茍安娜，潘新雨，柏丁丁，鐘 凱，冉 云，黃毅娜,*，高 鴻

（1.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川 成都 610065；2.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，四川 成都 610041）

野陽(yáng)合（Habenaria ciliolaris Kranzl）又名毛葶玉風(fēng)花，屬于雙子葉蘭科植物，分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域及以南的湖南、四川等地區(qū)，其含蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、維生素及礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分，深受當(dāng)?shù)鼐用竦那嗖A。據(jù)《新華本草綱要》記載，野陽(yáng)合具有滋陰補(bǔ)腎、消炎消腫等藥用功效，對(duì)便秘、糖尿病等的治療有輔助作用。然而，目前關(guān)于野陽(yáng)合生物活性方面的研究較少。

花色苷是花青素與糖以糖苷鍵結(jié)合而成的一類(lèi)化合物，是植物中色素最適宜的存在形式[1]，具有類(lèi)黃酮物質(zhì)的典型結(jié)構(gòu)[2-3]。它不僅能賦予植物色彩[4-5]，還是非常有效的天然抗氧化劑[6-8]，其清除自由基的能力是VC的20 倍[9]。除此之外，花色苷還具有預(yù)防心血管疾病[10]、抗腫瘤[11]、調(diào)節(jié)血糖血脂[12]、抑菌[13]和抗炎[14]等多種生理功能。因而，花色苷在醫(yī)療、食品和化妝品等領(lǐng)域極具應(yīng)用前景。

近年來(lái)，對(duì)花色苷的研究主要集中于對(duì)富含花色苷植物中花色苷種類(lèi)的定性定量分析、提取方式的優(yōu)化以及花色苷生理功能的研究，但常見(jiàn)富含花色苷的藍(lán)莓、黑加侖等植物價(jià)格較昂貴，因此含花色苷的平價(jià)植物逐漸走進(jìn)研究視野。野陽(yáng)合多作為地方野菜，價(jià)格低廉，含多種營(yíng)養(yǎng)成分，其顏色呈紫色，推測(cè)其含有花色苷，但目前鮮有對(duì)野陽(yáng)合花色苷的研究。本研究采用酸化乙醇提取野陽(yáng)合花色苷，測(cè)定花色苷含量并定性分析花色苷的組成，測(cè)定野陽(yáng)合花色苷提取物（anthocyanins extract of H. ciliolaris Kranzl，HAE）對(duì)2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除能力，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞存活率、細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度及細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的水平，研究HAE對(duì)過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞（V79-4細(xì)胞）氧化損傷的保護(hù)作用，為野陽(yáng)合的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用野陽(yáng)合采自四川雅安，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)徐正君教授鑒定。于-20 ℃冷凍貯藏。

V79-4細(xì)胞 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心；DMEM（Dulbecco’s modified Eagle medium）細(xì)胞培養(yǎng)基 美國(guó)Hyclone公司；沒(méi)食子酸、福林-酚（Folin-Ciocalteu）試劑 成都科龍化工試劑廠(chǎng)；ABTS大連美侖生物技術(shù)有限公司；DPPH 上海晶純生化科技股份有限公司；水溶性VE（Trolox）、噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）、十二烷基硫酸鈉、硫代巴比妥酸、2’,7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉（2',7'-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA） 美國(guó)Sigma公司；乙醇、濃鹽酸、亞硝酸鈉、碳酸鈉、醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、雙氧水等（均為分析純） 成都科龍化工試劑廠(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-6AD高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng) 日本島津公司；色譜柱（SB-C18，250 mm×4.6 mm ，5 μm） 美國(guó)安捷倫公司；SPECTRA MAX190酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；LGJ-50F冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；MCO-15AC細(xì)胞培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司；TU-1901雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；API 3200電噴霧質(zhì)譜 德國(guó)姆施塔特應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；Varioskan Flash熒光酶標(biāo)儀美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 HAE的制備

