(青島大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 青島 266003)

卵巢癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率居第三位，但死亡率位居第一。卵巢癌發(fā)病隱匿，早期不易發(fā)現(xiàn)，就診時(shí)卵巢癌患者中大多數(shù)都處于病變晚期，即使積極治療預(yù)后仍然不良。因此，深入探索卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)于卵巢癌的診斷和治療有著重要的意義。S100家族是EF-手型鈣結(jié)合蛋白家族中最大的亞家族，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。S100A1作為其中一員，在多種腫瘤中異常表達(dá)，但是在卵巢癌中的作用機(jī)制仍然不清。因此，本課題以卵巢癌細(xì)胞A2780作為研究對(duì)象，探討S100A1對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖及遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑

293T細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞A2780獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，由婦產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室惠存；針對(duì)S100A1的shRNA為課題組前期構(gòu)建；質(zhì)粒PLP1、PLP2和VSVG由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院劉芝華教授惠贈(zèng)；RPMI 1640培養(yǎng)基以及嘌呤霉素(美國(guó)GIBCO公司)；胎牛血清以及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)ABI公司)；實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(日本Takara公司)；Western blot試劑(美國(guó)Pierce公司)；β-Actin抗體和二抗IgG(美國(guó)Sigma公司)；CCK-8試劑盒(日本Dojindo公司)；Transwell小室購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Costar Cambridge公司；單克隆鼠抗S100A1抗體購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將293T細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞A2780置于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中，每1～2天換液一次，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)周期傳代，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，待細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)基底壁85%的表面時(shí)收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

本研究將空質(zhì)粒pLVX-IRES-Neo以及帶有S100A1反向序列目的基因的質(zhì)粒pLVX-IRES-Neo-shS100A1分別與質(zhì)粒PLP1、PLP2以及VSVG共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染過(guò)程嚴(yán)格地按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。收集病毒上清液，將重組慢病毒感染卵巢癌細(xì)胞A2780用嘌呤霉素篩選細(xì)胞2周以獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，分別獲得對(duì)照組細(xì)胞株(對(duì)照組)和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞株(實(shí)驗(yàn)組)。靶向S100A1的shRNA的序列為:5′-GATCCGTGGACTTCCAGGAGTATGTGCTTCCTGTC-AGACACATACTCCTGGAAGTCCACTTTTTG-3′。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)S100A1 mRNA水平

提取實(shí)驗(yàn)組以及對(duì)照組的A2780細(xì)胞的總RNA，后采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。將SYBR Green染料10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、dNTP 1 μL、Taq聚合酶2 μL、待測(cè)cDNA 5 μL、ddH2O 30 μL配置成總體積50 μL的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系。PCR的反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；然后93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后以72 ℃延伸7 min。引物序列如下：S100A1-F：5′-CCGCTCGAGAGCAGCCACATTTGCAACCT-3′；S100A1-R:5′-CGCGGAT-CCGCTGGTGAGAGA-3′；β-action-F:5′-GGCGG-CACCACCATGTACCCT-3′；β-action-R:5′-AGG-GGCCGGACTCGTCATACT-3′。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)S100A1蛋白質(zhì)表達(dá)水平

將實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的A2780細(xì)胞裂解后提取總蛋白，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10的SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，用含體積分?jǐn)?shù)0.05的胎牛血清封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的一抗，在4 ℃下孵育過(guò)夜，洗膜，加入1∶5 000稀釋的二抗，在室溫下反應(yīng)1 h，洗膜。β-action以相同方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并作為內(nèi)參照。采用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)S100A1蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

1.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

將實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組A2780細(xì)胞以3×107個(gè)/L接種于96孔板中，每組設(shè)5孔平行對(duì)照。分別培養(yǎng)24、48、72 h后向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，室溫下繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞1 h，用分光光度法測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處各孔的吸光度(A)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.7 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

將實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的A2780細(xì)胞用0.25 g/L的胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，將1.5×104個(gè)細(xì)胞接種于含無(wú)血培養(yǎng)基200 mL的Transwell小室中，此為上室，下室加入含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的培養(yǎng)基500 mL，培養(yǎng)24 h后用濕棉簽擦去微孔膜上層未穿透小室的細(xì)胞，風(fēng)干后用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.20的甲醇固定，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.03的結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)隨機(jī)選取的5個(gè)視野中的穿膜細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.8 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

