(青島大學附屬醫(yī)院，山東 青島 266003 1 肝膽外科; 2 嶗山院區(qū)業(yè)務部)

膽管癌是一種惡性程度極高，具有高度侵襲性的腫瘤，起病隱匿，早期即可發(fā)生周圍浸潤及遠處轉(zhuǎn)移，具有診斷率低，病死率高的特點[1]。手術切除是唯一有效的治療方法，但是手術切除率低，術后復發(fā)率高，對放、化療不敏感，導致其預后較差[2]。近年來研究顯示，膽管癌術后易復發(fā)及預后差與其具有的一種生物學特性—神經(jīng)浸潤密切相關。研究表明膽管系統(tǒng)具有十分豐富的自主神經(jīng)，膽管惡性腫瘤距腹腔神經(jīng)叢的距離較近，腫瘤易侵犯周圍的神經(jīng)叢，發(fā)生神經(jīng)浸潤[3]。許多學者認為，膽管癌周圍神經(jīng)遞質(zhì)的分泌對膽管癌的神經(jīng)浸潤具有積極影響。我們推測周圍神經(jīng)遞質(zhì)可能是通過激活毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3(ChRM3)來發(fā)揮作用，ChRM3在膽管癌神經(jīng)浸潤過程中起到重要作用，本實驗目的是通過建立體外神經(jīng)浸潤模型，觀察ChRM3在激動劑匹羅卡品及其拮抗劑阿托品作用下對膽管癌神經(jīng)浸潤能力的影響。

1 材料與方法

1.1 標本來源

2010年1月—2013年12月，我院肝膽外科手術切除后經(jīng)石蠟包埋的膽管病理組織標本90例，其中60例為腺癌組織標本，30例為正常膽管組織標本。

1.2 細胞系和主要試劑

膽管癌RBE細胞系購自中國科學院上海細胞庫，RPIM1640培養(yǎng)基以及胎牛血清(FBS)由美國Hyclone公司提供，匹羅卡品購自美國Sigma公司，硫酸阿托品由武漢昌恒生物醫(yī)藥制品研究所提供，昆明種純系胚胎小鼠由青島市藥檢所動物實驗中心提供。

1.3 細胞培養(yǎng)

RBE膽管癌細胞系，用含體積分數(shù)0.10胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37 ℃、含體積分數(shù)0.05的CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，定期換液，待細胞80%～90%融合后用含有2.5 g/L EDTA的胰酶消化，配成細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶，取對數(shù)生長期的細胞用含2.5 g/L EDTA的胰酶消化備用，每天用倒置顯微觀察細胞生長情況，定期拍照記錄。

1.4 免疫組化法檢測ChRM3的表達情況

標本均采用40 g/L中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，采用免疫組化PV-6000二步法對切片進行免疫組化染色。每批實驗均設陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。免疫組化陽性判斷標準為細胞膜及細胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色顆粒，分級如下：隨機選擇8～10個視野(100倍)的陽性細胞核的數(shù)目來進行半定量評估，分為4級：陰性(-)，陽性細胞數(shù)<5%；弱陽性(+)，陽性細胞數(shù)占5%～25%；陽性()，陽性細胞數(shù)占26%～50%；強陽性()，陽性細胞數(shù)>50%；所有標本均經(jīng)2名病理科高年資主治醫(yī)師審核證實。

