李杰，李斌，許彬，郭書賢，于麗萍

（南陽理工學(xué)院生化學(xué)院，河南南陽473004）

大球蓋菇（Stropharia rugoso-annulata）也稱酒紅色球蓋菇、皺環(huán)球蓋菇，是名貴珍稀食用菌，原產(chǎn)歐美，是歐美各國人工栽培的食用菌之一，也是聯(lián)合國糧農(nóng)組織向發(fā)展中國家推薦栽培的十大菇種之一[1-7]。大球蓋菇子實體富含多糖、皂甙、?；撬帷⒖傸S酮、多酚、維生素等多種生物活性成分，具有抗衰老，改善心血管功能，促進新陳代謝，提高人體抗病毒、抗細胞突變功能，提高免疫力等生理功能[8-15]。

對大球蓋菇的綜合利用研究報道比較少，目前，大球蓋菇的利用主要是采用傳統(tǒng)方法進行簡單的加工，如腌漬、罐頭加工、制作干品等，產(chǎn)品附加值不高[16-20]。本研究主要是對以大球蓋菇為原料研制新型保健酒的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，為大球蓋菇新型保健酒的研制奠定基礎(chǔ)，為我國的大球蓋菇資源尋求新的深加工途徑，為大球蓋菇精深加工提供理論依據(jù)，也為進一步大規(guī)模開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 原料

大球蓋菇干品：南陽市社旗縣福源生態(tài)菌業(yè)有限公司。

1.2 菌種

安琪活性釀酒干酵母（最適發(fā)酵溫度25℃）：安琪酵母股份有限公司。

1.3 液態(tài)種子培養(yǎng)基

馬鈴薯汁200.0 g/L，葡萄糖20.0g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O 3.0 g/L100.0 mg/L，pH 值自然，121 ℃滅菌20 min。

1.4 試劑

葡萄糖、（NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、：均為國產(chǎn)分析純；食品級檸檬酸、白砂糖。

1.5 儀器與設(shè)備

LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海中安醫(yī)療器械廠；TDL-40B臺式高速離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；101-2A電熱鼓風(fēng)干燥箱、DZKW-4電子恒溫水浴鍋：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；FA1004精密電子分析天平：上海天平儀器廠；DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏試驗設(shè)備有限公司；HZQ-B恒溫搖床：蘇州威爾試驗用品有限公司；SW-CJ-2G超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

2 方法

2.1 大球蓋菇保健酒生產(chǎn)工藝流程

大球蓋菇→清洗→切片→打漿→抽汁→滅菌→過濾→調(diào)糖→調(diào)pH值→發(fā)酵→陳釀→過濾→滅菌→裝瓶

2.2 原料預(yù)處理

大球蓋菇用0.1%的高錳酸鉀溶液浸泡20 min，然后用清水洗滌干凈。將洗凈的大球蓋菇切片，每片2 cm～3 cm，加適量自來水打成漿汁，漿汁經(jīng)真空抽濾、離心除去菇渣得到澄清菇液。大球蓋菇澄清汁在65℃下滅菌30 min后備用。

2.3 大球蓋菇保健酒發(fā)酵條件單因素試驗

每個搖瓶裝液量150 mL，分別考察酵母接種量（1%、3%、6%、9%、12%）、pH（3.2、3.5、3.8、4.1、4.4）、白砂糖用量[156、189、222、255、288（g/L）]、主發(fā)酵時間（5、6、7、8、9 d）、干菇和水的比例[1 ∶8、1 ∶15、1 ∶22、1 ∶29、1 ∶35（g/mL）]對大球蓋菇保健酒質(zhì)量影響，檢測指標(biāo)為酒精度、感官評分。

2.4 大球蓋菇保健酒發(fā)酵條件均勻設(shè)計試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇酵母接種量、pH值、白砂糖用量、干菇和水的比例進行均勻試驗設(shè)計[21]，由于發(fā)酵7 d時已達發(fā)酵后期，故確定進行均勻設(shè)計試驗時發(fā)酵天數(shù)為7 d，發(fā)酵天數(shù)不列入均勻試驗設(shè)計安排表。試驗因素水平如表1所示。

表1 均勻設(shè)計試驗因素水平表Table 1 The factors and levels of uniform design experiment

2.5 酒精度測定

取100 mL大球蓋菇發(fā)酵酒液原液，再加入50 mL蒸餾水，加熱蒸餾，用酒精計測酒精含量[22]。

2.6 大球蓋菇保健酒的感官評定

參考葡萄酒品嘗學(xué)[23]中的感官分析方法對酒樣進行感官評定，由10位（男女各5位）從事食品研究與開發(fā)的專業(yè)人員從澄清度、顏色、氣味、口味、風(fēng)格等方面對大球蓋菇保健酒進行評分，結(jié)果取平均值。

