馬慶保,劉志東*
(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所,上海 200090;2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)
生活于低溫環(huán)境的生物體,為了抵御低溫脅迫,會(huì)適應(yīng)性地產(chǎn)生一種具有抗凍活性的特殊蛋白質(zhì)——抗凍蛋白(antifreeze proteins,AFPs),亦稱為冰結(jié)合蛋白或冰結(jié)構(gòu)蛋白。AFPs是一類以非依數(shù)性形式降低體系冰點(diǎn)、改變冰晶形態(tài)、抑制冰晶生長、防止冰晶對(duì)生物體細(xì)胞造成的損傷和致死的特殊蛋白質(zhì)[1]。AFPs能夠降低體系的冰點(diǎn),但對(duì)體系的融點(diǎn)卻影響較小;因此,導(dǎo)致了體系的融點(diǎn)和冰點(diǎn)出現(xiàn)差值,這個(gè)差值稱為熱滯活性(thermal hysteresis activity,THA)[2]。
THA是評(píng)價(jià)AFP抗凍活性的重要指標(biāo),目前評(píng)價(jià)THA的方法主要有毛細(xì)管單晶生長觀察法,納升滲透壓法和差示掃描量熱(differential scanning calorimetry,DSC)法等。毛細(xì)管單晶生長觀察法是最早用于THA測(cè)定的方法,該法不需要大型的儀器設(shè)備,但操作過程較復(fù)雜、耗時(shí)長,而且人為誤差較大[3-4]。納升滲透壓法主要基于珀?duì)柼韺?shí)現(xiàn)控溫[5-8],但該法依然依靠人工觀察完成,容易出現(xiàn)誤差,溫度的變化速率和波動(dòng)也無法實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的控制[4]。DSC法主要是基于樣品結(jié)晶過程中吸熱和放熱的變化,檢測(cè)體系發(fā)生的物理變化,精確迅速測(cè)定熱容和熱焓,從而確定真實(shí)的結(jié)晶起始溫度,進(jìn)而獲得樣品的THA,并能精確測(cè)定體系的冰晶含量[9]。DSC法能夠精確測(cè)定體系的吸熱和放熱,反映AFPs特殊的相變和熱力學(xué)行為。DSC法因其穩(wěn)定性和精確性,得到了越來越廣泛的應(yīng)用[10-11]。
南極磷蝦(Euphausia superba Dana)是一種生活在南極海域的小型浮游類海洋動(dòng)物,生物量巨大(約為6.5億~10.0億 t)[12-15]。因此,南極磷蝦己經(jīng)成為近年來食品科學(xué)等學(xué)科的研究熱點(diǎn)[16]。南極磷蝦生活于南極海域冰冷的海水中(水溫約為-1.9 ℃)[17],研究表明南極磷蝦主要依靠AFPs應(yīng)對(duì)南極海域的低溫脅迫[17-18]。作為一種潛在、廣泛的天然AFPs來源,南極磷蝦AFPs具有重要的應(yīng)用前景;對(duì)于提高南極磷蝦附加值也具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以純化的南極磷蝦AFPs為研究對(duì)象,采用DSC法評(píng)價(jià)其THA;重點(diǎn)考察了升降溫速率、南極磷蝦AFPs質(zhì)量濃度、冰晶含量、緩沖體系等參數(shù)對(duì)THA的影響,以為AFPs的評(píng)價(jià)研究及抗凍機(jī)理提供基礎(chǔ)信息。
南極磷蝦由上海開創(chuàng)遠(yuǎn)洋漁業(yè)有限公司2016年11月于南極設(shè)得蘭群島海域捕獲,冷藏運(yùn)回國內(nèi),實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃貯藏備用;牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker 美國Bio-Rad公司。
FreeZone真空冷凍干燥機(jī) 美國LABCONCO公司;204 F1 DSC儀 德國NETZSCH公司;電泳儀 美國Bio-Rad公司。
1.3.1 南極磷蝦AFPs的提取