挑選野陽(yáng)合凍果，解凍后除去雜質(zhì)與葉梗，稱(chēng)取10 g磨碎，采用0.1 mol/L鹽酸與無(wú)水乙醇（40∶60，V/V）以固液比1∶20（m/V）、浸提溫度20 ℃及浸提時(shí)間120 min的條件避光提取，溶液過(guò)濾并定容至200 mL，得到野陽(yáng)合花色苷提取液，避光保存，備用。將提取液冷凍干燥后得到HAE，避光保存，備用。

1.3.2 總酚含量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[15-16]的方法并稍作修改。將1.3.1節(jié)中制得的25.0 mg HAE溶于1.0 mL甲醇中，取0.1 mL與7.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的Na2CO3溶液1.5 mL混合，搖勻。靜置2 min后，加入用蒸餾水對(duì)倍稀釋?zhuān)╒/V）的Folin-Ciocalteu試劑0.9 mL，充分混合后，加入5.0 mL蒸餾水定容，室溫避光靜置30 min，測(cè)定反應(yīng)液在750 nm波長(zhǎng)處的吸光度。以乙醇為空白對(duì)照，以沒(méi)食子酸當(dāng)量計(jì)算野陽(yáng)合中的總酚含量?；貧w方程為y＝0.000 8x-0.013 3，R2＝0.999，其中y為吸光度，x為沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

1.3.3 花色苷質(zhì)量濃度的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[17]的方法，采用雙波長(zhǎng)pH示差法。取1.3.1節(jié)中野陽(yáng)合花色苷提取液1 mL，分別加入pH 4.5的0.4 mol/L醋酸鈉緩沖液或pH 1.0的0.25 mol/L氯化鉀緩沖液4.0 mL，搖勻，避光靜置120 min，轉(zhuǎn)入1 cm石英比色皿中，以蒸餾水為空白對(duì)照，采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)分別在520 nm和700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。以矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷當(dāng)量表示花色苷質(zhì)量濃度，并根據(jù)式（1）計(jì)算野陽(yáng)合中的花色苷質(zhì)量濃度。

式中：A為最終吸光度，A＝（A520nm-A700nm）pH1.0-（A520nm-A700nm）pH4.5；摩爾質(zhì)量M為449.2 g/mol；摩爾吸光系數(shù)ε為26 900 L/（mol·cm）；L為比色皿光路長(zhǎng)/cm；n為稀釋倍數(shù)。

1.3.4 HAE組成分析

稱(chēng)取HAE 2.0 mg，溶于1.0 mL乙醇中，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，得到待測(cè)液。參考文獻(xiàn)[18]的方法，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（high performance liquid chromatographymass spectrometry，HPLC-MS）進(jìn)行分析。

HPLC條件：SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)520 nm；進(jìn)樣量20 μL；梯度洗脫：A相：水（5%甲酸），B相：甲醇。洗脫程序：0～2 min，5% B；2～10 min，5%～20% B；10～15 min，20% B；15～30 min，20%～25% B；30～35 min，25% B；35～50 min，25%～33% B；50～55 min，33% B；55～65 min，33%～36% B；65～70 min，36%～45% B；70～75 min，45%～53% B；75～80 min，53%～55% B；80～84 min，55%～70% B；84～88 min，70%～5% B；88～90 min，5% B。

MS分析條件：光電二極管陣列檢測(cè)器掃描范圍為200～800 nm。大氣壓電噴霧離子源，正離子模式，毛細(xì)管電壓1.50 kV，錐孔電壓50 V，離子源溫度105 ℃，脫溶劑氣溫度420 ℃，錐孔氣流量45 L/h，脫溶劑氣流量530 L/h。

1.3.5 ABTS+·清除能力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[19-20]的方法，7.00 mmol/L ABTS水溶液和2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀于室溫暗處避光孵育15～18 h，制得ABTS基準(zhǔn)液。取適量ABTS基準(zhǔn)液，用蒸餾水將其稀釋至A734nm為0.700±0.005，制得工作液。

將不同花色苷質(zhì)量濃度（28.64、14.32、7.16、3.58、1.79 μg/mL）的HAE溶液50 μL與ABTS工作液200 μL混合，充分振蕩，室溫避光孵育30 min，于波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光度。以VC和Trolox作為陽(yáng)性對(duì)照，按照公式（2）計(jì)算ABTS+·的清除率。