2.7 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)及訓(xùn)練

分別根據(jù)均勻設(shè)計試驗的因素個數(shù)和需優(yōu)化指標(biāo)的個數(shù)，利用MATLAB 7.0構(gòu)建BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，以均勻設(shè)計試驗的數(shù)據(jù)作為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)和訓(xùn)練樣本，以接種量、pH值、白砂糖添加量和料液比作為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入?yún)?shù)，分別以感官評分和酒精度作為輸出參數(shù)，隱層神經(jīng)元選擇經(jīng)驗數(shù)10。BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中輸入層、隱含層的傳遞函數(shù)采用tansig，輸出層的傳遞函數(shù)采用purelin，訓(xùn)練次數(shù)1 000次，訓(xùn)練目標(biāo)為擬合殘差小于0.05，訓(xùn)練模型用于感官評分和酒精度的預(yù)測，以確定感官評分和酒精度最高時大球蓋菇保健酒的發(fā)酵條件[24-30]。

2.8 驗證試驗

在最優(yōu)發(fā)酵條件下進行3批平行試驗，確定每批大球蓋菇保健酒的感官評分和酒精度，結(jié)果取平均值。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗結(jié)果及分析

3.1.1 不同接種量對大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響接種量對大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響見圖1。

圖1 接種量對大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響Fig.1 The effection of inoculum concentration on fermentation of Stropharia rugoso-annulata health wine

由圖1可知，酵母接種量為6%時，酒精度和感官評分較高，當(dāng)酵母量過多過少，都會影響酒精度的高低，且影響酒體的總體質(zhì)量。

3.1.2 pH值對大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響

pH值對大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響見圖2。

圖2 pH值對大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響Fig.2 The effection of pH on fermentation of Stropharia rugosoannulata health wine

由圖2可知，檸檬酸添加量少，pH值偏高，發(fā)酵液的酸度低，檸檬酸添加量多，pH值偏低，發(fā)酵液的酸度高。pH值為3.8時，酒的感官質(zhì)量最佳，而且酒精度較高。

3.1.3 白砂糖添加量對大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響

白砂糖添加量對大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響見圖3。

圖3 白砂糖添加量對大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響Fig.3 The effection of sugar additive amount on fermentation of Stropharia rugoso-annulata health wine

由圖3可知，隨著白砂糖添加量的增加，酒精度逐漸升高，適當(dāng)增加白砂糖的用量，可賦予大球蓋菇保健酒良好的口感，感官評分較高。

3.1.4 料液比對大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響

料液比對大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響見圖4。

圖4 料液比對大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響Fig.4 The effection of solid-liquid ratio on fermentation of Stropharia rugoso-annulata health wine

由圖4可知，隨料液比的增加，酒精度逐漸提高，料液比對感官評分影響較大，料液比較小時，需要干菇量較多，大球蓋菇保健酒顏色較深，當(dāng)料液比較大時，需要干菇量較少，大球蓋菇保健酒酒體顏色太淡，當(dāng)料液比為1∶35（g/mL）時，保健酒酒體顏色較好，呈微黃色。

3.1.5 發(fā)酵時間對大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響

發(fā)酵時間對大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響見圖5。

由圖5可知，隨著發(fā)酵時間的增加酒精度不斷上升，第7天時到達發(fā)酵后期，酒精度幾乎不再上升，第7天發(fā)酵液酒香濃郁，具有大球蓋菇特有的清香。

圖5 發(fā)酵時間對大球蓋菇保健酒發(fā)酵的影響Fig.5 The effection of fermentation time on fermentation of Stropharia rugoso-annulata health wine

3.2 均勻設(shè)計試驗結(jié)果及分析

均勻設(shè)計試驗方案及試驗數(shù)據(jù)見表3。

表3 均勻設(shè)計試驗方案及試驗數(shù)據(jù)Table 3 The experiment program and data of uniform design

利用均勻設(shè)計V5.0對表3中的試驗數(shù)據(jù)采用逐步回歸法進行分析，所得回歸方程如下，對試驗指標(biāo)影響不顯著的項已去除。

酒精度與各因素關(guān)系的回歸方程：

顯著性水平為0.05，相關(guān)系數(shù)R為0.962 1，說明回歸方程顯著，觀測值與擬合值誤差小，準(zhǔn)確度較高。

感官評分與各因素關(guān)系的回歸方程：

顯著性水平為0.05，相關(guān)系數(shù)R為0.968 5，說明回歸方程顯著，觀測值與擬合值誤差小，準(zhǔn)確度較高。

對表3均勻設(shè)計試驗的試驗數(shù)據(jù)以酒精度為指標(biāo)進行回歸擬合及分析，結(jié)果見表4。對表3均勻設(shè)計試驗的試驗數(shù)據(jù)感官評分為指標(biāo)進行回歸擬合及分析，結(jié)果見表5。

表4 以酒精度為指標(biāo)對均勻試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合方程的分析結(jié)果Table 4 The analysis result of regression fitted equation using uniform experiment data on the indicator of alcoholic strength

