王澤洲 ，王琴 ，趙啟祖 ，吳俊清 ，章健 ，吳冠英

（1.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；2.成都微瑞生物科技有限公司，四川 郫都 611731；3.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081）

豬瘟（CSF）是威脅我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的最重要的疫病之一，被列為一類動(dòng)物傳染病。長(zhǎng)期以來(lái)，獸醫(yī)工作者先后研究建立了中和試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)（IHA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、膠體金技術(shù)等豬瘟檢測(cè)方法，在CSF的診斷、流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)等方面發(fā)揮著重要作用[1-6]，但都存在著某些方面的不足。為此，本研究應(yīng)用鑭系元素作熒光標(biāo)記物建立了一種既具有金標(biāo)層析技術(shù)簡(jiǎn)單、方便、快捷，又具有ELISA準(zhǔn)確、特異、敏感的豬瘟抗體鑭系熒光免疫層析快檢方法（LFICA）。

1 材料和方法

1.1 材料 CSFV E2蛋白、鑭系熒光納米微球和WellrayRWR-1608熒光儀（由成都微瑞生物科技有限公司研制），兔抗雞IgY抗體、雞IgY抗體，吸水紙、樣品墊、硝酸纖維素膜，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基琥珀亞胺，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒 2型（PCV-2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）陽(yáng)性血清由筆者單位保存。IDEXX試劑盒檢測(cè)的陽(yáng)性和陰性血清分別由中牧股份成都藥械廠、華派生物藥業(yè)有限責(zé)任公司惠贈(zèng)；臨床血清樣品由四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。

1.2 制備 包被膜、抗原標(biāo)記微球、夾心法建立等均參照試劑盒說(shuō)明書或按照相關(guān)規(guī)范操作。

1.3 熒光免疫層析試紙條的組裝 在濕度小于30%，溫度20～25℃的環(huán)境下，把吸水紙、標(biāo)記物墊和樣品墊按順序粘貼在聚氯乙烯底板上形成微反應(yīng)體系，然后將其切割成0.5 cm寬，即成試紙條，將試紙條裝入卡殼中制成檢測(cè)卡，裝入鋁箔袋封存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 特異性試驗(yàn) 以建立的判斷標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)曲線）與PRRSV、PCV-2、PRV、PPV、JEV、PEDV、TGEV、BVDV陽(yáng)性血清進(jìn)行豬瘟抗體鑭系熒光免疫層析檢測(cè)，同時(shí)設(shè)豬瘟陽(yáng)性、陰性對(duì)照，以確定該試驗(yàn)方法是否發(fā)生交叉反應(yīng)。

1.5 敏感性試驗(yàn) 將CSFV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清作1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560、1∶5 120、1∶10 240倍稀釋，每個(gè)稀釋度平行做4個(gè)重復(fù)，用建立的豬瘟LFICA檢測(cè)，將其換算成S/P值，判斷其抗體檢出效價(jià)。

1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

1.6.1 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn) 在相同實(shí)驗(yàn)條件下，選取12份CSFV抗體水平不同的血清，每份血清樣本平行做8個(gè)重復(fù)，用組裝的CSFV-LFICA試劑盒檢測(cè)，然后對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6.2 批間重復(fù)性試驗(yàn) 在相同實(shí)驗(yàn)條件下，選取12份CSFV抗體水平不同的血清，分別用4批CS FV-LFICA試劑盒檢測(cè)，然后對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 比較性試驗(yàn)

1.7.1 與IHA比較 血清樣本同時(shí)進(jìn)行IHA檢測(cè)和CSFV-LFICA試劑盒檢測(cè)，以IHA檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算CSFV-LFICA相對(duì)于IHA的符合率、敏感性和特異性。

1.7.2 與國(guó)內(nèi)外ELISA試劑盒比較 血清樣本同時(shí)用IDEXX-ELISA試劑盒、法國(guó)LSI公司試劑盒、韓國(guó)JBT公司試劑盒、中監(jiān)所ELISA試劑盒檢測(cè)，分別以這些試劑盒的檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算CSFV-LFICA相對(duì)于各個(gè)ELISA試劑盒的符合率、敏感性和特異性。