以南極磷蝦蛋白為原料提取南極磷蝦AFPs,參照Kuiper等[19]方法構(gòu)建特異性親和吸附法提取南極磷蝦AFPs,將提取的南極磷蝦AFPs進(jìn)行真空冷凍干燥。采用pH 7.8的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)分別配制不同質(zhì)量濃度的AFPs溶液和BSA溶液。
1.3.2 南極磷蝦AFPs的SDS-PAGE電泳
采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)進(jìn)行南極磷蝦AFPs的純度鑒定,按照5∶1(V/V)的比例將樣品與上樣緩沖液混合,置于沸水中煮沸5 min,取15 μL樣品上樣,12.5%分離膠和4.0%濃縮膠,樣品在120 V恒壓條件下進(jìn)行電泳。電泳完畢后,將凝膠置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%的考馬斯亮藍(lán)R-250中染色2 h,在醋酸脫色液中脫色至背景無色,采用凝膠分析儀進(jìn)行拍照。
1.3.3 DSC法測(cè)定樣品的THA
采用DSC法測(cè)定南極磷蝦AFPs的THA,以BSA為對(duì)照。參照Ding Xiangli等[20]的方法稍作改動(dòng)。將10 μL質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的南極磷蝦AFPs密封于鋁制坩堝中,放置在樣品池中央,以空鋁皿為參比。設(shè)備穩(wěn)定后,以1.0 ℃/min的升降溫速率從室溫降溫至-30 ℃,然后升溫至20 ℃,再降溫至-30 ℃,獲得南極磷蝦AFPs的熔融焓(ΔHm)和熔點(diǎn)(Tm)。接著,從-30 ℃緩慢升溫至樣品體系為固液混合物狀態(tài),稱為保留溫度(Th),停留5 min,使冰晶完全孵化,再將溫度從Th降低至-30 ℃,重復(fù)上述過程,在不同的Th下停留5 min。記錄不同Th下,樣品結(jié)晶的起始溫度(T0)和結(jié)晶焓(ΔHf)。按照公式(1)和(2)計(jì)算樣品的THA和冰晶含量。
1.3.4 DSC法測(cè)定THA條件的優(yōu)化
參照文獻(xiàn)[10],考察DSC法測(cè)定南極磷蝦AFPs的THA影響因素,優(yōu)化其評(píng)價(jià)條件以獲得最佳的測(cè)定條件。
1.3.4.1 升降溫速率對(duì)THA評(píng)價(jià)的影響
分別選取升降溫速率為0.50、0.75、1.00、2.50、5.00 ℃/min,南極磷蝦AFPs質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL,以PBS為緩沖體系開展實(shí)驗(yàn)。以THA為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察升降溫速率對(duì)南極磷蝦AFPs的THA的影響。
1.3.4.2 南極磷蝦AFPs質(zhì)量濃度對(duì)THA評(píng)價(jià)的影響
分別選取南極磷蝦AFPs質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 mg/mL,升降溫速率為1 ℃/min,以PBS為緩沖體系開展實(shí)驗(yàn)。以THA為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察南極磷蝦AFPs質(zhì)量濃度對(duì)THA評(píng)價(jià)的影響。
1.3.4.3 冰晶含量對(duì)THA評(píng)價(jià)的影響
采用DSC法測(cè)定THA時(shí),冰晶含量與Th有著密切的關(guān)系,Th越接近平衡熔點(diǎn),冰晶含量就越小。因此,分別選取-2.3~-3.0 ℃間不同的Th,南極磷蝦AFPs質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL,升降溫速率為1 ℃/min,以PBS為緩沖體系開展實(shí)驗(yàn)。以THA為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察冰晶含量對(duì)THA評(píng)價(jià)的影響。
1.3.4.4 緩沖體系對(duì)THA評(píng)價(jià)的影響
