李杰，李斌，許彬，郭書賢，于麗萍

（南陽理工學(xué)院生化學(xué)院，河南南陽473004）

大球蓋菇（Stropharia rugoso-annulata）也稱酒紅色球蓋菇、皺環(huán)球蓋菇，是名貴珍稀食用菌，原產(chǎn)歐美，是歐美各國人工栽培的食用菌之一，也是聯(lián)合國糧農(nóng)組織向發(fā)展中國家推薦栽培的十大菇種之一[1-7]。大球蓋菇子實(shí)體富含多糖、皂甙、?；撬帷⒖傸S酮、多酚、維生素等多種生物活性成分，具有抗衰老，改善心血管功能，促進(jìn)新陳代謝，提高人體抗病毒、抗細(xì)胞突變功能，提高免疫力等生理功能[8-15]。

對(duì)大球蓋菇的綜合利用研究報(bào)道比較少，目前，大球蓋菇的利用主要是采用傳統(tǒng)方法進(jìn)行簡單的加工，如腌漬、罐頭加工、制作干品等，產(chǎn)品附加值不高[16-20]。本研究主要是對(duì)以大球蓋菇為原料研制新型保健酒的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為大球蓋菇新型保健酒的研制奠定基礎(chǔ)，為我國的大球蓋菇資源尋求新的深加工途徑，為大球蓋菇精深加工提供理論依據(jù)，也為進(jìn)一步大規(guī)模開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 原料

大球蓋菇干品：南陽市社旗縣福源生態(tài)菌業(yè)有限公司。

1.2 菌種

安琪活性釀酒干酵母（最適發(fā)酵溫度25℃）：安琪酵母股份有限公司。

1.3 液態(tài)種子培養(yǎng)基

馬鈴薯汁200.0 g/L，葡萄糖20.0g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O 3.0 g/L100.0 mg/L，pH 值自然，121 ℃滅菌20 min。

1.4 試劑

葡萄糖、（NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、：均為國產(chǎn)分析純；食品級(jí)檸檬酸、白砂糖。

1.5 儀器與設(shè)備

LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海中安醫(yī)療器械廠；TDL-40B臺(tái)式高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；101-2A電熱鼓風(fēng)干燥箱、DZKW-4電子恒溫水浴鍋：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；FA1004精密電子分析天平：上海天平儀器廠；DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；HZQ-B恒溫?fù)u床：蘇州威爾試驗(yàn)用品有限公司；SW-CJ-2G超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

2 方法

2.1 大球蓋菇保健酒生產(chǎn)工藝流程

大球蓋菇→清洗→切片→打漿→抽汁→滅菌→過濾→調(diào)糖→調(diào)pH值→發(fā)酵→陳釀→過濾→滅菌→裝瓶

2.2 原料預(yù)處理

大球蓋菇用0.1%的高錳酸鉀溶液浸泡20 min，然后用清水洗滌干凈。將洗凈的大球蓋菇切片，每片2 cm～3 cm，加適量自來水打成漿汁，漿汁經(jīng)真空抽濾、離心除去菇渣得到澄清菇液。大球蓋菇澄清汁在65℃下滅菌30 min后備用。

2.3 大球蓋菇保健酒發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)

每個(gè)搖瓶裝液量150 mL，分別考察酵母接種量（1%、3%、6%、9%、12%）、pH（3.2、3.5、3.8、4.1、4.4）、白砂糖用量[156、189、222、255、288（g/L）]、主發(fā)酵時(shí)間（5、6、7、8、9 d）、干菇和水的比例[1 ∶8、1 ∶15、1 ∶22、1 ∶29、1 ∶35（g/mL）]對(duì)大球蓋菇保健酒質(zhì)量影響，檢測指標(biāo)為酒精度、感官評(píng)分。

