(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 青島 266021)

惡性腫瘤傳統(tǒng)的三大治療方式是放療、化療、手術(shù)治療。阿霉素(DOX)是一種抗腫瘤譜廣泛的化療藥物，可以抑制DNA的合成從而達(dá)到抗腫瘤效果[1]。但是DOX具有損傷骨髓造血功能、心臟毒性大等藥物副作用[2]，如何將DOX靶向運(yùn)輸?shù)侥[瘤部位并減少其在正常組織中的分布將成為研究的關(guān)鍵。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米醫(yī)學(xué)受到了越來越廣泛的關(guān)注并對疾病治療提供了許多新的思路。其中，納米金由于生物相容性好、性質(zhì)穩(wěn)定、合成簡便、容易修飾以及無毒等優(yōu)點(diǎn)一直是研究的熱點(diǎn)之一[3]，并廣泛應(yīng)用于生物成像、生物傳感、載藥等領(lǐng)域[4-5]，所以這類金納米材料可以作為載藥平臺，結(jié)合DOX用于抗腫瘤藥物的運(yùn)輸。葉酸(FA)是機(jī)體生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，作為一種物質(zhì)合成必須的維生素，F(xiàn)A在增生旺盛的細(xì)胞中需求量更大[6]。FA可以通過葉酸受體(FR)進(jìn)入細(xì)胞，F(xiàn)R在正常細(xì)胞表面低表達(dá)，而在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的表面過度表達(dá)，以使生長旺盛的腫瘤細(xì)胞獲得更多的FA[7]。因此，可利用FR的表達(dá)特性，將FR作為藥物靶向的重要分子，結(jié)合抗腫瘤藥物構(gòu)建FA靶向的載藥平臺用于抗腫瘤研究[8]。有研究表明，人宮頸癌HeLa細(xì)胞表面FR是過量表達(dá)的[9]，而人乳腺癌MCF-7細(xì)胞表面FR是低表達(dá)的[10]。本研究以牛血清白蛋白為模板合成納米金(Au-BSA)，并以Au-BSA作為載體，結(jié)合FA提供靶向功能，結(jié)合DOX作為化療藥物，建立FA靶向的Au-BSA載體并負(fù)載阿霉素(Au-BSA-DOX-FA)，用于探討其對FR高表達(dá)的HeLa細(xì)胞的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料來源

HeLa細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞和HSF細(xì)胞由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院提供。

1.2 主要試劑

牛血清白蛋白(BSA)購于上海實(shí)生西巴斯科技發(fā)展有限公司；氯金酸、抗壞血酸、葉酸、順烏頭酸酐、1，4-二氧六環(huán)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DOX購于美國Sigma公司。

1.3 構(gòu)建Au-BSA-DOX-FA

1.3.1制備BSA修飾的Au-BSA 將10 mL質(zhì)量濃度為5 g/L牛血清白蛋白溶液與1 mL濃度為10 mmol/L的氯金酸溶液混合，室溫下置于磁力攪拌器上攪拌30 min，轉(zhuǎn)速為10 00 r/min。然后加入20 mg抗壞血酸繼續(xù)攪拌2 h。溶液由最初的淺藍(lán)色首先先變?yōu)闊o色再變?yōu)樗{(lán)紫色，說明Au-BSA已經(jīng)制備完成。在透射電子顯微鏡下觀察所合成的Au-BSA，并利用紫外可見分光光度計(jì)測量其全波長吸收光譜。Au-BSA在室溫下可以穩(wěn)定存在3個(gè)月以上。

1.3.2將Au-BSA與DOX和FA結(jié)合 將7 mg DOX溶解于4 mL蒸餾水中，冰水浴。將5 mg順烏頭酸酐溶解于200 μL的1，4-二氧六環(huán)中，然后緩慢加入上述DOX溶液中，并攪拌。用0.5 mol/L NaOH迅速將上述反應(yīng)物的pH調(diào)至9.0，在冰水浴中反應(yīng)20 min，然后用1 mol/L的HCl將pH調(diào)至7.0，攪拌30 min。隨后繼續(xù)滴加HCl直至形成較大沉淀(沉淀為順烏頭酸酐與DOX的混合物)，冰水浴15 min后，80 00 r/min離心10 min，去除上清液后，得到沉淀物。該沉淀物與7 mg EDC、3 mg NHS一起溶解于3 mL蒸餾水中，室溫黑暗中攪拌4 h，上述混合溶液與30 g/L的Au-BSA溶液2 mL混合后繼續(xù)黑暗中攪拌16 h。反應(yīng)完成后，通過葡萄糖凝膠G-25分離去除多余的Au-BSA和DOX，即得到Au-BSA-DOX復(fù)合物。