將南極磷蝦AFPs分別溶解于水、PBS、Tris-鹽酸不同的緩沖體系,并以BSA為對(duì)照,南極磷蝦AFPs質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL,升降溫速率為1 ℃/min開展實(shí)驗(yàn)。以THA為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察緩沖體系對(duì)THA評(píng)價(jià)的影響。
圖1 南極磷蝦AFPs的SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE profile of AFPs
通過SDS-PAGE對(duì)南極磷蝦AFPs的分子質(zhì)量及純度進(jìn)行鑒定,由圖1可知,樣品呈現(xiàn)單一條帶,無其他雜帶。結(jié)果表明,所提取的南極磷蝦AFPs具有較高的純度,分子質(zhì)量約為76 kDa。
由圖2和表1可知,AFPs由完全結(jié)冰被加熱到不同的保留溫度Th,從不同Th開始降溫時(shí),已融化的部分沒有立即結(jié)冰,而是出現(xiàn)了冰點(diǎn)的滯后現(xiàn)象,Th與T0之間相差較大,這表明南極磷蝦AFPs具有THA。而BSA從不同Th開始降溫時(shí),已融化的部分立即結(jié)冰,Th等于T0,沒有出現(xiàn)冰點(diǎn)的滯后現(xiàn)象,即BSA沒有表現(xiàn)出THA。因此,DSC法可以用于測(cè)定南極磷蝦AFPs的THA。冰晶含量為11.02%時(shí),南極磷蝦AFPs的THA為1.76 ℃。
由圖2A和表1也可知,隨著Th的升高,冰晶含量不斷的下降,南極磷蝦AFPs的THA呈現(xiàn)升高趨勢(shì),Th為-2.60 ℃時(shí),冰晶含量為5.79 %,THA達(dá)到了2.74 ℃,此時(shí)的THA可能是由于過冷現(xiàn)象造成的。冰晶結(jié)晶過程中,是以體系中已含有的冰晶為冰核開始結(jié)晶,體系中冰晶含量越少,冰晶表面AFPs的吸附覆蓋程度越高,AFPs抑制冰晶繼續(xù)生長的作用就越強(qiáng),其溶液完全結(jié)晶所需的時(shí)間就越長,測(cè)得的THA也就越高[21]。但若AFPs溶液中任意一個(gè)區(qū)域內(nèi)都沒有形成至少一個(gè)足夠大的冰核,此時(shí)水分子無法包圍著晶核結(jié)冰,使得溶液出現(xiàn)過冷現(xiàn)象,從而造成冰點(diǎn)比熔點(diǎn)低很多,但此時(shí)所測(cè)定的冰點(diǎn)并沒有真實(shí)地反映南極磷蝦AFPs的THA。
圖2 AFPs與BSA的DSC熱流曲線Fig. 2 DSC curves of partially melted AFPs and BSA
表1 AFPs與BSA的Th、T0、冰晶含量和THATable 1 Hold and onset temperature (Th and T0), ice fraction and THA of AFPs and BSA
DSC法是一種熱分析方法,能夠通過測(cè)定升、降溫過程中熱焓的變化直接反映樣品冰點(diǎn)與熔點(diǎn)之間的差異,獲得其THA。這種方法避免了直接觀察法容易引入人為誤差的缺陷[21]。但是由于AFPs來源和特性的不同,采用DSC法測(cè)定AFPs是的THA時(shí),可能受到一些因素的影響,如樣品質(zhì)量濃度、升降溫速率、冰晶含量和緩沖體系等的影響。因此,需要對(duì)其評(píng)價(jià)條件進(jìn)行優(yōu)化[22-23]。
2.3.1 升降溫速率對(duì)THA的影響
圖3 不同升降溫速率下AFPs的DSC熱流曲線圖Fig. 3 DSC curves of AFPs at different cooling rates
從圖3中可以看出,除過冷狀態(tài),當(dāng)升降溫速率為5.00 ℃/min時(shí),THA都超過2 ℃。如圖3A所示,Th為-2.30 ℃,THA為2.92 ℃;當(dāng)升降溫速率為2.50 ℃/min時(shí),THA在2.00 ℃左右;而當(dāng)升降溫速率為1.00、0.75、0.50 ℃/min時(shí),如圖3F所示,THA都穩(wěn)定在1.70 ℃左右。因此,當(dāng)升降溫速率較快時(shí),THA呈現(xiàn)被升高狀態(tài),這可能是由于過高的升降溫速率使得體系的換熱不充分,冰晶凍結(jié)的滯后現(xiàn)象被放大[11],熱流曲線圖上的表現(xiàn)為在-10 ℃以下,體系依然處于結(jié)晶狀態(tài)。