將實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的A2780細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)過(guò)夜，至細(xì)胞融合至單層狀態(tài)時(shí)，用相同寬度的無(wú)菌吸頭做“+”字劃痕，用PBS反復(fù)沖洗孔板去除細(xì)胞碎片，更換含體積分?jǐn)?shù)0.10的胎牛血清培養(yǎng)基，立即記錄劃痕寬度并拍照，室溫下繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，48 h后在相同的位置記錄劃痕寬度并拍照對(duì)比劃痕愈合情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定表達(dá)敲降S100A1的A2780細(xì)胞株的構(gòu)建與鑒定

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的S100A1 mRNA表達(dá)水平分別為1.000±0.001、0.654±0.007，與對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組A2780細(xì)胞中S100A1 mRNA的水平顯著下降(t=83.898，P<0.05)。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組A2780細(xì)胞中S100A1蛋白質(zhì)表達(dá)水平較對(duì)照組下降。見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，成功建立了敲降S100A1的A2780細(xì)胞株，可用于后續(xù)研究。

圖1 兩組A2780細(xì)胞中S100A1 mRNA蛋白表達(dá)水平比較

2.2 敲降S100A1對(duì)A2780細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組A2780細(xì)胞在第48、72小時(shí)的細(xì)胞增殖能力明顯下降,差異具有顯著意義(t=4.975、7.393，P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 敲降S100A1對(duì)A2780細(xì)胞遷移能力的影響

Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組以及實(shí)驗(yàn)組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為274.750±21.093、185.750±39.373，實(shí)驗(yàn)組A2780細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)顯著小于對(duì)照組(t=3.985，P<0.05)。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果提示，敲降S100A1的A2780細(xì)胞在48 h后的劃痕愈合能力較對(duì)照組減弱。見(jiàn)圖2。

表1 各組細(xì)胞增殖能力的變化

①、③為對(duì)照組，②、④為實(shí)驗(yàn)組，HE染色，100倍。

3 討 論

卵巢癌是全球女性癌癥的相關(guān)死亡的第5大原因[1]，每年預(yù)計(jì)有22 000多新發(fā)病例，5年生存率低于30%[2]。缺乏早期診斷是卵巢癌病人預(yù)后不良的主要原因。關(guān)于卵巢癌的發(fā)病原理及分子機(jī)制目前仍不明確。

S100A1是S100蛋白家族中的一員，定位于人染色體1q21，作為多功能信號(hào)因子參與不同細(xì)胞生物過(guò)程的調(diào)控[3]。與大多數(shù)的S100家族成員一樣，S100A1通過(guò)與鈣離子結(jié)合而發(fā)生自身構(gòu)象改變，從而結(jié)合相應(yīng)靶蛋白發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)[4]。目前已知S100A1的靶蛋白有：Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，細(xì)胞骨架和絲連蛋白(如微管蛋白、F-肌動(dòng)蛋白、中間絲)，神經(jīng)遞質(zhì)釋放相關(guān)蛋白(如突觸蛋白Ⅰ、Ⅱ)，轉(zhuǎn)錄因子(如p53)，酶以及其他的Ca2+激活蛋白(如S100B、S100A4、S1001P)等[5-7]。S100A1與不同靶蛋白結(jié)合后可參與肌肉收縮、細(xì)胞代謝以及腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲以及遷移等多種生物過(guò)程[8-9]。S100A1與人體多種疾病有關(guān)，如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝綜合征、心力衰竭衰等[10-12]。WRIGHT等[13]研究顯示，S100A1過(guò)表達(dá)可促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿茲海默癥的病理進(jìn)展；EBRAHIMI等[14]研究顯示，S100A1與脂肪的生成以及肥胖的發(fā)展等有關(guān)；DU等[15]的研究顯示，S100A1可調(diào)控心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)，心力衰竭時(shí)S100A1表達(dá)減少，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明敲降S100A1的心肌細(xì)胞凋亡增加、心力衰竭進(jìn)程加快、心肌梗死后心力衰竭的發(fā)生率升高。ERYILMAZ等[16]研究顯示，S100A1可作為評(píng)估某些癌癥化療心臟毒性的潛在標(biāo)志物。