式中：A1表示實(shí)驗(yàn)組吸光度；A0表示空白對(duì)照組吸光度；AB表示背景吸光度。

1.3.6 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[19-20]的方法，采用乙醇溶液作為溶劑，配制濃度為0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液，避光保存。

將不同花色苷質(zhì)量濃度（28.64、14.32、7.16、3.58、1.79 μg/mL）的HAE溶液100 μL與DPPH自由基溶液100 μL混合，充分振蕩，室溫避光孵育30 min，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度，以VC和Trolox作為陽(yáng)性對(duì)照，按照公式（3）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：A1表示實(shí)驗(yàn)組吸光度；A0表示空白對(duì)照組吸光度；AB表示背景吸光度。

1.3.7 細(xì)胞培養(yǎng)

選用V79-4細(xì)胞，以含10%胎血牛清、100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代時(shí)小心吹起細(xì)胞，并制成單細(xì)胞懸液[21]。

1.3.8 HAE對(duì)H2O2誘導(dǎo)V79-4細(xì)胞氧化損傷的影響

參考文獻(xiàn)[22-23]并稍微修改，體外建立H2O2誘導(dǎo)V79-4細(xì)胞氧化損傷模型，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的V79-4細(xì)胞，以1.2×105個(gè)/mL接種于96 孔板中；培養(yǎng)16 h后，吸出全部原培養(yǎng)液，正常對(duì)照組和H2O2損傷組加入培養(yǎng)基，樣品處理組分別加入劑量為50、100、200 μg/mL的HAE溶液。處理1 h后，正常對(duì)照組加入培養(yǎng)基，H2O2損傷組和樣品處理組加入含1 mmol/L H2O2的培養(yǎng)基。在37 ℃下處理20 h后，加入20 μL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT，37 ℃孵育4 h后停止培養(yǎng)，吸出上清液，每孔加入二甲基亞砜，于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。每個(gè)劑量5 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3 次，另設(shè)無(wú)細(xì)胞空白孔以消除培養(yǎng)基對(duì)OD值的影響。

1.3.9 HAE對(duì)H2O2誘導(dǎo)V79-4細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

參考文獻(xiàn)[24]并稍微修改，采用硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）含量衡量細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的V79-4細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL接種于96孔板中；培養(yǎng)16 h后，吸出全部原培養(yǎng)液，正常對(duì)照組和H2O2損傷組加入培養(yǎng)基，樣品處理組分別加入劑量為50、100、200 μg/mL的HAE溶液。處理1 h后，正常對(duì)照組加入培養(yǎng)基，H2O2損傷組和樣品處理組加入含1 mmol/L H2O2的培養(yǎng)基。孵育1 h后，細(xì)胞用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗，均質(zhì)重懸于預(yù)冷的1.15% KCl溶液中。取出100 μL的細(xì)胞溶解物，加入8.1%十二烷基硫酸鈉0.2 mL、20%冰醋酸（pH 3.5）1.5 mL和0.8%硫代巴比妥酸1.5 mL，用蒸餾水定容至4 mL，95 ℃加熱2 h。冷卻至室溫后，加入正丁醇與吡啶（15∶1，V/V）的混合液5 mL，搖勻。離心10 min后，吸取上清液在532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，計(jì)算TBARS含量。每個(gè)劑量5 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3 次，另設(shè)無(wú)細(xì)胞空白孔以消除培養(yǎng)基對(duì)OD值的影響。

