張 超,曾楊梅,姜 波,吳俊偉.*
(1.西南大學榮昌校區(qū),重慶 402460;2.重慶布爾動物藥業(yè)有限公司)
三氮脒屬于芳香雙脒類,是傳統(tǒng)的廣譜抗血液原蟲藥,對家畜梨形蟲、錐蟲和無形體均有治療作用,并在國內(nèi)外市場上具有廣泛的運用。由于注射用三氮脒粉末配制后易降解不能長期保存,且用量不準易導致中毒,導致三氮脒中毒的病例頻發(fā)。重慶布爾動物藥業(yè)有限公司獨立自主研制出一種新制劑三氮脒注射液,具有高度穩(wěn)定、安全的特性,且在集中化、規(guī)?;念A(yù)防和治療疾病的過程中能達到快速、準確的效果。雖然注射用三氮脒已有報道兔、豬、綿羊等藥動學的研究,但不同劑型在不同動物中的藥動學參數(shù)必會有所差異。為指導新藥設(shè)計和制定臨床給藥方案提供依據(jù),本試驗通過對三氮脒注射液與注射用三氮脒的比較藥動學研究,得到準確的數(shù)據(jù),為三氮脒注射液在臨床上的安全、合理使用提供依據(jù)。
高效液相色譜儀:配備自動進樣器和紫外檢測器,Waters 2695系列(美國Waters公司),色譜柱:Diamonsil Plus C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。電子分析天平,型號CPA225D(賽多利斯科學儀器有限公司),渦旋混合器,型號XW-80A(海門市其林貝爾儀器制造有限公司),高速離心機,1-14 型(德國 SIGMA 公司),可調(diào)微量移液器10~100、1000 μL(德國 Eppendorf公司)。
三氮脒對照品(NGL Fine-Chem Ltd, India,批號DA/K/121/12,含量86.9%);7% 三氮脒注射液(重慶布爾動物藥業(yè)有限公司研制,規(guī)格:100 mL∶7 g);注射用三氮脒(蘭州正豐藥業(yè)有限責任公司,規(guī)格:1 g)。甲醇、乙腈(美國Thermo公司,色譜純),磷酸二氫鉀、三乙胺、磷酸為分析純試劑。
重慶大足黑山羊,12只,雌雄各半,6~8月齡左右,體重范圍20~25 kg,試驗前常規(guī)飼養(yǎng),飲水、飼喂不含任何藥物。
動物按隨機交叉試驗設(shè)計分為2組。試驗前測定制劑的含量,按照2010版《獸藥使用指南》選擇3.5 mg·kg-1體重分別頸部肌內(nèi)注射三氮脒和三氮脒注射液。
給藥前采取空白血漿,給藥后0.083 h、0.25 h、0.5 h、0.75 h、1 h、1.5 h、2 h、4 h、10 h、24 h、48 h,每次采血約3 mL,置于肝素鈉抗凝管中,3000 r/min離心10 min,用移液器小心吸取血漿于1.5 mL EP管中,每個樣品保存兩份,置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
取500 μL血漿樣品,加入750 μL的沉淀劑(乙腈),立即渦旋混勻,靜置后14000 r·min-1離心15 min,吸取上清液,經(jīng)0.22 μm有機系針筒式過濾器過濾后用于HPLC分析。
流動相:0.085 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(含0.1%三乙胺,并用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)-甲醇=85:15(V/V),進樣量:40 μL,流速:1.0 mL·min-1,柱溫:40 ℃,紫外檢測波長: 370 nm。
將已知濃度的標準液加入山羊空白血漿中,配得低(0.5 μg·mL-1)、中(2 μg·mL-1)和高(5 μg·mL-1) 三個樣品濃度,按1.5 樣品處理方法處理樣品,進行HPLC測定;同時分別取濃度為 0.5 μg·mL-1、2 μg·mL-1、5 μg·mL-1三氮脒標準系列溶液進行 HPLC測定,不同濃度樣品分別重復5次,以峰面積比計算,求其回收率。每批(日內(nèi)) 作 5次重復,共作 5 個批次(日間)。計算每批內(nèi)和每批間的色譜峰面積平均值及標準誤,求得各變異系數(shù)。
在1.5 mL 的離心管中各加入空白血漿450 μL,后依次加入濃度為250 μg·mL-1、125 μg·mL-1、50 μg·mL-1、25 μg·mL-1、12.5 μg·mL-1、5 μg·mL-1的標準品工作液50 μL,制得三氮脒濃度為10μg·mL-1、5 μg·mL-1、2 μg·mL-1、1 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、0.2 μg·mL-1的血漿樣品,渦旋混勻,按血漿樣品方法處理后進樣分析,以三氮脒色譜峰面積為橫坐標(A),藥物濃度(B) 為縱坐標,繪制標準曲線,求得標準曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)。
給藥后不同時間點采集血漿樣品經(jīng)處理后,進行HPLC測定,采用3P97藥動學軟件,用Marquardt法以權(quán)重1,1/C,1/C2 3種進行曲線擬合,根據(jù)WSS和AIC值判斷最佳藥動學模型。采用SPSS 20對血藥濃度和藥動學參數(shù)進行方差分析。