1.5 體外膽管癌神經(jīng)浸潤模型的建立

本實驗小鼠DRG-RBE細胞共培養(yǎng)模型培養(yǎng)液分共為4組，分別為mock組(單獨加含血清RPMI 1640培養(yǎng)基)、PILO組(含有血清RPMI 1640培養(yǎng)基+匹羅卡品1 mmol/L)、PILO+ATR組(含血清RPMI 1640培養(yǎng)基+匹羅卡品1 mmol/L+阿托品0.1 mmol/L)、ART組(含有血清RPMI 1640培養(yǎng)基+阿托品0.1 mmol/L)。取對數(shù)期生長的RBE膽管癌細胞用2.5 g/L胰酶消化，離心并重懸于含胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液中，細胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細胞密度至1.0×108個/L備用。整個操作在超凈工作臺上進行，將小鼠脫頸處死，在顯微鏡下切取并修剪背根神經(jīng)節(jié)(DRG)后置于生理鹽水中清洗備用。6孔板各孔均放入0 ℃預冷的1 cm×1 cm大小的消毒蓋玻片，將備用的DRG置于蓋玻片中央，從冰浴中取50 μL Matrigel覆于DRG上，然后將6孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中，固化30 min后分別加入預先制備好的細胞懸液2 mL，將Matrigel和DRG完全覆蓋，操作完后將6孔板置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔4 h倒置顯微鏡下觀察RBE細胞與神經(jīng)纖維的黏附狀況，并照相記錄。36 h后經(jīng)40 g/L中性甲醛溶液固定，通過Nissl染色、Gomori染色和神經(jīng)絲蛋白免疫組化染色(NF IHC)后，置于倒置顯微鏡下觀察，在高倍鏡下計數(shù)，分別取5個高倍鏡視野下細胞計數(shù)，并取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 ChRM3在兩種組織中的表達

ChRM3在膽管癌組織和正常膽管組織中的陽性表達率分別為90.00%(54/60)、3.33%(1/30)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1a、b。并且神經(jīng)浸潤在膽管癌組織中發(fā)生率為91.7%(55/60)。見圖1c、d。

2.2 各組RBE細胞浸潤DRG及其周圍神經(jīng)纖維的比較

通過Nissl染色發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的DRG存活良好，其尼氏體呈顆粒狀，核周尼氏體顆粒明顯，核邊緣處較小，而且活力旺盛(圖2a)。Gomori染色以及NF IHC染色見有神經(jīng)突起自DRG周緣長出，多數(shù)突起結(jié)構有分支，大體呈放射狀排列(圖2b、c、d)。在DRG-RBE細胞共培養(yǎng)模型培養(yǎng)36 h后，可見RBE細胞浸潤DRG及其周圍神經(jīng)纖維(圖3a)，浸潤細胞數(shù)目為18.00±0.71，在DRG-RBE細胞共培養(yǎng)模型中加入匹羅卡品后，RBE細胞浸潤DRG及其周圍神經(jīng)纖維的數(shù)量明顯增加(圖3b)，浸潤細胞數(shù)目為31.60±0.93，差異具有統(tǒng)計學意義(t=11.66,P<0.05)。在加入匹羅卡品拮抗劑阿托品后明顯減弱，表現(xiàn)為浸潤DRG的RBE 細胞的數(shù)量減少(圖3c)，浸潤細胞數(shù)目為20.00±0.71，差異具有統(tǒng)計學意義(t=9.95,P<0.05)。而在DRG-RBE細胞共培養(yǎng)模型中單獨加入阿托品以后，RBE細胞浸潤DRG及其周圍神經(jīng)纖維的數(shù)量無明顯的變化(圖3d)，浸潤細胞數(shù)目為20.20±0.86，與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討 論

肝膽系惡性腫瘤中，膽管癌是除肝癌之外發(fā)病率最高的惡性腫瘤，約占10%～15%。手術根治性切除是膽管癌唯一有效的治療方法，但由于膽管癌早期不易被發(fā)現(xiàn)，且易發(fā)生周圍浸潤，導致大部分病人診斷時已處于中晚期，R0切除率降低且術后復發(fā)率升高。

a：ChRM3在正常膽管組織中的表達，200倍；b：ChRM3在膽管癌組織中的表達，200倍；c、d：膽管癌浸潤神經(jīng)纖維(箭頭所指)，PV-6000染色，分別為200、400倍。

圖1ChRM3在兩種組織中的表達情況

a:Nissl著色后的DRG(箭頭所指),400倍；b、c:Gomori著色后的DRG(箭頭所指)，分別為200、400倍；d:NF IHC著色后的DRG(箭頭所指)，400倍。

圖2DRG體外培養(yǎng)36h后的生長狀態(tài)、胞體大小及軸突生長狀況

a：RBE細胞浸潤DRG及其周圍神經(jīng)纖維情況；b：加入匹羅卡品后RBE細胞浸潤DRG及其周圍神經(jīng)纖維情況；c：同時加入匹羅卡品和阿托品后RBE細胞浸潤DRG及其周圍神經(jīng)纖維情況；d：單獨加入阿托品后RBE細胞浸潤DRG及其周圍神經(jīng)纖維情況。