表5 以感官評分為指標(biāo)對均勻試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合方程的分析結(jié)果Table 5 The analysis result of regression fitted equation using uniform experiment data on the indicator of sensory score

由表4知，各因素對酒精度的主次影響順序為x3（白砂糖添加量）＞x1（接種量）＞x2（pH值）＞x4（料液比），其中白砂糖添加量和接種量的影響顯著（P＜0.05），pH值和料液比的影響不顯著。

由表5知，各因素對感官評分的主次影響順序為x3（白砂糖添加量）＞x1（接種量）＞x2（pH值）＞x4（料液比），其中白砂糖添加量和接種量的影響顯著（P＜0.05），pH值和料液比影響不顯著。

以酒精度為指標(biāo)，對回歸方程（1）進行尋優(yōu)求解，可得酒精度最高時接種量x1為10.32%，白砂糖添加量x3為288 g/L，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，確定以酒精度為指標(biāo)時最優(yōu)發(fā)酵條件因素組合為：接種量10.32%，pH值為 3.8，白砂糖添加量 288 g/L，料液比為1 ∶35（g/mL），發(fā)酵天數(shù) 7 d，此時，酒精度可達12.755 2（體積比）。

利用均勻設(shè)計試驗中的因素水平及待優(yōu)化的試驗指標(biāo)數(shù)設(shè)計BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的拓撲結(jié)構(gòu)，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)以感官評分數(shù)據(jù)進行學(xué)習(xí)、訓(xùn)練的曲線見圖6。

經(jīng)1 000次迭代訓(xùn)練后，訓(xùn)練曲線收斂，擬合殘差為0.045 34，可用于感官評分的預(yù)測，將以酒精度為指標(biāo)時最優(yōu)發(fā)酵條件的數(shù)據(jù)輸入BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，在酒精度最大的條件下BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測的感官評分為81.510 1。

以感官評分為指標(biāo)，對回歸方程（2）進行尋優(yōu)求解，可得感官評分最高時接種量x1為11.77%，白砂糖添加量x3為288 g/L，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，確定以感官評分為指標(biāo)時最優(yōu)發(fā)酵條件因素組合為：接種量11.77%，pH值為3.8，白砂糖添加量288 g/L，料液比為1∶35（g/mL），發(fā)酵天數(shù) 7 d，此時，感官評分可達 90 分。

利用均勻設(shè)計試驗中的因素水平及待優(yōu)化的試驗指標(biāo)數(shù)設(shè)計BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的拓撲結(jié)構(gòu)，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)以酒精度數(shù)據(jù)進行學(xué)習(xí)、訓(xùn)練的曲線見圖7。

圖6 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)以均勻設(shè)計試驗中感官評分數(shù)據(jù)進行學(xué)習(xí)、訓(xùn)練的曲線Fig.6 The BP neural network learning and training curve based on sensory score data of uniform design experiment

圖7 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)以均勻設(shè)計試驗中酒精度數(shù)據(jù)進行學(xué)習(xí)、訓(xùn)練的曲線Fig.7 The BP neural network learning and training curve based on alcoholic strength data of uniform design experiment

經(jīng)1 000次迭代訓(xùn)練后，訓(xùn)練曲線收斂，擬合殘差為0.042 95，可用于酒精度的預(yù)測，將以感官評分為指標(biāo)時最優(yōu)發(fā)酵條件的數(shù)據(jù)輸入BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，在感官評分最大的條件下BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測的酒精度為9.928 2（體積比）。

結(jié)合上述分析結(jié)果，并根據(jù)實際情況綜合考慮，最終選擇接種量11%、pH3.8、白砂糖添加量288 g/L、料液比1∶35（g/mL），發(fā)酵天數(shù)7 d，為大球蓋菇保健酒最優(yōu)發(fā)酵條件。

在確定的大球蓋菇保健酒最優(yōu)發(fā)酵條件下進行3批平行試驗，確定每批大球蓋菇保健酒的感官評分和酒精度，結(jié)果取平均值，結(jié)果顯示，在最優(yōu)發(fā)酵條件下大球蓋菇保健酒的感官評分可達87分，酒精度可達11.34（體積比）。

4 結(jié)論

通過綜合運用單因素試驗、均勻設(shè)計試驗，結(jié)合BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的模擬和預(yù)測作用，對大球蓋菇保健酒的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，確定大球蓋菇保健酒最優(yōu)的發(fā)酵條件為：接種量11%、pH3.8、白砂糖添加量288 g/L、料液比1∶35（g/mL），發(fā)酵天數(shù)7 d。在此條件下發(fā)酵的大球蓋菇保健酒質(zhì)量最好，發(fā)酵酒液澄清透明，呈微黃色，香氣完整協(xié)調(diào)，細膩優(yōu)雅，具有大球蓋菇獨特的香氣，口感清新淡雅。

優(yōu)化得到的大球蓋菇保健酒發(fā)酵工藝條件具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景，開發(fā)大球蓋菇保健酒產(chǎn)品是大球蓋菇資源化利用的有效途徑之一。

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