將質(zhì)量5 mg的FA溶解于體積1 mL DMSO中，將3 mg EDC和2 mg NHS在室溫黑暗中攪拌4 h后與上述溶液進(jìn)行混合。將Au-BSA-DOX溶液(3 mL，20 g/L)加入該混合溶液，室溫黑暗中攪拌10 h，反應(yīng)完成之后，通過葡萄糖凝膠G-25分離去除多余的FA，即得到Au-BSA-DOX-FA。利用紫外可見分光光度計(jì)測量其吸收光譜，從而確定該復(fù)合物是否成功合成。

1.4 Au-BSA-DOX-FA在不同pH值條件下DOX的釋放

1.4.1繪制DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線 以2倍的濃度梯度配置不同濃度的DOX標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為1.875、3.75、7.5、15、30、60 mg/L。用紫外可見分光光度計(jì)在495 nm波長下測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度(A)值，計(jì)算回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2DOX的釋放 通過調(diào)節(jié)不同的pH值(pH分別為3.5、5.0、6.5、7.4、9.0)，繪制Au-BSA-DOX-FA中DOX在不同的pH值條件下的釋放曲線。將1 mL Au-BSA-DOX-FA置于透析管中，然后將透析管置于盛有10 mL氫氧化鈉和檸檬酸鈉緩沖溶液的塑料管中，塑料管中緩沖溶液的pH分別調(diào)至3.5、5.0、6.5、7.4、9.0。該測試在搖床中進(jìn)行，參數(shù)設(shè)置為37 ℃，50 r/min。每隔一定時(shí)間間隔(3、6、12、24、48 h)，更換新的緩沖溶液，并用紫外可見分光光度計(jì)測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算緩沖溶液中DOX的含量，繪制DOX釋放曲線。

1.5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

為了確定所合成的Au-BSA的細(xì)胞毒性，采用MTT法檢測經(jīng)Au-BSA培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞和HSF細(xì)胞的活力。取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞和HSF細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入100 μL，接種密度為1×104/孔。不同濃度的Au-BSA溶液(0、1.6、3.2、6.25、12.5、25、50、100 mg/L)分別加到不同組別的孔中。置二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用pH為7.0的PBS清洗3次，向各孔中加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去除上清液后加入DMSO溶液，震蕩10 min以后采用酶標(biāo)儀在570 nm波長下檢測吸光度(A)值。

1.6 對腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用比較

為了確定靶向殺傷作用，用MTT實(shí)驗(yàn)測定分別經(jīng)Au-BSA-DOX-FA以及DOX干預(yù)的HeLa細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞和HSF細(xì)胞活力。Au-BSA-DOX-FA干預(yù)組中，復(fù)合物中包含的DOX的濃度分別為0.045、0.09、0.185、0.375、0.75、1.5 mg/L。DOX干預(yù)組中，DOX的濃度與Au-BSA-DOX-FA干預(yù)組中包含的DOX的濃度一致。于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用pH為7.0的PBS清洗3次，向各孔中加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去除上清液然后加入DMSO溶液，震蕩10 min后用酶標(biāo)儀在570 nm波長下檢測吸光度(A)值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Au-BSA-DOX-FA與DOX對細(xì)胞殺傷效果比較用兩組獨(dú)立樣本比較的秩和檢驗(yàn)即曼-惠特尼秩和檢驗(yàn)(Mann-Whitney Test)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 Au-BSA-DOX-FA的合成與表征