2.4 大球蓋菇保健酒發(fā)酵條件均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇酵母接種量、pH值、白砂糖用量、干菇和水的比例進(jìn)行均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)[21]，由于發(fā)酵7 d時(shí)已達(dá)發(fā)酵后期，故確定進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)時(shí)發(fā)酵天數(shù)為7 d，發(fā)酵天數(shù)不列入均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)安排表。試驗(yàn)因素水平如表1所示。

表1 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of uniform design experiment

2.5 酒精度測定

取100 mL大球蓋菇發(fā)酵酒液原液，再加入50 mL蒸餾水，加熱蒸餾，用酒精計(jì)測酒精含量[22]。

2.6 大球蓋菇保健酒的感官評(píng)定

參考葡萄酒品嘗學(xué)[23]中的感官分析方法對(duì)酒樣進(jìn)行感官評(píng)定，由10位（男女各5位）從事食品研究與開發(fā)的專業(yè)人員從澄清度、顏色、氣味、口味、風(fēng)格等方面對(duì)大球蓋菇保健酒進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果取平均值。

2.7 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)及訓(xùn)練

分別根據(jù)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)的因素個(gè)數(shù)和需優(yōu)化指標(biāo)的個(gè)數(shù)，利用MATLAB 7.0構(gòu)建BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，以均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)作為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)和訓(xùn)練樣本，以接種量、pH值、白砂糖添加量和料液比作為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入?yún)?shù)，分別以感官評(píng)分和酒精度作為輸出參數(shù)，隱層神經(jīng)元選擇經(jīng)驗(yàn)數(shù)10。BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中輸入層、隱含層的傳遞函數(shù)采用tansig，輸出層的傳遞函數(shù)采用purelin，訓(xùn)練次數(shù)1 000次，訓(xùn)練目標(biāo)為擬合殘差小于0.05，訓(xùn)練模型用于感官評(píng)分和酒精度的預(yù)測，以確定感官評(píng)分和酒精度最高時(shí)大球蓋菇保健酒的發(fā)酵條件[24-30]。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn)

在最優(yōu)發(fā)酵條件下進(jìn)行3批平行試驗(yàn)，確定每批大球蓋菇保健酒的感官評(píng)分和酒精度，結(jié)果取平均值。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

3.1.1 不同接種量對(duì)大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響接種量對(duì)大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響見圖1。

圖1 接種量對(duì)大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響Fig.1 The effection of inoculum concentration on fermentation of Stropharia rugoso-annulata health wine

由圖1可知，酵母接種量為6%時(shí)，酒精度和感官評(píng)分較高，當(dāng)酵母量過多過少，都會(huì)影響酒精度的高低，且影響酒體的總體質(zhì)量。

3.1.2 pH值對(duì)大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響

pH值對(duì)大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響見圖2。

圖2 pH值對(duì)大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響Fig.2 The effection of pH on fermentation of Stropharia rugosoannulata health wine

由圖2可知，檸檬酸添加量少，pH值偏高，發(fā)酵液的酸度低，檸檬酸添加量多，pH值偏低，發(fā)酵液的酸度高。pH值為3.8時(shí)，酒的感官質(zhì)量最佳，而且酒精度較高。

3.1.3 白砂糖添加量對(duì)大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響

白砂糖添加量對(duì)大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響見圖3。

圖3 白砂糖添加量對(duì)大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響Fig.3 The effection of sugar additive amount on fermentation of Stropharia rugoso-annulata health wine

由圖3可知，隨著白砂糖添加量的增加，酒精度逐漸升高，適當(dāng)增加白砂糖的用量，可賦予大球蓋菇保健酒良好的口感，感官評(píng)分較高。

3.1.4 料液比對(duì)大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響

料液比對(duì)大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響見圖4。

圖4 料液比對(duì)大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響Fig.4 The effection of solid-liquid ratio on fermentation of Stropharia rugoso-annulata health wine

