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        豬瘟抗體鑭系熒光免疫層析法的建立

        2018-06-19 07:07:04王澤洲王琴趙啟祖吳俊清章健吳冠英
        四川畜牧獸醫(yī) 2018年6期
        關(guān)鍵詞:微球豬瘟敏感性

        王澤洲 ,王琴 ,趙啟祖 ,吳俊清 ,章健 ,吳冠英

        (1.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,四川 成都 610041;2.成都微瑞生物科技有限公司,四川 郫都 611731;3.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081)

        豬瘟(CSF)是威脅我國養(yǎng)豬業(yè)的最重要的疫病之一,被列為一類動(dòng)物傳染病。長期以來,獸醫(yī)工作者先后研究建立了中和試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)(IHA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、膠體金技術(shù)等豬瘟檢測方法,在CSF的診斷、流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測等方面發(fā)揮著重要作用[1-6],但都存在著某些方面的不足。為此,本研究應(yīng)用鑭系元素作熒光標(biāo)記物建立了一種既具有金標(biāo)層析技術(shù)簡單、方便、快捷,又具有ELISA準(zhǔn)確、特異、敏感的豬瘟抗體鑭系熒光免疫層析快檢方法(LFICA)。

        1 材料和方法

        1.1 材料 CSFV E2蛋白、鑭系熒光納米微球和WellrayRWR-1608熒光儀(由成都微瑞生物科技有限公司研制),兔抗雞IgY抗體、雞IgY抗體,吸水紙、樣品墊、硝酸纖維素膜,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀亞胺,其他試劑均為國產(chǎn)分析純。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒 2型(PCV-2)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬乙型腦炎病毒(JEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)陽性血清由筆者單位保存。IDEXX試劑盒檢測的陽性和陰性血清分別由中牧股份成都藥械廠、華派生物藥業(yè)有限責(zé)任公司惠贈(zèng);臨床血清樣品由四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。

        1.2 制備 包被膜、抗原標(biāo)記微球、夾心法建立等均參照試劑盒說明書或按照相關(guān)規(guī)范操作。

        1.3 熒光免疫層析試紙條的組裝 在濕度小于30%,溫度20~25℃的環(huán)境下,把吸水紙、標(biāo)記物墊和樣品墊按順序粘貼在聚氯乙烯底板上形成微反應(yīng)體系,然后將其切割成0.5 cm寬,即成試紙條,將試紙條裝入卡殼中制成檢測卡,裝入鋁箔袋封存?zhèn)溆谩?/p>

        1.4 特異性試驗(yàn) 以建立的判斷標(biāo)準(zhǔn)(標(biāo)準(zhǔn)曲線)與PRRSV、PCV-2、PRV、PPV、JEV、PEDV、TGEV、BVDV陽性血清進(jìn)行豬瘟抗體鑭系熒光免疫層析檢測,同時(shí)設(shè)豬瘟陽性、陰性對照,以確定該試驗(yàn)方法是否發(fā)生交叉反應(yīng)。

        1.5 敏感性試驗(yàn) 將CSFV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清作1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560、1∶5 120、1∶10 240倍稀釋,每個(gè)稀釋度平行做4個(gè)重復(fù),用建立的豬瘟LFICA檢測,將其換算成S/P值,判斷其抗體檢出效價(jià)。

        1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

        1.6.1 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn) 在相同實(shí)驗(yàn)條件下,選取12份CSFV抗體水平不同的血清,每份血清樣本平行做8個(gè)重復(fù),用組裝的CSFV-LFICA試劑盒檢測,然后對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

        1.6.2 批間重復(fù)性試驗(yàn) 在相同實(shí)驗(yàn)條件下,選取12份CSFV抗體水平不同的血清,分別用4批CS FV-LFICA試劑盒檢測,然后對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

        1.7 比較性試驗(yàn)

        1.7.1 與IHA比較 血清樣本同時(shí)進(jìn)行IHA檢測和CSFV-LFICA試劑盒檢測,以IHA檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算CSFV-LFICA相對于IHA的符合率、敏感性和特異性。

        1.7.2 與國內(nèi)外ELISA試劑盒比較 血清樣本同時(shí)用IDEXX-ELISA試劑盒、法國LSI公司試劑盒、韓國JBT公司試劑盒、中監(jiān)所ELISA試劑盒檢測,分別以這些試劑盒的檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算CSFV-LFICA相對于各個(gè)ELISA試劑盒的符合率、敏感性和特異性。

        1.8 試劑盒的組裝及保存期試驗(yàn) CSFV-LFICA試劑盒由熒光檢測儀、檢測卡、連接線組成。試劑盒置4℃保存,于保存后 60、120、180、240、300、360、390d按照CSFV-LFICA的各個(gè)優(yōu)化條件,對CSFV陽性和陰性參考血清進(jìn)行檢測,并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

