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(1.廣西大學動物科技學院， 廣西 南寧 530004；2.廣西玉林市動物衛(wèi)生監(jiān)督所)

犬瘟熱(Canine distemper , CD) 是由副粘病毒科副粘病毒亞科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒( Canine distemper virus, CDV) 引起的一種累及犬科和其他食肉目動物的高度接觸傳染性、致死性傳染病。在臨床上以雙相熱、卡他性鼻炎以及隨后引起支氣管炎、卡他性肺炎、嚴重胃腸炎和神經癥狀等為主要特征，且容易繼發(fā)其它病毒或細菌的混合感染和二次感染。發(fā)病率幾乎達100%，死亡率達30%～80%不等，素有“毀滅性傳染病”之稱。犬瘟熱病毒為單股不分節(jié)段的、非重疊的負鏈RNA病毒。病毒粒子中的主要蛋白有核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)、基質蛋白(M)、融合蛋白(F)、附著蛋白或血凝蛋白(H)。N蛋白是CDV中含量最高的結構蛋白，N蛋白構成螺旋狀的殼體，供RNA結合。N蛋白是具有免疫原性的保守結構蛋白。N蛋白上含有B淋巴細胞抗原表位，在細胞免疫方面有著重要作用；且N蛋白與病毒的毒力密切相關，在病毒感染時可引起強烈的抗體反應，尤其在感染初期F和H蛋白特異性抗體低于檢測水平時，N蛋白特異性抗體仍能被檢出。因此，N蛋白在犬瘟熱診斷上具有重要意義。本研究旨在克隆CDV-N截短體基因，并構建其原核表達產物，純化CDV-截短體蛋白，為制備CDV單克隆抗體和膠體金診斷試紙條奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

感受態(tài)細胞DH5α和BL21，pMD18T-CDV-N和 pET30a質粒為本實驗室保存，pMD18-T質粒購自大連寶生物公司。

1.2 主要試劑

LA Taq 酶、DNA marker購自大連寶生物公司，限制性內切酶Bam HⅠ、HimdⅢ、T4 DNA連接酶、蛋白預染marker 購自Fermentas 公司，鼠源性His標簽單克隆抗體、HRP標記的山羊抗鼠IgG 購自北京康為公司； Ni-NTA agarose購自德國Qiagen公司。

1.3 CDV-N截短體基因克隆

CDV-N基因全長1572bp，共編碼523個氨基酸。用DNAStar 軟件預測CDV-N588蛋白B細胞抗原表位，選擇其中抗原表位集中的一段(氨基酸位點：328-523)用于原核表達。用Primer Premier 5.0軟件設計CDV-N截短體上游引物 5'-TATGGATCCTCCTACCCACTGCTCT-3' 及下游引物 5'-CCCAAGCTTATTGAGTAGCTCTCTATC-3'。上游引物中引入BamH I 酶切位點，下游引物中引入Hind III 酶切位點(下劃線部分)，預期擴增片段長度為588 bp。引物由廣州invitogen公司合成。以pMD18T-CDV-N 質粒為模板，PCR 擴增CDV-N截短體基因。 PCR 反應體系：LA Taq 0.5 μL 10×LA PCR Buffer 5 μL, dNTP 8μl, 模板1μL ，上、下游引物(25μM)各1 μl ，加水至50μl。 PCR 反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，進行膠回收。膠回收產物與pMD18-T 載體16℃連接過夜，轉化感受態(tài)細胞DH5α，LA 平板培養(yǎng)過夜，挑斑、增菌，小提質粒進行酶切鑒定。陽性質粒送廣州invitogen公司測序。測序正確的質粒命名為pMD18T-CDV-N588。

1.4 CDV-N截短體基因原核表達載體構建

對pMD18T-CDV-N588和pET30a質粒用限制性內切酶Bam H Ⅰ和Himd Ⅲ 分別雙酶切 ，分別膠回收CDV-N588片段和線性化的pET30a，T4 DNA連接酶16℃連接過夜, LA 平板培養(yǎng)過夜，挑斑、增菌，小提質粒進行酶切鑒定。陽性質粒送廣州invitogen公司測序。測序正確的質粒命名為pET30a-CDV-N588。

