(fā)生解離，轉而去結合堆積的未折疊或錯誤折疊蛋白，起到協助蛋白折疊的功能，降低ERS，因此GRP78已被廣泛認為是ERS發(fā)生的標志性分子[21]。同時，與GRP78解離的3種感受蛋白被暴露激活，通過PERK、ATF6、IRE1這3種途徑啟動ERS。ERS作為細胞自我保護機制，正常情況下參與機體應對外在刺激的多重信號傳導及基因網絡調控，具有保護細胞維持其免受損傷的作用，但當ERS過度時，可通過多種方式導致細胞信號錯誤[22]，反而激活ERS相關的凋亡蛋白CHOP及caspase-12等，導致細胞凋亡[23]。CHOP是一種ERS特異性轉錄因子[24]，也是ERS介導細胞由抗凋亡向促凋亡轉化的重要信號分子[25]。ERS過強時，可通過 IRE-1、PERK 和 ATF6 的活化促進 CHOP 的大量表達，進而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達，使細胞對ERS的敏感性增加，促進凋亡[26]；caspase-12是一類鼠源性的內質網膜結合蛋白，正常情況下，caspase-12以無活性的酶原形式(procaspase-12)存在，當活化之后轉變?yōu)橛谢钚缘腸aspase-12，可介導細胞凋亡過程，其機制是活化后的caspase-12 進一步激活ERS分子caspase-9，活化后的caspase-9 有效切割和活化下游的caspase-3，最終引起細胞凋亡，因此caspase-12被認為是ERS介導凋亡路徑的重要標志物[27]。ERS發(fā)生后，GRP78與復合物分離，轉而去結合堆積在內質網腔內的未折疊蛋白，從而使caspase-12暴露活化，啟動細胞凋亡途徑[28]。本研究中，ACN染毒后上調肝臟GRP78 mRNA及蛋白表達水平啟動ERS，再通過上調CHOP、caspase-12 mRNA及蛋白表達水平啟動了ERS相關凋亡通路，認為ACN引起的大鼠肝臟氧化損傷可能是誘導肝臟ERS發(fā)生的原因之一。NAC干預后，可明顯下調肝臟GRP78、CHOP、caspase-12 mRNA及蛋白表達水平而阻止ERS的發(fā)生，進一步說明ACN引起的大鼠肝臟氧化損傷是引起ERS發(fā)生的原因之一。

致謝：感謝北京大學公共衛(wèi)生學院崔富強研究員在文章修改中給予的幫助。

通訊作者簡介：李芝蘭(1962-)，女，碩士研究生導師，教授，蘭州大學公共衛(wèi)生學院兒少衛(wèi)生與婦幼保健學研究所所長，研究方向為婦女勞動衛(wèi)生與生殖健康。

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