由圖4可知，隨料液比的增加，酒精度逐漸提高，料液比對(duì)感官評(píng)分影響較大，料液比較小時(shí)，需要干菇量較多，大球蓋菇保健酒顏色較深，當(dāng)料液比較大時(shí)，需要干菇量較少，大球蓋菇保健酒酒體顏色太淡，當(dāng)料液比為1∶35（g/mL）時(shí)，保健酒酒體顏色較好，呈微黃色。

3.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響見圖5。

由圖5可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加酒精度不斷上升，第7天時(shí)到達(dá)發(fā)酵后期，酒精度幾乎不再上升，第7天發(fā)酵液酒香濃郁，具有大球蓋菇特有的清香。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響Fig.5 The effection of fermentation time on fermentation of Stropharia rugoso-annulata health wine

3.2 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果及分析

均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表3。

表3 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 3 The experiment program and data of uniform design

利用均勻設(shè)計(jì)V5.0對(duì)表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用逐步回歸法進(jìn)行分析，所得回歸方程如下，對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)影響不顯著的項(xiàng)已去除。

酒精度與各因素關(guān)系的回歸方程：

顯著性水平為0.05，相關(guān)系數(shù)R為0.962 1，說明回歸方程顯著，觀測值與擬合值誤差小，準(zhǔn)確度較高。

感官評(píng)分與各因素關(guān)系的回歸方程：

顯著性水平為0.05，相關(guān)系數(shù)R為0.968 5，說明回歸方程顯著，觀測值與擬合值誤差小，準(zhǔn)確度較高。

對(duì)表3均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)以酒精度為指標(biāo)進(jìn)行回歸擬合及分析，結(jié)果見表4。對(duì)表3均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)感官評(píng)分為指標(biāo)進(jìn)行回歸擬合及分析，結(jié)果見表5。

表4 以酒精度為指標(biāo)對(duì)均勻試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合方程的分析結(jié)果Table 4 The analysis result of regression fitted equation using uniform experiment data on the indicator of alcoholic strength

表5 以感官評(píng)分為指標(biāo)對(duì)均勻試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合方程的分析結(jié)果Table 5 The analysis result of regression fitted equation using uniform experiment data on the indicator of sensory score

由表4知，各因素對(duì)酒精度的主次影響順序?yàn)閤3（白砂糖添加量）＞x1（接種量）＞x2（pH值）＞x4（料液比），其中白砂糖添加量和接種量的影響顯著（P＜0.05），pH值和料液比的影響不顯著。

由表5知，各因素對(duì)感官評(píng)分的主次影響順序?yàn)閤3（白砂糖添加量）＞x1（接種量）＞x2（pH值）＞x4（料液比），其中白砂糖添加量和接種量的影響顯著（P＜0.05），pH值和料液比影響不顯著。

以酒精度為指標(biāo)，對(duì)回歸方程（1）進(jìn)行尋優(yōu)求解，可得酒精度最高時(shí)接種量x1為10.32%，白砂糖添加量x3為288 g/L，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定以酒精度為指標(biāo)時(shí)最優(yōu)發(fā)酵條件因素組合為：接種量10.32%，pH值為 3.8，白砂糖添加量 288 g/L，料液比為1 ∶35（g/mL），發(fā)酵天數(shù) 7 d，此時(shí)，酒精度可達(dá)12.755 2（體積比）。

利用均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)中的因素水平及待優(yōu)化的試驗(yàn)指標(biāo)數(shù)設(shè)計(jì)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)以感官評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行學(xué)習(xí)、訓(xùn)練的曲線見圖6。

經(jīng)1 000次迭代訓(xùn)練后，訓(xùn)練曲線收斂，擬合殘差為0.045 34，可用于感官評(píng)分的預(yù)測，將以酒精度為指標(biāo)時(shí)最優(yōu)發(fā)酵條件的數(shù)據(jù)輸入BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，在酒精度最大的條件下BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測的感官評(píng)分為81.510 1。