1.3.10 HAE對(duì)胞內(nèi)ROS的清除能力

參考文獻(xiàn)[25]，采用熒光探針DCFH-DA檢測(cè)胞內(nèi)胞內(nèi)ROS水平。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的V79-4細(xì)胞，以2×104個(gè)/mL接種于96 孔板中；培養(yǎng)16 h后，吸出全部原培養(yǎng)液，H2O2損傷組加入培養(yǎng)基，樣品處理組分別加入劑量為50、100、200 μg/mL的HAE溶液。處理30 min后，加入含1 mmol/L H2O2的培養(yǎng)基，在37 ℃下孵育30 min后，加入25 mmol/L的DCFH-DA繼續(xù)孵育10 min，收集細(xì)胞，PBS沖洗2 次，將各組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液，使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)538 nm。以H2O2損傷組熒光強(qiáng)度為100%，其余各組與損傷組相比，計(jì)算胞內(nèi)ROS清除率。每個(gè)劑量5 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3 次，另設(shè)無(wú)細(xì)胞空白孔以消除培養(yǎng)基對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示，兩組平均數(shù)之間采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異顯著，以P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚和花色苷含量

總酚含量通常能夠反映物質(zhì)的潛在生物活性，F(xiàn)olin-Ciocalteu比色法因其方法簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠，常被用于多酚含量的測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)中，野陽(yáng)合多酚的含量為（0.65±0.21）g沒(méi)食子酸/100 g md。

在不同的pH值條件下，花色苷結(jié)構(gòu)的變化使其色調(diào)和色度發(fā)生改變：pH值為1.0時(shí)，花色苷以紅色的2-苯基苯并吡喃的形式存在；pH 4.5時(shí)花色苷以無(wú)色的甲醇假堿的形式存在[26]?；诖嗽聿⒔Y(jié)合朗伯-比爾定律可得出，在這兩個(gè)不同的pH值下，花色苷結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其溶液吸光度的差值與花色苷的含量成比例。本實(shí)驗(yàn)中，野陽(yáng)合花色苷的含量經(jīng)測(cè)定為（81.38±1.45）mg矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷/100 g md。

2.2 HAE組成分析

采用HPLC對(duì)HAE進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。HAE在520 nm波長(zhǎng)處的色譜峰有4 個(gè)，保留時(shí)間分別為25.9、29.7、41.7、45.8 min。

圖1 HAE的HPLC色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram of anthocyanins extract from H. ciliolaris Kranzl

為鑒定野陽(yáng)合中花色苷的成分，采用HPLC-MS對(duì)該提取物進(jìn)行定性分析，花色苷單體的質(zhì)譜碎片離子結(jié)果見(jiàn)表1。圖1中的峰1、2、3、4對(duì)應(yīng)一級(jí)質(zhì)譜離子質(zhì)荷比（m/z）分別是449、595、463和609，依據(jù)保留時(shí)間、離子片段大小和文獻(xiàn)[18]的報(bào)道，推測(cè)這4 種花色苷為矢車(chē)菊素-3-半乳糖苷、矢車(chē)菊素-3-（6”-香豆酰）葡萄糖苷、芍藥色素-3-葡萄糖苷和芍藥色素-3-（6”-香豆酰）葡萄糖苷。

表1 HAE的組成Table 1 Identification of anthocyanins compositions from H. ciliolaris Kranzl

2.3 HAE清除自由基的能力

2.3.1 ABTS+·清除能力

ABTS法被廣泛用于體外抗氧化活性的測(cè)定。在反應(yīng)體系中，ABTS氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽(yáng)離子自由基，與自由基清除劑發(fā)生反應(yīng)使反應(yīng)體系褪色，褪色程度能夠反映自由基清除劑清除ABTS+·能力的強(qiáng)弱[27]。

圖2 HAE清除ABTS·的能力Fig. 2 ABTS radical scavenging capacity of anthocyanins extract from H. ciliolaris Kranzl

由圖2可知，在0～6.0 μg/mL范圍內(nèi)，HAE和兩種陽(yáng)性對(duì)照對(duì)ABTS+·的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增大，且呈劑量依賴(lài)關(guān)系。VC、Trolox和HAE清除ABTS+·的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為（1.76±0.21）、（4.32±0.35）μg/mL和（1.72±0.26）μg/mL，表明HAE對(duì)ABTS+·的清除能力與VC相當(dāng)，優(yōu)于Trolox。

2.3.2 DPPH自由基清除能力

DPPH是目前使用最為廣泛的自由基試劑之一。DPPH自由基在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，當(dāng)加入自由基清除劑時(shí)，深紫色的DPPH自由基被還原成黃色的DPPH-H非自由基形式，褪色程度能夠反映自由基清除劑清除DPPH自由基能力的強(qiáng)弱[27]。