1.5 His-CDV-N588 融合蛋白在大腸桿菌中的誘導表達

將酶切鑒定為陽性的重組質粒pET30a-CDV-N588轉化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，涂板，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單個菌落，加入含有50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)(220 rpm )過夜。取重組菌按1∶50的體積比轉接入含50 mg/L卡那霉素的15 mL LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600=0.8 時，取少量菌液作為陰性對照，剩余菌液中加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，在37℃中誘導表達4 h。收集菌液進行SDS-PAGE電泳分析。

1.6 His-CDV-N588 融合蛋白純化

將重組菌按1∶50的體積比對接1000 mL含50 mg/L 卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃恒溫搖床培養(yǎng)至OD590=0.8時，加入1 mmol/L的IPTG誘導表達，4 h后收集菌體。隨后的蛋白純化按照Qiagen公司Ni-NTA argrose使用說明進行操作。離心收集菌體沉淀，每1 g沉淀濕重加5 mL Buffer B(100 mM NaH2PO4，10 mM Tris·Cl，8 M urea，pH 8.0) 重懸菌體，置于室溫下振搖，超聲破碎10 min, 12000 rmp離心15 min，收集上清。按1∶4比例，將50%Ni-NTA瓊脂糖珠和菌體裂解液上清裝入純化柱，室溫下置水平搖床振搖60 min混勻，過柱。用2倍柱床體積Buffer C(100 mM NaH2PO4，10 mM Tris·Cl，8 M urea，pH 6.3)洗脫3次，用2倍柱床體積Buffer D(100 mM NaH2PO4，10 mM Tris·Cl，8 M urea，pH 5.9)洗脫1次，再用用2倍柱床體積Buffer E(100 mM NaH2PO4，10 mM Tris·Cl，8 M urea，pH 4.5)洗脫His-CDV-N588融合蛋白，洗脫5次。分別收集少量菌體裂解液上清、沉淀、過柱液、Buffer C和Buffer E洗脫品進行SDS-PAGE分析。

1.7 His-CDV-N588融合蛋白Western blotting檢測

分別收集少量非純化菌體蛋白和純化了的His-CDV-N588融合蛋白，進行SDS-PAGE，用濕轉法將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，用TBST緩沖液漂洗10 min, 然后用TBST配制的3%BSA, 4℃封閉過夜。棄去封閉液，加入用封閉液稀釋的His單克隆抗體(1∶500)室溫孵育2 h, 然后4℃過夜。TBST洗膜3次，每次10 min, 加入HRP標記的山羊抗鼠IgG(1∶1500), 室溫孵育2 h, TBST洗膜3次，每次10 min。加入化學發(fā)光劑A、B作用5 min, 在暗盒內壓X光片(轉印膜蛋白面朝上)，曝光、顯影和定影。用預染蛋白marker判定目的蛋白的相對分子量。

2 結果

2.1 CDV-N截短體基因PCR擴增

CDV-N588PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得大小約為0.6 kb左右的片段，與預期長度一致(圖1)。

2.2 pMD18T-CDV-N588重組質粒酶切鑒定和測序

重組質粒pMD18-T-CDV-N588經Bam HI和HindⅢ進行酶切鑒定，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠圖上出現了約2.7 kb和0.6 kb的預期條帶(圖2)，表明該重組質粒為陽性。與GenBank上己公布的同名基因(登錄號：HM596308.1)相比較，核苷酸序列(圖3)和推導的氨基酸序列(圖4)相似性為均為99%。