以感官評(píng)分為指標(biāo)，對(duì)回歸方程（2）進(jìn)行尋優(yōu)求解，可得感官評(píng)分最高時(shí)接種量x1為11.77%，白砂糖添加量x3為288 g/L，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定以感官評(píng)分為指標(biāo)時(shí)最優(yōu)發(fā)酵條件因素組合為：接種量11.77%，pH值為3.8，白砂糖添加量288 g/L，料液比為1∶35（g/mL），發(fā)酵天數(shù) 7 d，此時(shí)，感官評(píng)分可達(dá) 90 分。

利用均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)中的因素水平及待優(yōu)化的試驗(yàn)指標(biāo)數(shù)設(shè)計(jì)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)以酒精度數(shù)據(jù)進(jìn)行學(xué)習(xí)、訓(xùn)練的曲線見圖7。

圖6 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)以均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)中感官評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行學(xué)習(xí)、訓(xùn)練的曲線Fig.6 The BP neural network learning and training curve based on sensory score data of uniform design experiment

圖7 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)以均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)中酒精度數(shù)據(jù)進(jìn)行學(xué)習(xí)、訓(xùn)練的曲線Fig.7 The BP neural network learning and training curve based on alcoholic strength data of uniform design experiment

經(jīng)1 000次迭代訓(xùn)練后，訓(xùn)練曲線收斂，擬合殘差為0.042 95，可用于酒精度的預(yù)測，將以感官評(píng)分為指標(biāo)時(shí)最優(yōu)發(fā)酵條件的數(shù)據(jù)輸入BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，在感官評(píng)分最大的條件下BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測的酒精度為9.928 2（體積比）。

結(jié)合上述分析結(jié)果，并根據(jù)實(shí)際情況綜合考慮，最終選擇接種量11%、pH3.8、白砂糖添加量288 g/L、料液比1∶35（g/mL），發(fā)酵天數(shù)7 d，為大球蓋菇保健酒最優(yōu)發(fā)酵條件。

在確定的大球蓋菇保健酒最優(yōu)發(fā)酵條件下進(jìn)行3批平行試驗(yàn)，確定每批大球蓋菇保健酒的感官評(píng)分和酒精度，結(jié)果取平均值，結(jié)果顯示，在最優(yōu)發(fā)酵條件下大球蓋菇保健酒的感官評(píng)分可達(dá)87分，酒精度可達(dá)11.34（體積比）。

4 結(jié)論

通過綜合運(yùn)用單因素試驗(yàn)、均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)，結(jié)合BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的模擬和預(yù)測作用，對(duì)大球蓋菇保健酒的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定大球蓋菇保健酒最優(yōu)的發(fā)酵條件為：接種量11%、pH3.8、白砂糖添加量288 g/L、料液比1∶35（g/mL），發(fā)酵天數(shù)7 d。在此條件下發(fā)酵的大球蓋菇保健酒質(zhì)量最好，發(fā)酵酒液澄清透明，呈微黃色，香氣完整協(xié)調(diào)，細(xì)膩優(yōu)雅，具有大球蓋菇獨(dú)特的香氣，口感清新淡雅。

優(yōu)化得到的大球蓋菇保健酒發(fā)酵工藝條件具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景，開發(fā)大球蓋菇保健酒產(chǎn)品是大球蓋菇資源化利用的有效途徑之一。

參考文獻(xiàn)：

[1]Paul M Kirk,Paul F Cannon,David W Minter,et al.Dictionary of the fungi 10th Edition[M].USA：CABI Publishing,2008：432-434

[2]Carluccio A.The complete mushroom hook[M].Italy：Quadrille Publishing Ltd,2010：165-170

[3]Bruhn N J,N Abright,J D Mihail.Forest farming of winecap Stropharia mushrooms[J].Agroforest Syst,2010,79：267-275