圖3 HAE清除DPPH自由基的能力Fig. 3 DPPH radical scavenging capacity of anthocyanins extract from H. ciliolaris Kranzl

由圖3可知，在0～7.0 μg/mL范圍內(nèi)，HAE和兩種陽(yáng)性對(duì)照對(duì)DPPH自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增大，且呈劑量依賴(lài)關(guān)系。VC、Trolox和HAE清除DPPH自由基的IC50分別為（1.78±0.38）、（3.69±0.52）μg/mL和（0.74±0.24）μg/mL，表明HAE對(duì)DPPH自由基的清除能力優(yōu)于VC和Trolox。

2.4 HAE對(duì)H2O2誘導(dǎo)V79-4細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

圖4 HAE對(duì)V79-4細(xì)胞存活率的影響Fig. 4 Cell viability of V79-4 cells after treatment with anthocyanins extract from H. ciliolaris Kranzl

如圖4所示，正常對(duì)照組未受到H2O2誘導(dǎo)氧化損傷和樣品處理，細(xì)胞存活率為100%。V79-4細(xì)胞經(jīng)不同劑量（50、100、200 μg/mL）的HAE溶液處理后，細(xì)胞存活率分別為（98.2±0.8）%、（96.3±1.6）%、（96.0±2.4）%，表明HAE溶液對(duì)細(xì)胞沒(méi)有顯著性的損傷作用。因此，實(shí)驗(yàn)中選用50～200 μg/mL的HAE用于后續(xù)抑制H2O2誘導(dǎo)V79-4細(xì)胞氧化損傷的實(shí)驗(yàn)。

圖5 HAE對(duì)H2O2誘導(dǎo)V79-4細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用Fig. 5 Protection of anthocyanins extract from H. ciliolaris Kranzl against H2O2-induced oxidative damage in V79-4 cells

由圖5可知，損傷組細(xì)胞受到H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷，部分細(xì)胞生長(zhǎng)受阻或凋亡，細(xì)胞存活率下降至（51.6±2.1）%。經(jīng)不同劑量（50、100、200 μg/mL）HAE溶液預(yù)處理后，各實(shí)驗(yàn)組V79-4細(xì)胞存活率分別為（58.7±0.7）%、（68.2±1.2）%、（88.2±1.1）%。同H2O2損傷組相比，經(jīng)不同劑量HAE樣品預(yù)處理，V79-4細(xì)胞對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷抵抗力逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞存活率逐漸升高。

2.5 HAE對(duì)H2O2誘導(dǎo)V79-4細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

TBARS是氧化的脂質(zhì)生成的丙二醛及其他一些醛酮類(lèi)物質(zhì)與硫代巴比妥酸作用生成的有色化合物，該有色化合物在532 nm波長(zhǎng)處有吸收。因此，可通過(guò)測(cè)定醛酮類(lèi)物質(zhì)的含量來(lái)評(píng)價(jià)脂質(zhì)過(guò)氧化程度[28-29]。

圖6 HAE對(duì)H2O2誘導(dǎo)V79-4脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用Fig. 6 Inhibitory effect of anthocyanins extract from H. ciliolaris Kranzl on H2O2-induced lipid peroxidation in V79-4 cells

由圖6可知，正常對(duì)照組的TBARS含量為（1.7±0.2）μmol/mg，H2O2損傷組的TBARS含量為（3.8±0.3）μmol/mg，表明H2O2可誘導(dǎo)V79-4細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。經(jīng)不同劑量（50、100、200 μg/mL）HAE溶液處理后，各實(shí)驗(yàn)組TBARS含量分別為（2.9±0.7）、（2.5±0.1）μmol/mg和（2.0±0.2）μmol/mg。同H2O2損傷組相比，預(yù)先加入50～200 μg/mL HAE可抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，且呈劑量依賴(lài)性。