圖3不同因素影響下RBE細胞對DRG的浸潤情況

神經(jīng)浸潤是膽管癌一種獨立的轉(zhuǎn)移方式，與淋巴轉(zhuǎn)移無關[4]。BHUIYA等[5]的研究顯示， 70例膽管癌標本中81.4%出現(xiàn)了神經(jīng)浸潤，且R0術后5年存活率僅為32%，而無神經(jīng)浸潤病人為67%。以上研究顯示，神經(jīng)浸潤在膽管癌中普遍發(fā)生且與術后復發(fā)相關。膽管系統(tǒng)是一個由多種神經(jīng)支配的自主神經(jīng)器官。許多學者認為腫瘤的神經(jīng)浸潤可能與神經(jīng)遞質(zhì)有關，尤其是膽管癌這種具有嗜神經(jīng)浸潤性的腫瘤[6]。研究顯示膽管癌周圍的交感神經(jīng)遞質(zhì)及其受體在調(diào)節(jié)膽管癌的生長及轉(zhuǎn)移中的重要作用已經(jīng)被證實[7-8]，但是副交感神經(jīng)在膽管癌中作用的研究尚少。SHAH等[9]以及SAID等[10]研究表明，副交感神經(jīng)也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切。mAChRs是副交感神經(jīng)分泌的主要遞質(zhì)乙酰膽堿(ACh)受體的一種，包括M1～M5 5種受體，其中，ChRM3分布于消化道腺體和血管平滑肌，控制腺體分泌和平滑肌松弛。實驗證明，ACh在多種腫瘤中高表達，包括常見的肺癌及其他惡性腫瘤[11-12]。研究顯示ChRM3在消化道腫瘤中廣泛表達，在腫瘤的增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用[13-14]。張亮等[15]研究顯示，ChRM3活化能夠通過PI3K/Akt信號通路促進肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。據(jù)報道，膽管癌細胞系MZ-Cha-1有ChRM3的表達，而在mAChRs激動劑作用下，IP3信號被激活，細胞內(nèi)Ca2+水平升高，膽管癌細胞的數(shù)量增加[16]。FENG等[17]研究顯示，ChRM3的表達在膽管癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移中起關鍵作用，并受腫瘤分化程度、遠處轉(zhuǎn)移的影響。以上研究證明，ChRM3廣泛參與了腫瘤細胞，包括膽管癌細胞的增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移，但是與神經(jīng)浸潤有關的報道很少。本課題組之前的研究已經(jīng)證實了膽管癌細胞可能存在ChRM3，并受副交感神經(jīng)分泌的神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)，在膽管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮積極作用[18]。對本院90例標本進行免疫組織化學染色顯示，ChRM3主要在膽管癌細胞膜和細胞質(zhì)中表達，膽管癌組織中神經(jīng)浸潤的發(fā)生率約為91.7%，并且在膽管癌組織中ChRM3的陽性表達率明顯高于正常膽管組織。據(jù)此推測，ChRM3可能與膽管癌神經(jīng)浸潤具有相關性。研究顯示，腫瘤組織中存在多種神經(jīng)遞質(zhì)的異常表達，神經(jīng)遞質(zhì)和受體激動劑可影響腫瘤的增殖、分化和轉(zhuǎn)移，受體拮抗劑可阻斷這些作用[19]。而本研究結(jié)果顯示，加入匹羅卡品或阿托品后，ChRM3激動劑匹羅卡品可明顯增強RBE細胞對DRG及周圍神經(jīng)纖維的浸潤能力；而阿托品可明顯抵消匹羅卡品所產(chǎn)生的促浸潤作用；阿托品能夠與匹羅卡品競爭與ChRM3結(jié)合，對匹羅卡品的作用產(chǎn)生競爭性抑制，而阿托品本身與ChRM3結(jié)合不發(fā)揮作用，所以單獨應用阿托品對RBE細胞的神經(jīng)浸潤無影響。

綜上所述，匹羅卡品可明顯增強膽管癌細胞的神經(jīng)浸潤能力，阿托品可明顯抵消匹羅卡品所產(chǎn)生的促浸潤能力，其機制可能通過改變ChRM3的活性而發(fā)揮作用。這可能為抑制膽管癌的神經(jīng)浸潤提供新的治療靶點。

[參考文獻]

[1] RAZUMILAVA N, GORES G J. Cholangiocarcinoma[J]. Lancet, 2014, 383(9935):2168-2179.

