王從從，石磊，萬守朋，曹珊，張仁寬，鄭宇

（1.天津市利民調(diào)料有限公司，天津300308；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

柿子是我國常見的果品，成熟的柿果色澤鮮艷、味甜多汁，具有較高的營養(yǎng)和藥用價值。每100 g柿果可食部分約含蛋白質(zhì)0.67 g、脂肪0.1 g、碳水化合物16 g～20 g、鈣 10 mg、磷 19 mg 、鐵 0.2 mg。此外還含有單寧酸、胡蘿卜素、黃酮及瓜氨酸、無色花青素等功能物質(zhì)[1]。中醫(yī)認(rèn)為柿子有清熱、止咳、潤肺、健脾、止痢、涼血、解酒毒等功效[2]。由于柿子的加工技術(shù)落后，目前市場上柿子的加工品種十分單調(diào)，除了帶白霜的柿餅外，很少見到其它柿子加工品[3]。近年來隨著人們生活水平的提高和生產(chǎn)技術(shù)的進(jìn)步，以水果作為原料生產(chǎn)的果醋及果醋飲料由于其風(fēng)味獨(dú)特，且具有一定的保健功能受到市場的青睞，消費(fèi)量逐年攀升[4]。開發(fā)新型果醋，是一個提高經(jīng)濟(jì)效益和社會效益非常有效的途徑[5]，我國農(nóng)產(chǎn)品的深加工。目前市場上所見的果醋品種單一，主要以蘋果醋及其飲料為主，以柿子為原料發(fā)酵生產(chǎn)果醋，不僅可以充分開發(fā)利用柿子資源，還可以滿足消費(fèi)者對于飲料產(chǎn)品多樣化的要求，具有顯著的社會效益和經(jīng)濟(jì)效率。

百香果，香味濃郁、口感獨(dú)特，素有“飲料之王”的美稱。楊鋒[6]等對百香果進(jìn)行了加工適性的測定研究，研究表明百香果營養(yǎng)成分豐富，出汁率達(dá)43.33%，可溶性固形物16.5%，具有較好的熱穩(wěn)定性，是一種優(yōu)質(zhì)的果汁加工原料[7]。另外百香果還具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值。它含有豐富的生物活性成分，主要包括多酚類，如芹菜素、葒草素、槲皮黃酮等，生物堿等[8-9]。它具有抗焦慮、鎮(zhèn)靜、抗炎等作用，此外，還具有降血糖、降血脂等生理功效[10-12]。

本論文以柿子為原料，發(fā)酵生產(chǎn)柿子醋，同時為了改善柿子果醋風(fēng)味單一的缺點(diǎn)，以柿子原醋為基礎(chǔ)，采用百香果汁進(jìn)行調(diào)配，利用響應(yīng)面法對柿子果醋、百香果、白砂糖的添加量進(jìn)行優(yōu)化，開發(fā)混合果汁果醋飲料產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

柿子：產(chǎn)自天津薊縣；百香果：產(chǎn)自云南?。恢袦匦挺?淀粉酶（2.0×103U/g）、纖維素酶（1.8×103U/g）、果膠酶（6.0×104U/g）、木瓜蛋白酶（2.0×103U/g）：天津濱海諾奧酶工程技術(shù)有限公司；亞硫酸：天津市大茂化學(xué)試劑廠；碳酸氫鈉：天津市福晨化學(xué)試劑廠；檸檬酸：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；硅藻土：天津市化學(xué)試劑三廠；果酒專用酵母RW：安琪酵母股份有限公司；巴氏醋桿菌Acetobacter pasteurianus AC2005：中國普通微生物菌種保藏管理中心，CGMCC 3089。

1.2 主要設(shè)備

醫(yī)用凈化臺：蘇州凈化設(shè)備廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市實驗儀器廠；電子分析天平：上海奧豪斯儀器有限公司；回旋式恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司；離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；紫外分光光度計：蘇州島津儀器有限公司；恒溫水浴振蕩器：江蘇榮華儀器；生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所。