M: DNA marker DL 2000；

M1：DNA MarkerDL 2000；

圖3 CDV-N截短體基因測序結果

圖4 推導的CDV-N截短體基因氨基酸序列

2.3 CDV-N截短體基因原核表達載體構建

Bam HI 和Hind Ⅲ 雙酶切原核表達質粒pET30a-CDV-N588，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠圖片上顯示了約5.9 kb和0.6 kb預期條帶(圖5)，結果表明原核表達重組質粒構建成功。

2.4 重組質粒pET30a-CDV-N588在大腸桿菌中的誘導表達

將重組質粒pET30a-CDV-N588轉化大腸桿菌BL21，經1 mmo/L 的 IPTG誘導表達和未誘導重組菌液進行SDS-PAGE凝膠電泳，結果顯示IPTG誘導的重組菌液在相對分子量約30 KDa處有蛋白條帶，而未誘導的重組菌液未出現此條帶(圖6)。

M：預染蛋白marker；1、3、5、7：未誘導的重組BL21；

2.5 His-CDV-N588融合蛋白純化

應用Ni-NTA瓊脂糖珠在變性條件下純化的His-CDV-N588融合蛋白呈現單一條帶(圖7)，純度高。純化前后的蛋白樣品經Western blotting檢測，均呈現預期大小的蛋白條帶(圖8)，證明筆者確實獲得了His-CDV-N588融合蛋白。

M：預染蛋白marker；1:未誘導的重組BL21;

M：預染蛋白marker；1:未誘導的重組BL21;

3 討論

近些年CDV-N基因的克隆、原核或真核表達研究主要選用N蛋白基因全長片段。本實驗截取CDV-N基因B細胞抗原表位較集中的一段用于原核表達，獲得了高純度的His-CDV-N截短體融合蛋白，該片段可能比全長CDV-N基因具有更好的免疫原性。

近些年，筆者所在實驗室在原核表達、蛋白純化和多克隆抗體制備方面做了大量工作，經過長時間探索，發(fā)現真核基因在原核細胞中多以包涵體形式表達，用8 mol/L(pH 8.0)溶解包涵體，變性條件下純化His標簽融合蛋白行之有效，純化后的蛋白無需復性，就可以直接免疫兔或鼠制備多克隆或單克隆抗體。這些前期研究建立的技術平臺為CDV-N截短體基因原核表達和蛋白純化提供了有力的技術支持。

表達載體上的6×His標簽序列與Ni離子具有很強的親和力， His標簽蛋白結合能牢固結合在Ni-NTA 瓊脂糖珠介質上。純化過程中，雜蛋白富含組氨酸區(qū)域會非特異性地與Ni-NTA瓊脂糖珠介質結合從而影響純化效率。但蛋白是兩性分子，帶電性質可隨pH的變化而變化，當雜蛋白洗脫液pH值與目的蛋白等電點pH值相近時，雜蛋白被洗脫;降低pH，可以減弱His標簽蛋白與Ni離子的結合力，從而能洗脫并得到較高純度的目的蛋白。本研究中CDV-N588蛋白的等電點pH值為5.4，筆者將雜蛋白洗脫液pH值調至6.3(Buffer C)和5.9(Buffer D)，目的蛋白洗脫液(Buffer E)pH調至4.5，有效地解決了雜蛋白污染問題。在純化過程中，細胞破碎條件和裂解液過柱速率也影響純化效果。超聲波破碎功率太高和工作時間太久會產生氣泡影響破碎效果，功率太低和間隔時間太短則會破碎不完全。工作5 s，間隔10 s，360 W作用30 min，是超聲波破碎最佳條件；細胞裂解液過柱速率不能太快，否則會導致目的蛋白CDV-N588與純化介質結合率下降，最佳過柱速率為30滴/min。通過對純化過程的優(yōu)化，我們順利得到了His-CDV-N588融合蛋白。

4 結論

采用PCR技術，成功擴增了CDV-N截短體基因片段， 成功構建了CDV-N截短體基因原核表達載體， pET30a-CDV-N588在大腸桿菌中得以高效表達，純化后的His-CDV-N588蛋白純度較高，可用于單克隆或多克隆或抗體的制備。

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