[2] FRIMAN S. Cholangiocarcinoma-current treatment options[J]. Scand J Surg, 2011, 100(1):30-34.

[3] 馮玉杰,張炳遠,盧云. 膽管癌周圍神經(jīng)浸潤的研究進展[J]. 國際外科學雜志, 2010,37(7):489-483.

[4] HASSAN M O, MAKSEM J. The prostatic perineural space and its relation to tumor spread: an ultrastructural study[J]. Am J Surg Pathol, 1980,4(2):143-148.

[5] BHUIYA M R, NIMURA Y, KAMIYA J, et al. Clinicopa-thologic studies on perineural invasion of bile duct carcinoma[J]. Ann Surg, 1992,215(4):344-349.

[6] 劉磊,黃強,劉臣海,等. 肝外膽管癌神經(jīng)及脈管浸潤轉(zhuǎn)移的危險因素[J]. 腫瘤, 2012,32(5):376-379.

[7] KANNO N, LESAGE G, PHINIZY J L, et al. Stimulation of α 2-adrenergic receptor inhibits cholangiocarcinoma growth through modulation of Raf-1 and B-Raf activities[J]. Hepato-logy, 2002,35(6):1329-1340.

[8] 黃竹,劉子沛,夏鋒,等. α1-腎上腺素受體對膽管癌細胞增殖的影響[J]. 中華消化外科雜志, 2009,8(3):193-196.

[9] SHAH N, KHURANA S, CHENG K, et al. Muscarinic receptors and ligands in cancer[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2009,296(2):C221-232.

[10] SAID A H, HU S, ABUTALEB A, et al. Interacting post-muscarinic receptor signaling pathways potentiate matrix me-talloproteinase-1 expression and invasion of human colon cancer cells[J]. Biochemical Journal, 2017,474(5):647-665.

[11] TROMBINO S, CESARIO A, MARGARITORA S, et al. α7-Nicotinic acetylcholine receptors affect growth regulation of human mesothelioma cells role of mitogen-activated protein kinase pathway[J]. Cancer Res, 2004,64(1):135-139.

[12] SONG P, SEKHON H S, PROSKOCIL B, et al. Synthesis of acetylcholine by lung cancer[J]. Life Sci, 2003,72(18):2159-2168.

[13] FRUCHT H, JENSEN R T, DEXTER D, et al. Human colon cancer cell proliferation mediated by the M3 muscarinic cholinergic receptor[J]. Clin Cancer Res, 1999,5(9):2532-2539.

[14] WEGENER C, HAMASAKA Y, NASSEL D R. Acetylcholine increases intracellular Ca2+ via nicotinic receptors in cultured PDF-containing clock neurons of Drosophila[J]. J Neurophysiol, 2004,91(2):912-922.

[15] 張亮,宦宏波,溫旭東,等. 毒蕈堿型膽堿能受體M3調(diào)控肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的研究[J]. 第三軍醫(yī)大學學報, 2017,39(6):509-514.

[16] ELSING C, HUBNER C, FITSCHER B A, et al. Muscarinic acetylcholine receptor stimulation of biliary epithelial cells and its effect on bile secretion in the isolated perfused liver[J]. Hepatology, 1997,25(4):804-814.

[17] FENG Y J, ZHANG B Y, YAO R Y, et al. Muscarinic acetylcholine receptor M3 in proliferation and perineural invasion of cholangiocarcinoma cells[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2012,11(4):418-423.

[18] 劉昆鵬,張炳遠,盧云,等. Transwell侵襲實驗測定M受體對膽管癌細胞侵襲的影響[J]. 國際外科學雜志, 2011,38(5):298-301.

[19] RADU A, PICHON C, CAMPARO P, et al. Expression of follicle-stimulating hormone receptor in tumor blood vessels[J]. N Engl J Med, 2010,186(2):1621-1630.