透射電子顯微鏡(TEM)鏡下，所制備的Au-BSA呈單分散的花狀結(jié)構(gòu)，粒徑約50 nm(圖1)。紫外可見分光光度計(jì)測量所合成Au-BSA-DOX-FA的吸收光譜如圖2所示，F(xiàn)A以及DOX分別在360以及495 nm波長處有較強(qiáng)的吸收峰。Au-BSA在280 nm處有一個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，這是牛血清白蛋白的特征峰，說明納米材料中有牛血清白蛋白的存在，Au-BSA的特征吸收峰如小圖所示，在580 nm波長處。BSA、FA以及DOX的特征吸收峰(280、360、495 nm波長處)在Au-BSA-DOX-FA的吸收曲線中均可見，說明已經(jīng)成功地在Au-BSA上結(jié)合上了FA和DOX。

2.2 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

建立吸光度(A)值對DOX標(biāo)準(zhǔn)溶液(C)的一元線性回歸方程。495 nm波長時(shí)不同濃度DOX的吸光度(A)值隨著濃度的升高而增大，回歸方程為：A=0.044C+0.04，決定系數(shù)R2=0.999，說明在吸光度(A)值的總變異中，濃度C可以解釋吸光度(A)值變異的99.9%，即用濃度來預(yù)測吸光度的效果好，在0～60 mg/L范圍內(nèi)，DOX濃度與吸光度(A)值有良好的線性關(guān)系。見圖3。

圖1 Au-BSA的TEM照片

圖2 DOX、FA、Au-BSA及Au-BSA-DOX-FA的紫外吸收光譜

圖3 DOX的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 pH敏感的藥物釋放

為達(dá)到pH敏感可控的藥物釋放效果，本研究使用順烏頭酸酐作為連接DOX與Au-BSA的藥物。DOX從Au-BSA-FA-DOX復(fù)合物上釋放的效果通過測量其在不同pH值下在緩沖溶液中的含量來反應(yīng)。如圖4所示，當(dāng)pH為7.4和9.0時(shí)，DOX從Au-BSA-FA-DOX復(fù)合物釋放出來的數(shù)量大約為20%。相比之下，當(dāng)pH為6.5時(shí)，DOX的釋放量約為60%，釋放量是前者的3倍。當(dāng)pH為3.5以及5.0時(shí)，DOX的釋放量達(dá)到了約90%，釋放量提高到4.5倍。

圖4 不同pH值情況下DOX在Au-BSA-DOX-FA中的釋放情況

2.4 Au-BSA的細(xì)胞毒性

MTT實(shí)驗(yàn)測定顯示，隨著Au-BSA濃度的提高，HaLa細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞和HSF細(xì)胞的細(xì)胞活力未受到明顯抑制(圖5a～c)，說明Au-BSA具有良好的生物相容性。

2.5 Au-BSA-DOX-FA對Hela細(xì)胞靶向殺傷作用

隨著DOX濃度的升高，HeLa和MCF-7細(xì)胞活力呈下降趨勢。從細(xì)胞活力的變化曲線可以看出，在對HeLa細(xì)胞的干預(yù)中，用Au-BSA-DOX-FA干預(yù)的HeLa細(xì)胞的活力低于DOX(t=26.0，P<0.05)；而兩者對MCF-7細(xì)胞的殺傷作用差異無顯著性(P>0.05)；采用Au-BSA-DOX-FA干預(yù)的HSF細(xì)胞活力高于DOX(t=26.5，P<0.05)。見圖6a～c。

a、b、c分別為HaLa細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞、HSF細(xì)胞。

a、b、c分別為HaLa細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞、HSF細(xì)胞。

3 討 論

本研究所用Au-BSA是以BSA[11]為模板，用抗壞血酸還原氯金酸得到的[12]，合成過程簡潔快速，無有毒物質(zhì)產(chǎn)生，從而保證所合成的Au-BSA具有良好的生物相容性，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。有研究表明，粒徑在10～200 nm間的納米顆粒有利于在體內(nèi)的長期循環(huán)和腫瘤靶向治療[13]。本研究所制備粒徑為50 nm的花狀A(yù)u-BSA，與其研究結(jié)果相符合。