S100A1與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[17]。據(jù)報(bào)道，S100A1在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，如腎癌、乳腺癌、黑色素瘤等[3]。但也有研究顯示，S100A1在某些腫瘤如口腔癌、膀胱癌中表達(dá)下降[18-20]。研究顯示，S100A1在不同亞型的腎臟腫瘤中表達(dá)不一，可用于鑒別腎嫌色細(xì)胞癌、腎嗜酸細(xì)胞乳頭狀癌與腎嗜酸細(xì)胞腺瘤[21-22]。目前關(guān)于S100A1與卵巢癌的研究較少。DERYCKE等[23]研究結(jié)果顯示，在卵巢漿液性囊腺癌中S100A1的陽(yáng)性率及表達(dá)程度高于其他病理類(lèi)型，且S100A1的表達(dá)程度隨著卵巢癌Silverberg分級(jí)的增加而增加，該研究還發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜癌及宮內(nèi)膜樣卵巢癌中S100A1陽(yáng)性病人的無(wú)復(fù)發(fā)生存率下降，說(shuō)明S100A1可能與卵巢癌的病理類(lèi)型、腫瘤分級(jí)及預(yù)后有關(guān)。此外，雖然S100A1在不同卵巢癌亞型中表達(dá)不一，但目前在臨床實(shí)踐中仍難以通過(guò)S100A1免疫組化標(biāo)記來(lái)區(qū)分卵巢癌的不同亞型[24-25]。本課題組在前期研究中證實(shí)，與正常卵巢組織相比，S100A1在卵巢癌組織中的表達(dá)明顯上調(diào)，可能在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。因此，本研究通過(guò)分子功能學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)S100A1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的功能角色進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)本研究成功建立了敲降S100A1的卵巢癌A2780細(xì)胞株，通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)了敲降S100A1后的卵巢癌A2780細(xì)胞增殖及遷移能力明顯減弱，證明了S100A1在調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移中起重要作用，與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。S100A1在卵巢癌中的作用機(jī)制仍不清楚，S100A1過(guò)表達(dá)促進(jìn)卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移可能與NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活有關(guān)[20]，但具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，鈣結(jié)合蛋白S100A1可能通過(guò)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖能力及遷移運(yùn)動(dòng)能力，進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌的發(fā)展與轉(zhuǎn)移。S100A1有望成為監(jiān)測(cè)卵巢癌的有力標(biāo)志物以及可能的治療靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] SIEGEL R L, MILLER K D, JEMAL A, et al. Cancer statistics, 2017[J]. CA Cancer J Clin, 2017,67(1):7-30.

[2] MILLER K D, SIEGEL R L, LIN C C, et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016[J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(4):271-289.

[3] BRESNICK A R, WEBER D J, ZIMMER D B, et al. S100 proteins in cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2015,15(2):96-109.

[4] GRYCOVA L, HOLENDOVA B, LANSKY Z, et al. Ca2+binding protein S100A1 competes with calmodulin and PIP2 for binding site on the C-terminus of the TPRV1 receptor[J]. ACS Chem Neurosci, 2015,6(3):386-392.

[5] WRIGHT N T, CANNON B R, ZIMMER D B. S100A1: structure, function, and therapeutic potential[J]. Curr Opin Chem Biol, 2009,3(2):138-145.

[6] BENNETT M K, SWEET W E, BAICKER-MCKEE S, et al. S100A1 in human heart failure: lack of recovery following left ventricular assist device support[J]. Circ Heart Fail, 2014,7(4):612-618.

[7] MELVILLE Z, ALIGHOLIZADEH E, MCKNIGHT L E, et al. X-ray crystal structure of human calcium-bound S100A1[J]. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun, 2017,73(Pt 4):215-221.