取三氮脒對照品適量,制成水溶液,采用紫外分光光度計在200~400 nm的波長范圍內(nèi)進行掃描,在251 nm和370 nm均有吸收,而在370 nm處吸收值最大,且此波長靠近可見光范圍,對其他雜質(zhì)吸收比較弱,故選擇370 nm作為試驗的紫外檢測波長。
圖1 三氮脒對照品水溶液紫外掃描圖譜
在1.6的色譜條件下,三氮脒的保留時間為8.3 min。與血漿中的其他雜質(zhì)有效分離,峰型對稱性良好,無明顯拖尾,色譜圖如圖2。
血漿中三氮脒線性回歸方程為Y=16816X-1939.5 (r2=0. 9992),線性范圍為0.2~10 μg·mL-1,按信噪比S/N=3為檢測限(LOD),S/N=10為定量限(LOQ),求得本方法測定血漿中三氮脒檢測限為0.1 μg·mL-1,定量限為0.2 μg·mL-1。
按上述樣品處理方法,在0.5 μg·mL-1、2 μg·mL-1、5 μg·mL-1濃度下,平均回收率在(69.55±1.20)% ~(78.77±1.26)% 之間,批內(nèi)和批間系數(shù)均不超過10.0%。由此可知,此血漿處理方法用液相檢測方法可靠,重復性好。
A: 空白血漿;B:三氮脒對照品溶液;C:空白血漿添加三氮脒對照品;D:空白血漿添加三氮脒注射液圖2 三氮脒專屬性高效液相色譜圖
三氮脒在山羊體內(nèi)符合一級吸收二室模型,三氮脒不同時間點血藥濃度平均值見表1,GraphPad Prism 5繪制藥時曲線見圖3,主要藥動學參數(shù)見表2。
表1 單劑量注射三氮脒后各采血點羊血漿中三氮脒濃度(x±s,n=6)
圖3 山羊單劑量肌內(nèi)注射三氮脒注射液與注射用三氮脒后藥時曲線
根據(jù)紫外掃描結(jié)果,在370±2 nm的整數(shù)波長范圍內(nèi),并結(jié)合相關(guān)文獻,選擇370 nm作為本試驗的紫外檢測波長。
試驗前查看文獻報道三氮脒的流動相,并根據(jù)條件比較選擇不同流動相,最終選定磷酸鹽緩沖液和乙腈作為流動相,并用磷酸調(diào)節(jié)pH值在3.0左右。經(jīng)過調(diào)整流動相的比例,使保留時間適中并與雜質(zhì)有效分離,且色譜峰尖銳;在流動相中加入0.1%三乙胺使之先與色譜柱固定相中的硅羥基結(jié)合,從而減少三氮脒上的脒基等基團在離子鍵、化學鍵等作用導致的峰拖尾;pH值在3.0可以抑制色譜柱中十八烷基硅烷鍵合硅膠中的硅羥基離子化,減少離子間相互作用、有助于三氮脒分離,形成良好峰型。最終確定流動相為:0.085 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(含0.1%三乙胺,并用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)︰ 甲醇=85︰15(V/V)。
血漿中的藥物含量是反映動物體內(nèi)藥物濃度的重要指標。為了準確測定血漿中的藥物含量,需要完全釋放與蛋白結(jié)合的藥物,并去除蛋白質(zhì),同時也可保護儀器性能免受損害,延長色譜柱的使用期限。日常常用的蛋白沉淀劑是甲醇、乙腈、丙酮等與水混溶的有機溶劑,通過與蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白質(zhì)凝聚。通過篩選最終選擇乙腈作為沉淀劑,操作簡便并能有效的除去蛋白質(zhì),儀器響應(yīng)值高,測量結(jié)果準確。
表2 羊單劑量注射三氮脒注射液與注射用三氮脒后主要藥動學參數(shù)比較
從吸收半衰期(t1/2ka)、分布半衰期(t1/2α)可以看出三氮脒注射液比三氮脒具有緩慢吸收、快速分布的特性,從而保證藥物在體內(nèi)的安全性。試驗中三氮脒的達峰濃度(Cmax)為5.97 μg·mL-1、達峰時間(Tmax)為0.22 h與報道大致相符,與三氮脒注射液的Cmax為7.63 μg·mL-1和Tmax為0.40 h比較,三氮脒注射液在體內(nèi)達到平衡時所需要的時間更長和濃度更高的特點,表明三氮脒注射液的安全性更好,不良反應(yīng)更少。三氮脒的藥時曲線下面積(AUC)為53.96 μg·mL-1*h,與報道三氮脒在治療急性感染期牛的AUC為49.05 μg·mL-1*h基本相符,而三氮脒注射液的藥時曲線下面積AUC增加了23.47 μg·mL-1*h,表明藥物在山羊體內(nèi)的含量更高,作用時間相對延長,起到緩釋長效的特點。劑型是影響藥物動力學的重要因素,不同劑型的藥物在機體內(nèi)藥物動力學特征有所差異。姚龍泉等報道,不同劑型三氮脒在正常動物體內(nèi),達峰濃度存在顯著差異。通過改變藥物的劑型研發(fā)具有高度穩(wěn)定、安全且使用方便的產(chǎn)品將是一種趨勢。
三氮脒注射液以3.5 mg·kg-1肌內(nèi)注射后,山羊血漿中Cmax可達到7.63 μg·mL-1,在給藥后24 h內(nèi)血藥濃度維持在0.89 μg·mL-1,高于對常見原蟲的MIC值,因此,推薦三氮脒注射液可按3.5 mg·kg-1劑量注射給藥,1 ~2日1次。
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