        1.9 應(yīng)用 用研制的CSFV-LFICA試劑盒檢測來自四川各地市的送檢樣本2366份,了解CSFV血清抗體陽性情況。

        2 結(jié)果

        2.1 測定條件的選擇

        2.1.1 標(biāo)記量選擇 把抗體/微球質(zhì)量比不同的標(biāo)記好的熒光微球稀釋相同倍數(shù),組裝成檢測卡,在檢測卡加樣孔分別加入80μL的參考標(biāo)準(zhǔn)液后,室溫下層析15min,考察并驗(yàn)證不同標(biāo)記量對標(biāo)記結(jié)果的影響。隨標(biāo)記抗原濃度的增加,各濃度點(diǎn)的結(jié)合率呈現(xiàn)先增后降的趨勢,在抗原/微球質(zhì)量比為1∶25時(shí)出現(xiàn)最大值。因此,選擇標(biāo)記比例為1∶25的免疫微球進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

        2.1.2 加樣量選擇 在其他條件一致的情況下,考察并驗(yàn)證樣本不同稀釋倍數(shù)對檢測結(jié)果的影響。在檢測卡加樣孔里分別加入稀釋 10、20、30、40、50、60、70倍的參考標(biāo)準(zhǔn)液,室溫下反應(yīng)15 min,結(jié)果表明隨稀釋倍數(shù)的增加,各濃度點(diǎn)的結(jié)合率均減小。當(dāng)樣本稀釋倍數(shù)為40倍時(shí),繼續(xù)降低稀釋倍數(shù),結(jié)合率增加不明顯,免疫反應(yīng)基本飽和。因此,后續(xù)試驗(yàn)選擇樣本稀釋倍數(shù)40倍為加樣量。

        2.1.3 檢測時(shí)間選擇 在檢測卡加樣孔中加入80μL的參考標(biāo)準(zhǔn)液,室溫下免疫層析,分別在5、10、15、20、25、30min時(shí)檢測,考察不同檢測時(shí)間對結(jié)果的影響。結(jié)果表明隨著檢測時(shí)間延長,各濃度點(diǎn)的結(jié)合率基本呈現(xiàn)增加的趨勢,試紙靜置15min檢測即能達(dá)到較高的結(jié)合率,而隨著檢測時(shí)間的增加,各濃度點(diǎn)的結(jié)合率不再發(fā)生大的變化,趨于平穩(wěn),說明在15min時(shí),試紙條上的雙抗原夾心吸附基本達(dá)到飽和。因此,本著快速簡便的原則,選擇檢測時(shí)間為加樣后15min。

        2.2 檢測結(jié)果的判讀 加樣后,由于層析作用液體向前移動(dòng),先后與包被在T線和C線上的抗原形成復(fù)合物,這時(shí),試紙條經(jīng)熒光檢測設(shè)備掃描顯示2條熒光帶。C線熒光掃描值基本一致,T線值隨加樣中抗體濃度的增加而升高。相應(yīng)的檢測結(jié)果以濃度為橫坐標(biāo),熒光值信號(hào)為縱坐標(biāo),經(jīng)對數(shù)函數(shù)數(shù)據(jù)處理程序擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)樣本為陰性時(shí),CSFV抗體濃度很低,T線熒光值很低或完全檢測不到;當(dāng)樣本為陽性時(shí),CSFV抗體濃度越高,T線熒光值也越高。無論是陽性還是陰性結(jié)果,C線總能顯示熒光,如果C線沒有熒光顯現(xiàn),無論T線有無,檢測結(jié)果均無效。

        2.3 CSFV-LFICA的方法學(xué)評(píng)估

        2.3.1 特異性試驗(yàn) 用CSFV E2蛋白和全病毒建立的CSFV-LFICA試劑盒檢測7種常見豬病及BVDV陽性血清,其熒光比值均低于0.40,呈陰性反應(yīng)。表明該方法與7種常見豬病及BVDV陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng),顯示出很好的特異性。

        2.3.2 敏感性試驗(yàn) 檢測CSFV標(biāo)準(zhǔn)陽性對照血清,當(dāng)血清稀釋至10240倍時(shí),熒光檢測仍為陽性。用同一份陽性血清同時(shí)做ELISA和CSFV-LFICA比較,后者比前者高1~2個(gè)滴度,證明該方法敏感性很好。

        2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)小于10%,批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于15%,表明CSFV-LFICA具有良好的重復(fù)性。

        2.3.4 與IHA作比較 在IHA檢測結(jié)果為陽性的128份血清樣本中,用CSFV-LFICA檢測出111份陽性,17份陰性;在IHA檢測結(jié)果為陰性的46份血清樣本中,用CSFV-LFICA檢測出38份陰性,8份陽性。CSFV-LFICA與IHA的符合率為85.6%,敏感性為86.7%,特異性為82.6%。