當(dāng)升降溫速率為0.50~1.00 ℃/min時(shí),樣品結(jié)晶時(shí)放熱處于相對(duì)正常的范圍,體系換熱充分。因此,能夠測(cè)得相對(duì)穩(wěn)定的南極磷蝦AFPs的THA。但升降溫的速率過低,耗時(shí)太長,因此,選擇1.00 ℃/min作為升降溫速率較為合適。這也與多數(shù)研究中選擇的升降溫速率相吻合[24-26]。
2.3.2 樣品質(zhì)量濃度對(duì)THA的影響表2 不同質(zhì)量濃度AFPs的Th、T0、冰晶含量和THA
圖4 不同質(zhì)量濃度AFPs的DSC熱流曲線圖Fig. 4 DSC curves of AFPs at different concentrations
表2 不同質(zhì)量濃度AFPs的Th、T0、冰晶含量和THATable 2 Th, T0, ice fractions and THA of AFPs at different concentrations
由圖4和表2可知,隨著南極磷蝦AFPs質(zhì)量濃度的增加,THA先快速升高;當(dāng)樣品質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL后,THA的變化趨向于平穩(wěn),THA的增量收窄。因此,南極磷蝦AFPs的THA在一定的范圍內(nèi)呈質(zhì)量濃度依賴關(guān)系。其他研究也表明,部分AFPs的THA具有質(zhì)量濃度依賴性,THA不僅需要AFPs分子吸附于冰晶上,還需要溶液中有自由AFPs分子的存在[27-30]?;谖揭种茩C(jī)理可知,AFPs吸附于冰晶的部分表面,而非整個(gè)表面,以一種類似網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形式存在,AFPs分子彼此之間存在一定的間隔[31-33]。AFPs會(huì)改變冰水界面的局部表面張力,干擾其所覆蓋的冰晶生長,使得其所覆蓋區(qū)域的冰晶生長受到抑制,而其他區(qū)域不受抑制[34]。當(dāng)所吸附的AFPs彼此之間的平均間隔等于或小于兩倍的冰晶冰峰臨界曲率半徑時(shí),冰晶的生長就會(huì)受到抑制。因此,如果AFPs的質(zhì)量濃度過低,形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)AFPs分子之間的距離過大,冰晶生長的抑制效果就會(huì)較差,THA表現(xiàn)的較低。
目前的研究也表明,在某些AFPs(如魚類AFPs)中,THA與AFPs分子和冰晶面的結(jié)合速率以及其質(zhì)量濃度密切相關(guān),THA在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈依賴關(guān)系,通常與AFPs質(zhì)量濃度的平方根成正比[1,30,35]。而對(duì)于高活性AFPs(如昆蟲AFPs),其能夠與冰晶的基面結(jié)合[36-37],當(dāng)將吸附了AFPs分子的冰晶周圍環(huán)境的AFPs除去后,THA依然保持不變,這表明,其THA不直接依賴于溶液中的AFPs的質(zhì)量濃度,而與AFPs分子在冰晶面上的表面密度相關(guān)[1,34,38]。
2.3.3 冰晶含量對(duì)THA的影響
研究表明,冰晶的含量與粒徑會(huì)對(duì)THA產(chǎn)生影響[39-40]。當(dāng)冰晶的含量和粒徑足夠小時(shí),冰晶所吸附的AFPs的數(shù)量很少。因此,當(dāng)THA評(píng)價(jià)時(shí)剩余樣品溶液中AFPs的質(zhì)量濃度保持相對(duì)穩(wěn)定,若冰晶含量或粒徑過大,剩余樣品溶液中AFPs的質(zhì)量濃度因大量吸附而降低,AFPs在冰晶表面的吸附度會(huì)降低,這將導(dǎo)致THA的降低[27]。采用傳統(tǒng)方法或者納升滲透壓計(jì)法測(cè)定AFPs的THA時(shí),體系中都是僅保留一個(gè)冰晶,通過顯微鏡觀察冰晶的生長情況,以獲得樣品的THA,盡量降低冰晶含量和粒徑對(duì)THA的影響,存在人為誤差。采用DSC法測(cè)定時(shí),雖然無法直接觀察到冰晶的情況,但可以通過計(jì)算(公式2)獲得樣品中的冰晶含量。