1.8 試劑盒的組裝及保存期試驗(yàn) CSFV-LFICA試劑盒由熒光檢測(cè)儀、檢測(cè)卡、連接線組成。試劑盒置4℃保存，于保存后 60、120、180、240、300、360、390d按照CSFV-LFICA的各個(gè)優(yōu)化條件，對(duì)CSFV陽(yáng)性和陰性參考血清進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.9 應(yīng)用 用研制的CSFV-LFICA試劑盒檢測(cè)來(lái)自四川各地市的送檢樣本2366份，了解CSFV血清抗體陽(yáng)性情況。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)定條件的選擇

2.1.1 標(biāo)記量選擇 把抗體/微球質(zhì)量比不同的標(biāo)記好的熒光微球稀釋相同倍數(shù)，組裝成檢測(cè)卡，在檢測(cè)卡加樣孔分別加入80μL的參考標(biāo)準(zhǔn)液后，室溫下層析15min，考察并驗(yàn)證不同標(biāo)記量對(duì)標(biāo)記結(jié)果的影響。隨標(biāo)記抗原濃度的增加，各濃度點(diǎn)的結(jié)合率呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，在抗原/微球質(zhì)量比為1∶25時(shí)出現(xiàn)最大值。因此，選擇標(biāo)記比例為1∶25的免疫微球進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 加樣量選擇 在其他條件一致的情況下，考察并驗(yàn)證樣本不同稀釋倍數(shù)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。在檢測(cè)卡加樣孔里分別加入稀釋 10、20、30、40、50、60、70倍的參考標(biāo)準(zhǔn)液，室溫下反應(yīng)15 min，結(jié)果表明隨稀釋倍數(shù)的增加，各濃度點(diǎn)的結(jié)合率均減小。當(dāng)樣本稀釋倍數(shù)為40倍時(shí)，繼續(xù)降低稀釋倍數(shù)，結(jié)合率增加不明顯，免疫反應(yīng)基本飽和。因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇樣本稀釋倍數(shù)40倍為加樣量。

2.1.3 檢測(cè)時(shí)間選擇 在檢測(cè)卡加樣孔中加入80μL的參考標(biāo)準(zhǔn)液，室溫下免疫層析，分別在5、10、15、20、25、30min時(shí)檢測(cè)，考察不同檢測(cè)時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響。結(jié)果表明隨著檢測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)，各濃度點(diǎn)的結(jié)合率基本呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，試紙靜置15min檢測(cè)即能達(dá)到較高的結(jié)合率，而隨著檢測(cè)時(shí)間的增加，各濃度點(diǎn)的結(jié)合率不再發(fā)生大的變化，趨于平穩(wěn)，說(shuō)明在15min時(shí)，試紙條上的雙抗原夾心吸附基本達(dá)到飽和。因此，本著快速簡(jiǎn)便的原則，選擇檢測(cè)時(shí)間為加樣后15min。

2.2 檢測(cè)結(jié)果的判讀 加樣后，由于層析作用液體向前移動(dòng)，先后與包被在T線和C線上的抗原形成復(fù)合物，這時(shí)，試紙條經(jīng)熒光檢測(cè)設(shè)備掃描顯示2條熒光帶。C線熒光掃描值基本一致，T線值隨加樣中抗體濃度的增加而升高。相應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果以濃度為橫坐標(biāo)，熒光值信號(hào)為縱坐標(biāo)，經(jīng)對(duì)數(shù)函數(shù)數(shù)據(jù)處理程序擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)樣本為陰性時(shí)，CSFV抗體濃度很低，T線熒光值很低或完全檢測(cè)不到；當(dāng)樣本為陽(yáng)性時(shí)，CSFV抗體濃度越高，T線熒光值也越高。無(wú)論是陽(yáng)性還是陰性結(jié)果，C線總能顯示熒光，如果C線沒(méi)有熒光顯現(xiàn)，無(wú)論T線有無(wú)，檢測(cè)結(jié)果均無(wú)效。