2.6 HAE對(duì)H2O2誘導(dǎo)V79-4細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

DCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞后，被水解生成二氯二氫熒光素，二氯二氫熒光素可與胞內(nèi)的ROS反應(yīng)生成具有熒光的二氯熒光素，故二氯熒光素?zé)晒鈴?qiáng)度可反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平[30-31]。正常組細(xì)胞內(nèi)ROS水平較低，熒光強(qiáng)度較弱，H2O2損傷組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加。由圖7可知，經(jīng)不同劑量（50、100、200 μg/mL）HAE溶液處理后，實(shí)驗(yàn)組V79-4細(xì)胞內(nèi)ROS清除率分別為（40.2±1.7）%、（62.2±2.0）%、（82.4±1.2）%，且清除率隨劑量增加呈增高趨勢(shì)。

圖7 HAE對(duì)H2O2處理的V79-4細(xì)胞內(nèi)ROS清除率的影響Fig. 7 Effect of anthocyanins extract from H. ciliolaris Kranzl on ROS levels in H2O2-induced V79-4 cells

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)中，采用pH示差法測(cè)得野陽(yáng)合花色苷的含量為（81.38±1.45） mg矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷/100 g md；采用HPLC-MS分析，發(fā)現(xiàn)HAE中含有4 種花色苷，推測(cè)為矢車(chē)菊素-3-半乳糖苷、矢車(chē)菊素-3-（6”-香豆酰）葡萄糖苷、芍藥色素-3-葡萄糖苷和芍藥色素-3-（6”-香豆酰）葡萄糖苷。

體外自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HAE具有良好的自由基清除能力，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度增大，HAE清除ABTS+·和DPPH自由基的能力增強(qiáng)。HAE清除ABTS+·的IC50為（1.72±0.26）μg/mL，清除能力與VC相當(dāng)；HAE清除DPPH自由基的IC50為（0.74±0.24）μg/mL，清除能力優(yōu)于VC。張楊等[32]報(bào)道藍(lán)莓果實(shí)含11 種花色苷，其清除ABTS+·和DPPH自由基能力均明顯優(yōu)于VC；Hao Jie等[33]報(bào)道黑米含9 種花色苷，其清除ABTS+·和DPPH自由基能力與VC相當(dāng)。綜上，花色苷自由基清除能力不同，推測(cè)可能與花色苷的含量、羥基化程度、?；吞擒疹?lèi)型有關(guān)[6]。

選用H2O2誘導(dǎo)V79-4細(xì)胞建立氧化損傷模型，進(jìn)一步對(duì)HAE抗氧化活性進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)H2O2處理的V79-4細(xì)胞會(huì)發(fā)生顯著的氧化損傷及脂質(zhì)過(guò)氧化。50～200 μg/mL的HAE對(duì)H2O2誘導(dǎo)V79-4細(xì)胞氧化損傷具有較為明顯的保護(hù)作用，明顯抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，降低損傷后胞內(nèi)ROS水平，且呈劑量依賴(lài)關(guān)系。羅春麗等[34]報(bào)道，100～800 μg/mL紫薯花青素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞損傷具有較為明顯的保護(hù)作用；徐麗萍等[35]報(bào)道，1～10 μmol/L藍(lán)莓花青素氯化錦葵色素可明顯降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷。本研究與以上文獻(xiàn)的實(shí)驗(yàn)體系存在差異，不能定量分析活性強(qiáng)弱，但均在細(xì)胞水平上定性探究了花色苷的抗氧化活性，為深入研究花色苷如何調(diào)控細(xì)胞凋亡蛋白酶家族蛋白以及對(duì)超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等體內(nèi)抗氧化酶活性的影響提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

[1] 吳杰, 鄭影, 谷思云, 等. 篤斯越橘產(chǎn)品花色苷抗氧化活性評(píng)價(jià)[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(22): 181-185. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2012.22.054.

[2] 胡濟(jì)美, 籍保平, 周峰, 等. 大興安嶺篤斯越橘花色苷成分鑒定研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(10): 239-241. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2009.10.056.

[3] C?TA A, STEF?NUT M N, POP R, et al. Evaluation of antioxidant activities of some small fruits containing anthocyanins using electrochemical and chemical methods[J]. Croatica Chemica Acta,2016, 89(1): 37-48. DOI:10.5562/cca2656.