人體正常組織和血液的pH值為7.4，而腫瘤組織部位的pH值比正常組織低[14]，這就為利用pH控制藥物釋放提供了條件[15]。順烏頭酸酐是一種酸性敏感鍵，在中性和堿性環(huán)境下穩(wěn)定，在酸性環(huán)境下易斷裂[16-17]。有研究將DOX利用順烏頭酸酐連接到一種樹枝狀大分子上形成聚合物，這種聚合物可以在酸性條件下緩慢釋放DOX，而在中性條件下則能穩(wěn)定存在[18]。緩釋藥物則能保證藥物濃度穩(wěn)定在較高濃度，從而提高藥物的生物利用率。本研究中，DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線說明，在0～60 mg/L范圍內(nèi)，DOX的濃度與吸光度(A)值有良好的線性關(guān)系[19]，因此通過測定吸光度(A)來計(jì)算溶液中DOX的濃度。Au-BSA-DOX-FA在pH為3.5以及5.0時(shí)可以釋放出90%的DOX，且釋放過程在12 h內(nèi)持續(xù)完成，在pH為6.5時(shí)約釋放出60%的DOX，而在中性(pH 7.4)以及堿性(pH 9.0)環(huán)境中很少釋放出DOX，總釋放量僅為DOX總量的20%左右。DOX從復(fù)合物中的快速釋放是由于順烏頭酸酐的作用，順烏頭酸酐作為DOX與Au-BSA的連接物，在pH小于6.0時(shí)極易斷裂，從而使DOX從復(fù)合物中釋放出來。有研究表明，pH敏感的DOX釋放與酸性條件下的游離羧基有關(guān)[20]。所以，pH敏感的DOX釋放效果表明，Au-BSA-FA-DOX復(fù)合物在循環(huán)系統(tǒng)中會(huì)穩(wěn)定存在而在腫瘤部位的酸性環(huán)境中就會(huì)釋放DOX[21]。

HeLa細(xì)胞表面FR過量表達(dá)，極易與FA靶向抗腫瘤藥物結(jié)合，從而有利于藥物發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[22]。Au-BSA-DOX-FA與DOX對癌細(xì)胞的殺傷效果比較顯示，由于HeLa細(xì)胞表面大量FR的存在，Au-BSA-DOX-FA能夠靶向地與HeLa細(xì)胞結(jié)合并在周圍釋放結(jié)合在復(fù)合物中的DOX，而單純使用DOX干預(yù)則沒有靶向聚集功能，所以Au-BSA-DOX-FA對HeLa細(xì)胞的殺傷效果優(yōu)于單純使用DOX的殺傷效果。MCF-7細(xì)胞表面FR低表達(dá)，Au-BSA-DOX-FA對其無靶向功能[23]，所以其與DOX的殺傷效果無明顯的差異。在Au-BSA-DOX-FA對MCF-7的殺傷效果中，Au-BSA-DOX-FA的效果略低于單純使用DOX的殺傷效果，可能是因?yàn)閺?fù)合物中釋放的DOX的量低于直接加入DOX的量，在無靶向聚集的條件下，治療效果與DOX濃度相對應(yīng)。在Au-BSA-DOX-FA對HSF的殺傷效果中，HSF細(xì)胞為正常組織細(xì)胞，表面FR低表達(dá)且周圍環(huán)境為弱堿性，Au-BSA-DOX-FA對其無靶向功能[24]，且不會(huì)因?yàn)轫槥躅^酸酐鍵斷裂而釋放出DOX，因此Au-BSA-DOX-FA對HSF細(xì)胞殺傷作用顯著弱于單純使用DOX的殺傷作用。

綜上所述，本研究以牛血清白蛋白為模板合成了一種生物相容性良好的Au-BSA，并將其作為FA靶向的藥物載體負(fù)載DOX組成了Au-BSA-DOX-FA，用于對FR高表達(dá)的HeLa細(xì)胞的殺傷作用研究。該復(fù)合物對表面FR過量表達(dá)的HeLa細(xì)胞有較好的殺傷作用。本研究只是進(jìn)行了細(xì)胞水平的研究，該復(fù)合物在個(gè)體水平對腫瘤的治療效果如何，還需要進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

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