1.3 柿子果醋飲料工藝流程

1.4 試驗方法

1.4.1 柿子酒的制備

1.4.1.1 柿子酒的制備方法

將柿子果實進(jìn)行分選清洗破碎，加入亞硫酸稀釋液、纖維素酶、果膠酶，中溫型α-淀粉酶稀釋液攪拌混合均勻，置于50℃恒溫水浴中酶解大約2 h后，酶解期間每0.5 h攪拌翻動一次。加入木瓜蛋白酶稀釋液攪拌混合均勻繼續(xù)置于55℃恒溫水浴中酶解0.5 h，取出后迅速冷卻到室溫，得到柿子果漿；將柿子果漿經(jīng)120目濾布過濾得到柿子果汁。分別向柿子果漿和柿子果汁中加入適量檸檬酸調(diào)整pH值至酵母菌生長最適pH為4.5，加入葡萄糖調(diào)整含糖量至200 g/L～220 g/L左右。將兩組試驗分別按照接種量2 g/kg（以活性干酵母粉質(zhì)量計）接種酵母菌，在25℃條件下密閉發(fā)酵。待發(fā)酵液中還原糖含量基本穩(wěn)定、氣泡消失即視為發(fā)酵結(jié)束，終止發(fā)酵。將果漿組發(fā)酵液過12目濾布去除發(fā)酵后殘留的果渣和酒腳。通過測定兩組試驗最終酒精度、糖度、多酚、氨基肽氮含量，確定最佳的酒精發(fā)酵原料。

1.4.1.2 柿子酒相關(guān)指標(biāo)的檢測方法

總糖的測定按照GB/T 5099.7-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測定》。總酸的測定按照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》?？偡拥臏y定參照牛雪[13]等人的方法。氨基酸態(tài)氮的測定按照GB/T 18186-2000《釀造醬油》。酒精度的測定按照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.4.2 柿子醋制備

1.4.2.1 醋酸菌種子液制備

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，酵母膏15，自然pH值，121℃滅菌20 min，接種前加入無水乙醇至28 g/L。

刮取斜面試管中保存的菌體兩環(huán)，接入到種子培養(yǎng)基中。30℃，培養(yǎng)27 h，至OD610為1.5，酸度1.2 g/100 mL以上。

1.4.2.2 柿子醋發(fā)酵條件優(yōu)化

查閱文獻(xiàn)得出發(fā)酵溫度、接種量、初始乙醇濃度、初始酸度這4個條件為影響醋酸發(fā)酵的主要因素，并結(jié)合前期試驗結(jié)果各選擇3個水平對4個發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

最佳發(fā)酵溫度的確定：設(shè)置發(fā)酵溫度為28、30、32℃，在適宜條件下培養(yǎng)，檢測發(fā)酵液中的產(chǎn)酸量，以確定最佳發(fā)酵溫度。

最佳接種量的確定：利用得到的最佳發(fā)酵溫度，設(shè)置接種量為5%、10%、15%，檢測發(fā)酵液中的產(chǎn)酸量，以確定最佳接種量。

最佳初始乙醇濃度的確定：利用上述得到的最佳發(fā)酵條件，設(shè)置發(fā)酵初始乙醇濃度位7%、8%、9%，檢測發(fā)酵液中的產(chǎn)酸量，以確定最佳初始乙醇濃度。

最佳初始酸度的確定：利用上述得到的最佳發(fā)酵條件，設(shè)置初始酸度為0.5%、1%、1.5%，檢測發(fā)酵液中的產(chǎn)酸量，以確定最佳初始酸度。