圖5 不同Th下樣品的冰晶含量與THA間的關(guān)系Fig. 5 Relationship between ice crystal fraction and THA of AFPs at different Th
先前的研究指出,冰晶含量在0.13%~10.00%間,THA與冰晶含量呈現(xiàn)冪指數(shù)函數(shù)的增長關(guān)系[40],而當(dāng)冰晶含量在10%~90%時(shí),THA就會(huì)呈現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定的數(shù)值[11,20]。由圖5可知,當(dāng)冰晶含量低于4%時(shí),出現(xiàn)樣品的過冷現(xiàn)象,即樣品在零下十幾度才會(huì)出現(xiàn)結(jié)晶現(xiàn)象,不能將其用于真實(shí)THA的計(jì)算。相反,當(dāng)冰晶含量高于20%時(shí),樣品立刻結(jié)冰,檢測(cè)不到THA;冰晶含量在4%~20%之間時(shí),THA呈現(xiàn)下降趨勢(shì);冰晶含量為4%~10%之間時(shí),THA普遍超過2 ℃,這可能是由于部分過冷造成;冰晶含量在10%~15%之間時(shí),THA最為穩(wěn)定,在1.7 ℃附近波動(dòng);隨著冰晶含量的繼續(xù)升高,THA開始降低。因此,冰晶含量應(yīng)在10%~15%之間,這也與Ding Xiangli等[20]的研究結(jié)果相近。
2.3.4 緩沖體系對(duì)THA的影響
圖6 不同緩沖體系中南極磷蝦AFPs和BSA的DSC熱流曲線圖Fig. 6 DSC curves of AFPs and BSA in different buffer systems
表3 不同緩沖體系A(chǔ)FPs樣品與BSA的Th、T0、冰晶含量和THATable 3 Th, T0, ice fractions and THA of AFPs and BSA in different buffer systems
采用了不同的緩沖體系,如Tris-鹽酸緩沖液(pH 8.0)[41]、PBS(pH 7.4)[24]開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)。不同緩沖體系對(duì)南極磷蝦AFPs THA的影響如圖6和表3所示。BSA無論在任何緩沖體系中都沒有表現(xiàn)出THA,南極磷蝦AFPs在水中的THA僅為0.08 ℃,在pH值都為7.8的PBS緩沖液和Tris-鹽酸緩沖液,THA較為接近,分別為1.62、1.67 ℃,這表明不同緩沖體系能夠影響AFPs的THA。
研究表明AFPs的冰晶結(jié)合位點(diǎn)是相對(duì)疏水的,將AFPs溶解于水中,其冰晶結(jié)合位點(diǎn)可能無法完全展開,活性因此受到抑制,引起THA的下降[42-43]。此外,低分子質(zhì)量的溶質(zhì)以及鹽離子可能也會(huì)對(duì)THA造成影響[44-49],通常,能夠?qū)FPs的THA提高數(shù)倍[44],如Xu Yao等[29]將AFP-Ⅲ樣品分別溶于水和0.5 mol/L的檸檬酸鈉溶液,溶于水中的AFP-Ⅲ樣品的THA呈線性下降。即使是同一種緩沖液,體系pH值的影響也較大,如Tris-鹽酸緩沖液,體系pH值為7.2[50]、7.5[51]、8.0[41]等,但都為偏堿性的條件。鹽離子及pH值對(duì)南極磷蝦AFPs的THA的確切影響,在后面的實(shí)驗(yàn)中將會(huì)重點(diǎn)考察。
本實(shí)驗(yàn)以純化的南極磷蝦AFPs為研究對(duì)象,采用DSC法評(píng)價(jià)了影響其THA的因素。研究結(jié)果表明,南極磷蝦AFPs的分子質(zhì)量約為76 kDa,THA為1.76 ℃。優(yōu)化確定DSC法評(píng)價(jià)南極磷蝦AFPs的THA升降溫速率為1.00 ℃/min,樣品質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL,冰晶含量為10%~15%之間。此外,緩沖體系對(duì)THA也有較大的影響,通常選擇偏堿性的緩沖溶液體系。鹽離子含量、種類及體系pH值等對(duì)南極磷蝦AFPs的THA影響仍待后續(xù)深入研究。
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