        2.3.5 與國內(nèi)外ELISA試劑盒作比較 同一份血清用CSFV-LFICA與其他四種試劑盒同時(shí)檢測,結(jié)果見表1。

        表1 CSFV-LFICA與其他試劑盒的檢測比較

        2.3.6 試劑盒保存期試驗(yàn) 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,CSFVLFICA試劑盒在保存390d后檢測陽性血清、陰性血清、P/N值,其變異系數(shù)均小于10%,說明該診斷試劑在保存12個(gè)月以上后仍然穩(wěn)定有效,進(jìn)一步的穩(wěn)定性試驗(yàn)還在進(jìn)行中。

        2.4 現(xiàn)場應(yīng)用試驗(yàn) 應(yīng)用CSFV-LFICA試劑盒檢測來自四川各地市的2366份送檢樣本,結(jié)果檢出血清抗體陽性2053份,陽性率為86.77%。

        3 討論

        3.1 鑭系熒光免疫層析法(LFICA)是在時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)基礎(chǔ)上建立起來的一種超微量快速免疫檢測技術(shù),它集合了酶標(biāo)記技術(shù)、放射標(biāo)記技術(shù)和同位素標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、無污染,且測定范圍寬,試劑盒壽命長,操作簡單和無放射性等優(yōu)點(diǎn),越來越受到各領(lǐng)域科研工作者的關(guān)注。在醫(yī)學(xué)界已有文獻(xiàn)報(bào)道,在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域才起步,需要研究的內(nèi)容和范圍還很多[7]。

        3.2 CSFV全病毒或E2蛋白的純度與含量是診斷試劑研制的基礎(chǔ),直接關(guān)系到所建立方法的特異性和敏感性。客觀上說,市售產(chǎn)品純度和質(zhì)量參差不齊,批次之間或有差異,因此,在使用前進(jìn)行檢定是非常必要的。

        3.3 本研究采用鑭系元素銪(Eu)作為熒光物質(zhì),與傳統(tǒng)熒光物質(zhì)相比,銪具有獨(dú)特的熒光光譜特性:Stokes位移大、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、熒光壽命很長[8]。由此建立的熒光方法特異性更強(qiáng)、敏感性更高,檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。熒光納米微球的大小和均勻度也是影響快檢試紙條的重要因素,本試驗(yàn)用的微球粒徑為70~200nm。微球表面經(jīng)過羧基(或氨基)活化處理,易與蛋白或抗體共價(jià)偶聯(lián),牢固結(jié)合,使標(biāo)記物的穩(wěn)定性提高,微球表面積比增大,大大提高了蛋白質(zhì)的包被量。每個(gè)微球可包裹成千上萬個(gè)熒光分子,使標(biāo)記效率和靈敏度大大提高。

        3.4 從CSFV-LFICA方法學(xué)評(píng)估可以知道,該方法的特異性、敏感性和重復(fù)性都較好。與國內(nèi)中監(jiān)所和國外IDEXX公司、西班牙的ELISA試劑盒檢測結(jié)果相比,符合率和敏感性都在90%以上,表明該方法完全可以用于CSF免疫抗體檢測。

        4 小結(jié)

        ELISA是目前應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的免疫檢測技術(shù),是檢測豬瘟抗體的主要方法,具有敏感性和特異性強(qiáng)、操作簡單、檢測相對快速、檢查微量、無輻射、高通量等優(yōu)點(diǎn),但需要比較完備的實(shí)驗(yàn)設(shè)備,操作人員也得有一定的專業(yè)技術(shù)水平和經(jīng)驗(yàn),且檢測流程至少需要2~4h,故對基層獸醫(yī)站和一般的養(yǎng)殖場不適用。豬瘟正向間接血凝試驗(yàn)(IHA)是農(nóng)業(yè)部推薦的豬瘟抗體檢測方法,該法操作簡單,不需要特殊的儀器設(shè)備,但敏感性低,待檢血清需經(jīng)滅活處理,增加了檢測時(shí)間和難度,且血清質(zhì)量嚴(yán)重影響檢測結(jié)果,而肉眼判定結(jié)果又增加了主觀性和不準(zhǔn)確性。膠體金免疫層析法(GICA)是近年來發(fā)展起來的一種快速檢測方法,操作簡單,使用方便,不需要特殊儀器,肉眼直接觀察和判定結(jié)果,全程只需要幾分鐘,但敏感性、重復(fù)性不高,產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊,漏檢率和誤診率較高。

        本研究建立的CSFV-LFICA,既具有膠體金免疫層析法(GICA)簡單、方便、快捷等優(yōu)點(diǎn),又具有ELISA法敏感、特異、微量等優(yōu)點(diǎn),檢測時(shí)間從2~4h縮短到十多分鐘,且檢測設(shè)備小巧便于攜帶。筆者認(rèn)為,該方法適于在基層獸醫(yī)部門、養(yǎng)殖場推廣應(yīng)用。

        [1] 李樹春,何建新,李德珍,等.豬瘟間接血凝試驗(yàn)的研究[J].中國獸醫(yī)科技,1993,23(7):3-6.

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        [3] 余興龍,涂長春,李作生,等.以重組mE2蛋白為抗原建立檢測豬瘟病毒抗體間接ELISA方法的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),1999,21(3):220-222.

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