2.3 CSFV-LFICA的方法學(xué)評(píng)估

2.3.1 特異性試驗(yàn) 用CSFV E2蛋白和全病毒建立的CSFV-LFICA試劑盒檢測(cè)7種常見豬病及BVDV陽(yáng)性血清，其熒光比值均低于0.40，呈陰性反應(yīng)。表明該方法與7種常見豬病及BVDV陽(yáng)性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，顯示出很好的特異性。

2.3.2 敏感性試驗(yàn) 檢測(cè)CSFV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照血清，當(dāng)血清稀釋至10240倍時(shí)，熒光檢測(cè)仍為陽(yáng)性。用同一份陽(yáng)性血清同時(shí)做ELISA和CSFV-LFICA比較，后者比前者高1～2個(gè)滴度，證明該方法敏感性很好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)小于10%,批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于15%，表明CSFV-LFICA具有良好的重復(fù)性。

2.3.4 與IHA作比較 在IHA檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的128份血清樣本中，用CSFV-LFICA檢測(cè)出111份陽(yáng)性，17份陰性；在IHA檢測(cè)結(jié)果為陰性的46份血清樣本中，用CSFV-LFICA檢測(cè)出38份陰性，8份陽(yáng)性。CSFV-LFICA與IHA的符合率為85.6%，敏感性為86.7%，特異性為82.6%。

2.3.5 與國(guó)內(nèi)外ELISA試劑盒作比較 同一份血清用CSFV-LFICA與其他四種試劑盒同時(shí)檢測(cè)，結(jié)果見表1。

表1 CSFV-LFICA與其他試劑盒的檢測(cè)比較

2.3.6 試劑盒保存期試驗(yàn) 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，CSFVLFICA試劑盒在保存390d后檢測(cè)陽(yáng)性血清、陰性血清、P/N值，其變異系數(shù)均小于10%，說(shuō)明該診斷試劑在保存12個(gè)月以上后仍然穩(wěn)定有效，進(jìn)一步的穩(wěn)定性試驗(yàn)還在進(jìn)行中。

2.4 現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用試驗(yàn) 應(yīng)用CSFV-LFICA試劑盒檢測(cè)來(lái)自四川各地市的2366份送檢樣本，結(jié)果檢出血清抗體陽(yáng)性2053份，陽(yáng)性率為86.77%。

3 討論

3.1 鑭系熒光免疫層析法（LFICA）是在時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRFIA）基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一種超微量快速免疫檢測(cè)技術(shù)，它集合了酶標(biāo)記技術(shù)、放射標(biāo)記技術(shù)和同位素標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、無(wú)污染，且測(cè)定范圍寬，試劑盒壽命長(zhǎng)，操作簡(jiǎn)單和無(wú)放射性等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到各領(lǐng)域科研工作者的關(guān)注。在醫(yī)學(xué)界已有文獻(xiàn)報(bào)道，在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域才起步，需要研究的內(nèi)容和范圍還很多[7]。

3.2 CSFV全病毒或E2蛋白的純度與含量是診斷試劑研制的基礎(chǔ)，直接關(guān)系到所建立方法的特異性和敏感性?？陀^上說(shuō)，市售產(chǎn)品純度和質(zhì)量參差不齊，批次之間或有差異，因此，在使用前進(jìn)行檢定是非常必要的。