上述4個單因素分別記作A、B、C、D進(jìn)行四因素三水平正交試驗，見表1。

表1 試驗因素水平Table 1 Experimental factors and levels

1.4.2.3 柿子醋的澄清

柿子果醋中加入5%的明膠，恒溫振蕩培養(yǎng)箱170 r/min 振蕩 1 h，進(jìn)行澄清、除澀[14]。

1.4.3 柿子醋飲料調(diào)配

依據(jù)感官品評方法，結(jié)合單因素試驗進(jìn)行三因素三水平優(yōu)化試驗，確定柿子果醋、白砂糖、百香果汁調(diào)配比例。利用Design-Expert設(shè)計BOX-Behnken試驗，以感官評分作為響應(yīng)值，通過回歸方程構(gòu)建擬合因素與響應(yīng)值的函數(shù)關(guān)系，尋求最優(yōu)的變量組合，其因素編碼水平如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗因素及水平Table 2 Box-Behnken experimental factors and levels

1.4.4 分析方法

邀請10名具有品評經(jīng)驗的人員，對不同調(diào)配下的百香柿子果醋飲料進(jìn)行感官品評，評價指標(biāo)分為色澤，香氣，口感，體態(tài)4個方面總分10分，見表3。

2 結(jié)果與分析

2.1 柿子酒發(fā)酵原料的比較

柿子酒的品質(zhì)直接決定柿子醋的品質(zhì)，本論文比較了柿子果漿發(fā)酵酒和柿子果汁發(fā)酵酒的5種理化指標(biāo)，如表4所示。

表3 感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Criteria for sensory evaluation

表4 柿子果漿發(fā)酵酒和果汁發(fā)酵酒的比較Table 4 Comparison of persimmon wine with mash or must

利用果漿發(fā)酵制作柿子酒發(fā)酵結(jié)束后酒中總糖含量低于果汁發(fā)酵酒，同時果漿酒酒精度高于果汁酒，這可能由于柿子果皮和果肉中含有較多的營養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)了酵母的生長從而導(dǎo)致果漿酒酒精度較果汁酒高。另外果漿酒中的多酚含量明顯高于果汁酒，提高了柿子酒的抗氧化能力，增強(qiáng)了產(chǎn)品的保健效果[15]，兩種原料生產(chǎn)的總酸和氨基酸態(tài)氮含量相差不大。最終確定利用果漿發(fā)酵酒進(jìn)行醋酸發(fā)酵。

2.2 柿子醋發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.2.1 溫度對柿子醋發(fā)酵的影響

溫度是影響微生物繁殖的重要因素之一，在一定溫度范圍內(nèi)微生物的生長繁殖隨著溫度的上升而增加，過高的溫度會在醋酸發(fā)酵中增加酸對菌體的傷害[16-17]。將柿子果漿酒置于不同的溫度下進(jìn)行醋酸發(fā)酵，溫度設(shè)置為：28、30、32℃，見圖 1。

如圖1所示，在30℃條件下巴氏醋桿菌AC2005發(fā)酵產(chǎn)酸速率最快，該菌株最適的發(fā)酵溫度為30℃。

2.2.2 接種量對柿子醋發(fā)酵的影響

接種量的大小直接影響發(fā)酵時間，增大接種量可以縮短發(fā)酵周期，但接種量過大時，菌體容易過早衰老，影響發(fā)酵效率[15]，見圖 2。

圖1 溫度對柿子醋發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of temperature on the persimmon vinegar fermentation

圖2 接種量對柿子醋發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of inoculation volume on persimmon vinegar fermentation

如圖2所示，5%接種量相對于10%和15%接種量產(chǎn)酸量低，10%和15%接種量，最終產(chǎn)酸無明顯區(qū)別，從節(jié)約成本方面考慮最終確定10%接種量為醋酸發(fā)酵最優(yōu)接種量。

2.2.3 初始乙醇濃度對柿子醋發(fā)酵的影響

乙醇是醋酸菌發(fā)酵的底物，但過高的乙醇濃度對醋酸菌的生長有抑制作用[18]，見圖3。

圖3 初始乙醇濃度對柿子醋發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of initial alcohol concentration on persimmon vinegar fermentation