[8] MELVILLE Z, HERNANDEZ-OCHOA E O, PRATT S J P, et al. The activation of protein kinase a by the calcium-binding protein S100A1 is independent of cyclic AMP[J]. Biochemistry, 2017,56(17):2328-2337.

[9] MACIEJEWSKI A, PRADO V F, PRADO M A M. Molecular basis for the interaction between stress-inducible phosphoprotein 1 (STIP1) and S100A1[J]. Biochem J, 2017,474(11):1853-1866.

[10] AFANADOR L, ROLTSCH E A, HOLCOMB L, et al. The Ca2+sensor S100A1 modulates neuroinflammation, histopathology and Akt activity in the PSAPP Alzheimer's disease mouse model[J]. Cell Calcium, 2014,56(2):68-80.

[11] DUARTE-COSTA S, CASTRO-FERREIRA R, NEVES J S. S100A1: a major player in cardiovascular performance[J]. Physiol Res, 2014,63(6):669-681.

[12] DIAZ-ROMERO J, NESIC D. S100A1 and S100B: Calcium sensors at the cross-roads of multiple chondrogenic pathways[J]. J Cell Physiol, 2017,232(8):1979-1987.

[13] WRIGHT N T, CANNON B R, ZIMMER D B. S100A1: structure, function, and therapeutic potential[J]. Curr Chem Biol, 2009,3(2):138-145.

[14] EBRAHIMI E, KHEIROURI S, ALIZADEH M. Down-regulation of S100A1 protein in patients with metabolic syndrome and its association with zinc-α2-glycoprotein [J]. Scott Med J, 2017,62(3):88-95.

[15] DU X J, COLE T J, TENIS N, et al. Impaired cardiac contractility response to hemodynamic stress in S100A1-deficient mice[J]. Mol Cell Biol, 2002,22(8):2821-2829.

[16] ERYILMAZ U, DEMIRCI B, AKSUN S, et al. S100A1 as a potential diagnostic biomarker for assessing cardiotoxicity and implications for the chemotherapy of certain cancers[J]. PLoS One, 2015,10(12):e0145418.

[17] SALAMA I, MALONE P S, MIHAIMEED F. A review of the S100 proteins in cancer[J]. Eur J Surg Oncol, 2008, 34(4):357-364.

[18] TYSZKIEWICZ T, JARZAB M, SZYMCZYK C, et al. Epidermal differentiation complex (locus 1q21) gene expression in head and neck cancer and normal mucosa[J]. Folia Histochem Cytobiol, 2014,52(2):79-89.

[19] YAO R, LOPEZ-BELTRAN A, MACLENNAN G T, et al. Expression of S100 protein family members in the pathogenesis of bladder tumors[J]. Anticancer Res, 2007,27(5A):3051-3058.

[20] RAFFAT M A, HADI N I, HOSEIN M, et al. S100 proteins in oral squamous cell carcinoma[J]. Clin Chim Acta, 2018,480:143-149.

[21] CONNER J R, HIRSCH M S, JO V Y. HNF1β and S100A1 are useful biomarkers for distinguishing renal oncocytoma and chromophobe renal cell carcinoma in FNA and core needle biopsies[J]. Cancer Cytopathol, 2015,123(5):298-305.

[22] NG K L, MORAIS C, BERNARD A, et al. A systematic review and meta-analysis of immunohistochemical biomarkers that differentiate chromophobe renal cell carcinoma from renal oncocytoma[J]. J Clin Pathol, 2016,69(8):661-671.

[23] DERYCKE M S, ANDERSEN J D, HARRINGTON K M, et al. S100A1 expression in ovarian and endometrial endometrioid carcinomas is a prognostic indicator of relapse-free survival[J]. Am J Clin Pathol, 2009,132(6):846-856.

[24] YORDANOV A, IVANOV I, POPOVSKA S, et al. Evaluation of the expression of S100A1 protein in serous, mucinous and endometroid ovarian carcinoma[J]. Akush Ginekol (So-fiia), 2013,52(5):22-26.

[25] HIBBS K, SKUBITZ K M, PAMBUCCIAN S E, et al. Diffe-rential gene expression in ovarian carcinoma: identification of potential biomarkers[J]. Am J Pathol, 2004:165(2):397-414.