[4] JULIA M B, PURIFICACIóN S P, FERNANDO R E, et al. Analysis and antioxidant capacity of anthocyanin pigments. part II: chemical structure, color, and intake of anthocyanins[J]. Critical Reviews in Analytical Chemistry, 2012, 42(2): 126-151. DOI:10.1080/10408347.2011.632314.

[5] ONSLOW M W. The anthocyanin pigments of plants[M]. Cambridge:Cambridge University Press, 2014: 1-324.

[6] 肖繼坪, 楊曉艷, 郭華春. 彩色馬鈴薯“劍川紅”和“轉(zhuǎn)心烏”花色苷的抗氧化分析[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(13): 13-18. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613003.

[7] 郭曉倩, 房子舒, 劉鳳嬌, 等. 東北野生藍(lán)莓花色苷組分分析及其抗氧化性比較[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2016, 32(3): 313-320. DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.3.048.

[8] CUI C, ZHANG S, YOU L, et al. Antioxidant capacity of anthocyanins from Rhodomyrtus tomentosa (Ait.) and identification of the major anthocyanins[J]. Food Chemistry, 2013, 139(1/2/3/4): 1-8.DOI:10.1016/j.foodchem.2013.01.107.

[9] 楊大毅. 紫薯發(fā)酵酒的生產(chǎn)工藝[J]. 釀酒, 2011, 38(1): 77-78.DOI:10.3969/j.issn.1002-8110.2011.01.028.

[10] DE PASCUAL-TERESA S. Molecular mechanisms involved in the cardiovascular and neuroprotective effects of anthocyanins[J].Archives of Biochemistry & Biophysics, 2014, 559(5): 68-74.DOI:10.1016/j.abb.2014.04.012.

[11] SMERIGLIO A, BARRECA D, BELLOCCO E, et al. Chemistry,pharmacology and health benefits of anthocyanins[J]. Phytotherapy Research, 2016, 30(8): 1265-1286. DOI:10.1002/ptr.5642.

[12] CASTANEDA-OVANDO A, DE LOURDES PACHECOHERNáNDEZ M, PáEZ-HERNáNDEZ M E, et al. Chemical studies of anthocyanins: a review[J]. Food Chemistry, 2009, 113(4): 859-871.DOI:10.1016/j.foodchem.2008.09.001.

[13] 劉咪, 張偉松, 何財(cái)安, 等. 葡萄皮花色苷對(duì)幾種常見(jiàn)食源性致病菌的抑制作用[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2014, 14(11): 70-75. DOI:10.16429/j.1009-7848.2014.11.003.

[14] KASPAR K L, PARK J S, BROWN C R, et al. Pigmented potato consumption alters oxidative stress and inflammatory damage in men[J]. The Journal of Nutrition, 2011, 141(1): 108-111. DOI:10.3945/jn.110.128074.

[15] IVA R, MOJCA ?, ?ELJKO K, et al. Phenolic content and antioxidant potential of macerated white wines[J]. European Food Research and Technology, 2011, 233(3): 465-472. DOI:10.1007/s00217-011-1535-4.

[16] 李斌, 雷月, 孟憲軍, 等. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取藍(lán)靛果多酚工藝及其抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(22): 33-39.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201522006.

[17] 宋德群, 孟憲軍, 王晨陽(yáng), 等. 藍(lán)莓花色苷的pH示差法測(cè)定[J].沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 44(2): 231-233. DOI:10.3969/j.issn.1000-1700.2013.02.019.

[18] WU X, PRIOR R L. Systematic identification and characterization of anthocyanins by HPLC-ESI-MS/MS in common foods in the United States: fruits and berries[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(7): 2589-2599. DOI:10.1021/jf048068b.

[19] LIANG L, WU X, ZHAO T, et al. In vitro, bioaccessibility and antioxidant activity of anthocyanins from mulberry (Morus atropurpurea Roxb.) following simulated gastro-intestinal digestion[J].Food Research International, 2012, 46(1): 76-82. DOI:10.1016/j.foodres.2011.11.024.