如圖3所示，8%的乙醇沒有對醋酸菌產(chǎn)酸及生長有影響，且發(fā)酵效率高于7%初始乙醇濃度，而9%的乙醇則抑制了醋酸發(fā)酵，因此確定初始乙醇濃度為8%，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酸達(dá)（5.3±0.08）g/100 mL。

2.2.4 初始酸度對柿子醋發(fā)酵的影響

課題組前期研究表明，初始發(fā)酵條件下適宜的酸度會促進(jìn)醋酸發(fā)酵的產(chǎn)酸速率和菌體的活性，過高的酸度會脅迫細(xì)胞質(zhì)pH值的降低，導(dǎo)致一些相關(guān)的酸敏感糖分解酶的活性喪失（嚴(yán)重影響產(chǎn)生ATP的能力）和細(xì)胞膜、大分子物質(zhì)（如DNA和蛋白質(zhì)）的結(jié)構(gòu)損壞[19]，見圖 4。

圖4 初始酸度對柿子醋發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of initial acid concentration on persimmon vinegar fermentation

如圖4所示，1%的初始乙酸會促進(jìn)醋酸菌產(chǎn)酸及生長使發(fā)酵效率高于0.5%初始乙酸濃度，而1.5%的初始乙酸則會抑制醋酸菌菌體生長和發(fā)酵產(chǎn)酸效率。

2.2.5 正交試驗

通過單因素試驗得到的溫度（A）、接種量（B）、初始乙醇濃度（C）、初始酸度（D）4個對產(chǎn)量影響較大的因素，以最佳數(shù)據(jù)左右相鄰的數(shù)據(jù)作為各因素的3個水平進(jìn)行正交試驗設(shè)計L9（34），結(jié)果如表5所示。

表5 正交試驗L9（34）Table 5 The orthogonal experiment

續(xù)表5正交試驗L9（34）Continue table 5 The orthogonal experiment

由表 4 可以看出：RA＞RD＞RC＞RB，即對柿子醋發(fā)酵產(chǎn)酸的影響：溫度＞初始酸度＞初始乙醇濃度＞接種量。同時由K值結(jié)果還可以得出最優(yōu)發(fā)酵條件為A2B2C2D2，由于該組合并未在正交試驗中出現(xiàn)，為了進(jìn)一步驗證結(jié)果，進(jìn)行驗證性試驗，即按照組合A2B2C2D2進(jìn)行柿子醋發(fā)酵試驗，得到的最終酸度為5.94 g/100 mL，且酸度和得分為所有組合中最高。所以最優(yōu)組合為A2B2C2D2；即：30℃、接種量10%、初始乙醇濃度8%、初始酸度1%。以此條件進(jìn)行后續(xù)的試驗。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化百香柿子果醋飲料配方

2.3.1 柿子果醋添加量的確定

柿子果醋添加量對飲料風(fēng)味的影響見圖5。

圖5 柿子果醋添加量對飲料風(fēng)味的影響Fig.5 Effect of percentage of persimmon vinegar on beverage flavor

由圖5可知，當(dāng)柿子原醋添加量大于10%時，醋酸味較重，酸度偏高，直接飲用口感刺激明顯，添加量過低則醋酸風(fēng)味較低。果醋飲料中柿子醋的添加量在10%時，調(diào)配后的醋飲感官評分較高。

2.3.2 白砂糖添加量的確定

白砂糖添加量對飲料風(fēng)味的影響見圖6。

從圖6可以看出白砂糖添加量在6%時感官評分較高，白砂糖添加量高于6%時，口感過于甜膩，掩蓋了醋飲料的酸味特點(diǎn)；添加量低于6%時，醋味的刺激較明顯，因此白砂糖添加量確定為6%。

2.3.3 百香果汁添加量的確定

百香果能夠賦予柿子醋飲料獨(dú)特的熱帶水果風(fēng)味，且賦予了果醋金黃的色澤，不需要額外添加色素。百香果汁添加量少則果醋飲料的風(fēng)味不足；添加量過多，則百香果風(fēng)味過重，掩蓋了醋的風(fēng)味，見圖7。