[4]張穎.大球蓋菇北方棚內(nèi)反季栽培技術(shù)[J].中國林副特產(chǎn),2014(6)：54-55

[5]劉逍調(diào),劉梅香,朱慧斌,等.冬閑田稻草生料種植大球蓋菇技術(shù)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2014(2)：132-133

[6]周祖法,閆靜,王偉科.不同培養(yǎng)料配方栽培大球蓋菇試驗(yàn)[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2013(2)：149-150

[7]任琪,方顯出.秕谷料栽培大球蓋菇技術(shù)[J].食用菌,2015(4)：53

[8]劉蘇,姜玥,羅建平,等.5種食用菌多糖理化性質(zhì)及免疫活性的比較研究[J].食品科學(xué),2015,36(13)：252-256

[9]杜敏華,王小立,蘇海飛,等.大球蓋菇多糖超聲波提取及抗氧化活性[J].食品研究與開發(fā),2013,34(16)：18-22

[10]陳嬋,黃靖,丁玲.超聲波輔助提取大球蓋菇總黃酮工藝優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā),2015,36(24)：116-119

[11]陳君琛,翁敏劫,賴譜富,等.大球蓋菇多糖的分子質(zhì)量分布及其單糖的組成[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,44(10)：2109-2117

[12]王蜂,王曉煒,陶明煊,等.大球蓋菇多糖清除自由基活性和對(duì)D-半乳糖氧化損傷小鼠的抗氧化作用[J].食品科學(xué),2009,30(5)：233-238

[13]段永剛.大球蓋菇營養(yǎng)品質(zhì)分析、黃酮類化合物提取及應(yīng)用研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué),2010

[14]孫興榮,韓勇武,卞景陽.大球蓋菇菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)條件的研究[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2016(8)：114-117

[15]Liu Y T,Sun J,Luo Z Y,et a1.Chemical composition of five wild edible mushrooms collected from Southwest China and their antihyperglycemic and antioxidant activity[J].Food and Chemical Toxicology,2012,50(5)：1238-1244

[16]張時(shí),李萍,汪尚法.大球蓋菇的采后加工[J].山東蔬菜,2010(1)：43-44

[17]孫興榮.軟包裝糖醋大球蓋菇罐頭的研制[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2014(4)：101-104

[18]李萍.大球蓋菇采后處理加工方法[J].農(nóng)家致富,2008(11)：46-47

[19]倪淑君,張海峰,田碧潔,等.大球蓋菇采收后的初加工處理技術(shù)[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2016(7)：158

[20]陳君琛,周學(xué)劃,賴譜富,等.大球蓋菇漂燙液噴霧干燥制營養(yǎng)精粉工藝優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2012,28(21)：272-279

[21]方開泰,馬長興.正交與均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)[M].北京：科學(xué)出版社,2001[22]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).GB 5009.225-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2017

[23]李華.葡萄酒品嘗學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社,2010

[24]黃奕雯,戴玉杰,鐘成,等.基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模擬啤酒釀造過程中糖度及乙醇濃度的變化[J].中國釀造,2013(1)：25-28

[25]吳丹,楊基先,李昂,等.基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的產(chǎn)絮菌發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化[J].哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013(10)：30-35

[26]郭慧慧.基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與遺傳算法的蘇云金芽胞桿菌發(fā)酵優(yōu)化[J].生物技術(shù)進(jìn)展,2013(2)：137-139

[27]丁城,劉璐,胡勇.基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的梨醋發(fā)酵產(chǎn)酸量的預(yù)測[J].食品科技,2017(2)：273-276

[28]高愛同,畢珂,齊育平,等.BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法在乳酸菌發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化中的應(yīng)用[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2014(1)：112-116

[29]徐瑾輝,馬超,張振華,等.基于SOM與BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的葡萄酒質(zhì)量評(píng)價(jià)[J].長江大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2015(4)：16-20

[30]叢爽.面向MATLAB工具箱的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)理論與應(yīng)用[M].合肥：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社,2009