[20] 王健, 潘利華. 藍(lán)莓花青素的抗氧化活性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2013, 41(12): 5487-5489. DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2013.12.110.

[21] LI D, ELLIS E M. 4-Hydroxynonenal induces an increase in expression of Receptor for Activating C Kinase 1 (RACK1) in Chinese hamster V79-4 lung cells[J]. Chemico-Biological Interactions, 2014,213(17): 13-20. DOI:10.1016/j.cbi.2014.01.020.

[22] SAFAEIAN L, SAJJADI S E, JAVANMARD S H, et al. Protective effect of Melissa officinalis extract against H2O2-induced oxidative stress in human vascular endothelial cells[J]. Research in Pharmaceutical Sciences, 2016, 11(5): 383-389. DOI:10.4103/1735-5362.192488.

[23] 高蒙蒙, 孫桂波, 斯建勇, 等. 紅車(chē)軸草總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2013, 29(2): 201-207.DOI:10.3969/j.issn.1001-1978.2013.02.13.

[24] SABUNCUOGLU S, ORHAN H. Interference of metals and medications with the detection of lipid peroxidation in humans by photometric TBARS assay[J]. Current Analytical Chemistry, 2013,9(3): 457-462. DOI:10.2174/1573411011309030015.

[25] PIAO M J, KANG K A, ZHANG R, et al. Antioxidant properties of 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose from Elaeocarpus sylvestris var. ellipticus[J]. Food Chemistry, 2009, 115(2): 412-418.DOI:10.1016/j.foodchem.2008.12.020.

[26] 李建偉. pH示差法測(cè)定山楂中花青素的含量[J]. 長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2015, 29(3): 177-179. DOI:10.3969/j.issn.1006-0588.2015.03.006.

[27] MARTYSIAK-?UROWSKA D, WENTA W. A comparison of ABTS and DPPH methods for assessing the total antioxidant capacity of human milk[J]. Acta Scientiarum Polonorum Technologia Alimentaria,2012, 11(1): 83-89.

[28] MONSERRAT J M, SEIXAS A L R, FERREIRA-CRAVO M, et al.Interference of single walled carbon nanotubes (SWCNT) in the measurement of lipid peroxidation in aquatic organisms through TBARS assay[J]. Ecotoxicology & Environmental Safety, 2017,140(2): 103-108. DOI:10.1016/j.ecoenv.2017.02.034.

[29] 李興泰, 杜春雨, 劉雨晴, 等. 黨紅飲體外保護(hù)線(xiàn)粒體功能評(píng)價(jià)[J].食品科學(xué), 2011, 32(19): 273-278.

[30] ZHAO C, FENG B, CAO Y, et al. Identification and characterisation of ROS modulator 1 in Lampetra japonica[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2013, 35(2): 278-283. DOI:10.1016/j.fsi.2013.04.039.

[31] 余夢(mèng)瑤, 許曉燕, 魏巍, 等. 炭角菌菌絲體乙醇提取物對(duì)H2O2所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J]. 食用菌學(xué)報(bào), 2014, 21(4): 49-52.DOI:10.3969/j.issn.1005-9873.2014.04.014.

[32] 張楊, 謝筆鈞, 孫智達(dá). 藍(lán)莓酒渣、果、酒中花色苷成分鑒定及酒渣與果中花色苷抗氧化活性比較[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(2): 165-171. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602029.

[33] HAO Jie, ZHU Hui, ZHANG Zhenqing, et al. Identification of anthocyanins in black rice (Oryza sativa L.) by UPLC/Q-TOF-MS and their in vitro and in vivo antioxidant activities[J]. Journal of Cereal Science, 2015, 64(7): 92-99. DOI:10.1016/j.jcs.2015.05.003.

[34] 羅春麗, 王林, 李杏, 等. 紫薯花青素體外抗氧化及對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(17): 225-230. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201517042.

[35] 徐麗萍, 付琳, 黃午陽(yáng), 等. 藍(lán)莓花青素氯化錦葵色素在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的抗氧化作用[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(21): 233-237.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201521043.