圖6 白砂糖添加量對飲料風(fēng)味的影響Fig.6 Effect of percentage of sugar on beverage flavor

由圖7可知，柿子果醋飲料中的添加量在6%時調(diào)配后的飲料的感官評分最高。依據(jù)感官品評，結(jié)合單因素確定柿子原醋10%，白砂糖6%，百香果汁6%為較好調(diào)配比例，設(shè)計BOX-Behnken試驗，以感官評分作為響應(yīng)值，優(yōu)化柿子原醋（A）、白砂糖（B）、百香果汁（C）添加量。Box-Behnken試驗結(jié)果見表6，回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗結(jié)果見表7，回歸方程方差分析見表8。

表6 Box-Behnken試驗結(jié)果Table 6 Results of Box-Behnken experimental

續(xù)表6 Box-Behnken試驗結(jié)果Continue table 6 Results of Box-Behnken experimental

表7 回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗結(jié)果Table 7 Regression coefficients and significance test for the constructed quadratic polynomial model equation

表8 回歸方程方差分析表Table 8 Analysis of variance for the regression equation

對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到感官評分Y響應(yīng)面的回歸模擬方程：Y=9.20+0.28A+0.038B+0.76C-0.050AB+0.100AC-0.025BC-1.36A2-0.59B2-0.89C2。

由表7可知，模型項p＜0.000 1，說明Y與回歸方程的關(guān)系極為顯著，模型擬合較好，可信度極高。失擬差p=0.124 7＞0.05，說明所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例較小，殘差是隨機(jī)產(chǎn)生，模型符合實際情況，可以用此模型對感官品評進(jìn)行分析，結(jié)果可靠。由表8可知，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9924，校正系數(shù)R=0.982 5。說明模型可以解釋99.24%的感官品評，變異系數(shù)為1.85%，信噪比為28.630，試驗的可靠性高。

為了進(jìn)一步研究相關(guān)因素之間的交互作用，優(yōu)化調(diào)配比例，本試驗利用Design-Expert軟件對回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到相應(yīng)的響應(yīng)面立體圖等高線圖分析圖，見圖8。

圖8 各因素交互作用對感官品評的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.8 Surface plots of combined effects of three factors on sensory

圖8 等高線可以看出，A與B，B與C，A與C均有交互作用，但交互作用不明顯。Y值隨著A、B、C因素的增加先增加后減小，另外從響應(yīng)面圖可以看出，響應(yīng)值Y存在最大值，及Y值越大，果醋飲料的口感越好，因而在優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)上Y選取最大值。Design-Expert設(shè)計BOX-Behnken設(shè)計試驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通Y值方程求解可得A、B、C對應(yīng)的試驗值為A=10.63，B=5.52，C=7.41，此條件下感官評分最高為9.3630。為了試驗方便將結(jié)果修正為柿子原醋10.5%，白砂糖為5.5%，百香果汁為7.5%。在修正條件下3次平行試驗，所得感官評分為9.02，與模型預(yù)測值相近，表明該結(jié)果能很好的預(yù)測實際情況。

3 結(jié)論

本試驗以柿子果漿為底物發(fā)酵制酒，得到酒精度為12.5%的柿子酒。以柿子酒為原料采用單因素試驗和正交試驗優(yōu)化柿子果醋發(fā)酵工藝，得出最優(yōu)發(fā)酵條件為A2B2C2D2，即：30℃、接種量10%、初始乙醇濃度8%、初始酸度1%。經(jīng)驗證試驗，最終酸度為5.94 g/100 mL。以此果醋為主要原料，輔以百香果汁及白砂糖，研制新型果醋飲料。經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后柿子果醋飲料配方為：柿子果醋10.5%，白砂糖5.5%，百香果汁7.5%。最終飲料產(chǎn)品總酸度為（0.53±0.08）g/100 mL，總糖為 6.95%。其香味獨(dú)特，口感酸甜，清朗爽口，適合大眾飲用。

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