3.3 本研究采用鑭系元素銪（Eu）作為熒光物質(zhì)，與傳統(tǒng)熒光物質(zhì)相比，銪具有獨(dú)特的熒光光譜特性：Stokes位移大、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、熒光壽命很長(zhǎng)[8]。由此建立的熒光方法特異性更強(qiáng)、敏感性更高，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。熒光納米微球的大小和均勻度也是影響快檢試紙條的重要因素，本試驗(yàn)用的微球粒徑為70～200nm。微球表面經(jīng)過(guò)羧基（或氨基）活化處理，易與蛋白或抗體共價(jià)偶聯(lián)，牢固結(jié)合，使標(biāo)記物的穩(wěn)定性提高，微球表面積比增大，大大提高了蛋白質(zhì)的包被量。每個(gè)微球可包裹成千上萬(wàn)個(gè)熒光分子，使標(biāo)記效率和靈敏度大大提高。

3.4 從CSFV-LFICA方法學(xué)評(píng)估可以知道，該方法的特異性、敏感性和重復(fù)性都較好。與國(guó)內(nèi)中監(jiān)所和國(guó)外IDEXX公司、西班牙的ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果相比，符合率和敏感性都在90%以上，表明該方法完全可以用于CSF免疫抗體檢測(cè)。

4 小結(jié)

ELISA是目前應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的免疫檢測(cè)技術(shù)，是檢測(cè)豬瘟抗體的主要方法，具有敏感性和特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)相對(duì)快速、檢查微量、無(wú)輻射、高通量等優(yōu)點(diǎn)，但需要比較完備的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，操作人員也得有一定的專業(yè)技術(shù)水平和經(jīng)驗(yàn)，且檢測(cè)流程至少需要2～4h，故對(duì)基層獸醫(yī)站和一般的養(yǎng)殖場(chǎng)不適用。豬瘟正向間接血凝試驗(yàn)（IHA）是農(nóng)業(yè)部推薦的豬瘟抗體檢測(cè)方法，該法操作簡(jiǎn)單，不需要特殊的儀器設(shè)備，但敏感性低，待檢血清需經(jīng)滅活處理，增加了檢測(cè)時(shí)間和難度，且血清質(zhì)量嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果，而肉眼判定結(jié)果又增加了主觀性和不準(zhǔn)確性。膠體金免疫層析法（GICA）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種快速檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)單，使用方便，不需要特殊儀器，肉眼直接觀察和判定結(jié)果，全程只需要幾分鐘，但敏感性、重復(fù)性不高，產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，漏檢率和誤診率較高。

本研究建立的CSFV-LFICA，既具有膠體金免疫層析法（GICA）簡(jiǎn)單、方便、快捷等優(yōu)點(diǎn)，又具有ELISA法敏感、特異、微量等優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)時(shí)間從2～4h縮短到十多分鐘，且檢測(cè)設(shè)備小巧便于攜帶。筆者認(rèn)為，該方法適于在基層獸醫(yī)部門、養(yǎng)殖場(chǎng)推廣應(yīng)用。

[1] 李樹春，何建新，李德珍，等.豬瘟間接血凝試驗(yàn)的研究[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，1993，23（7）：3-6.

[2] 張改平，郭軍慶，李青梅，等.動(dòng)物疫病免疫試紙快速檢測(cè)技術(shù)概述[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（9）：174-176.

[3] 余興龍，涂長(zhǎng)春，李作生，等.以重組mE2蛋白為抗原建立檢測(cè)豬瘟病毒抗體間接ELISA方法的研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1999，21（3）：220-222.

[4] 徐璐，范學(xué)政，梁智選，等.豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的臨床應(yīng)用研究[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2014，50（8）：36-41.

[5] 李嬌，王金良，祖立闖，等.豬瘟病毒重組E2蛋白PPA-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的研制及應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，31（10）：1390-1394.

[6] 楊明，陳伯祥，孫曉林，等.豬瘟膠體金診斷試紙條的研制[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45（2）：34-37.

[7] 王澤洲，吳俊清，張永寧，等.時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)的研究進(jìn)展[J].四川畜牧獸醫(yī)，2015，42（7）：34-37.

[8] 郭明明，周衍，周建波，等.熒光微球時(shí)間分辨免疫層析技術(shù)定量檢測(cè)甲胎蛋白的研究[J].免疫學(xué)雜志，2015，31（10）：897-901.