(青島大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，山東 青島 266021)

近年來，關(guān)于缺血再灌注損傷的研究越來越多，其中腦缺血再灌注損傷(CIRI)已逐漸成為研究熱點(diǎn)，CIRI指各種原因致腦組織缺血后恢復(fù)血供，其缺血損傷未減輕反而加重的現(xiàn)象[1]。線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑在此過程中發(fā)揮重要作用，本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體分裂可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而抑制線粒體分裂可以減輕缺血再灌注引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷[2-5]。Tp53誘導(dǎo)的糖酵解和凋亡調(diào)節(jié)因子(TIGAR)是p53下游基因，其過表達(dá)可以抑制體內(nèi)低氧狀態(tài)下的糖酵解過程并活化磷酸戊糖途徑，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，從而減輕氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷[6]。研究顯示，在小鼠體內(nèi)外CIRI模型中，過表達(dá)TIGAR可以升高神經(jīng)細(xì)胞中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)水平，降低神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ROS水平，從而減少腦梗死面積和神經(jīng)元凋亡情況[7-8]。目前關(guān)于TIGAR過表達(dá)是否是通過調(diào)控線粒體分裂來發(fā)揮缺血再灌注過程中的腦保護(hù)作用的研究較少。本實(shí)驗(yàn)擬探討TIGAR基因表達(dá)在大鼠神經(jīng)元低氧復(fù)氧損傷中對(duì)線粒體分裂的影響，為CIRI的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來源

出生24 h內(nèi)SPF級(jí)Wistar大鼠300只，皮膚黏膜紅潤，運(yùn)動(dòng)活躍，體質(zhì)量(8±3) g，無性別要求(購自青島市藥檢所動(dòng)物中心)。

1.2 儀器與試劑

流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter公司，酶標(biāo)儀購自瑞士TECAN公司，激光共聚焦顯微鏡購自于日本JEOL公司；倒置光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司。DMEM/F12培養(yǎng)基以及2.5 g/L胰蛋白消化酶、Earle平衡鹽溶液購自Hyclone公司；胎牛血清、Neurobasal-A培養(yǎng)基、B27均購自美國Gibco公司；L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、多聚賴氨酸購買自美國Sigma公司；TIGAR過表達(dá)的慢病毒(LV-TIGAR)及其對(duì)照組(LV-GFP)，TIGAR沉默的慢病毒(LV_sh-TIGAR)及其對(duì)照組(LV_sh-scramble)購買自上海吉瑪公司；小鼠抗大鼠Drpl、AIF、ROCK1單克隆抗體、兔抗大鼠Fis1、TIGAR單克隆抗體均購自美國Millipore公司；山羊抗鼠IgG/FITC、山羊抗兔IgG/RBITC購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。ROS熒光素探針(DCFH-DA)購于中國碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 液體的配制

細(xì)胞種植液：DMEM/F12高糖培養(yǎng)基80 mL+體積分?jǐn)?shù)0.20的胎牛血清20 mL，4 ℃環(huán)境下進(jìn)行保存；Neurobasal-A培養(yǎng)液：Neurobasal-A基礎(chǔ)培養(yǎng)液100 mL，其中含體積分?jǐn)?shù)0.02的B27，體積分?jǐn)?shù)0.01的1 mol/L谷氨酰胺，體積分?jǐn)?shù)為0.01的0.1 mol/L丙酮酸鈉，4 ℃環(huán)境下保存；L-多聚賴氨酸包被液：以高純水配制多聚賴氨酸至1 g/L，并以直徑0.22 μm無菌微孔過濾器過濾除菌(儲(chǔ)存液)，在-20 ℃環(huán)境下保存，稀釋多聚賴氨酸儲(chǔ)存液至50 mg/L(工作液)用于培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)皿包被。

1.4 方法

1.4.1原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng) 取新生的Wistar大鼠，以體積分?jǐn)?shù)為0.75的乙醇表面消毒后冰上斷頭取腦，逐層分離皮膚及硬腦膜，剔除表面軟腦膜及血管后獲取海馬組織，培養(yǎng)皿中將海馬組織剪碎后加入2.5 g/L的胰酶，輕微吹打并置于37 ℃水浴鍋中消化25 min。用含有體積分?jǐn)?shù)為0.20的胎牛血清的DMEDM/F12培養(yǎng)基終止消化，過200目篩網(wǎng)，1 000 r/min離心5 min后用含有體積分?jǐn)?shù)0.20胎牛血清的DMEDM/F12重懸，并在倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將25 mm×25 mm大小的培養(yǎng)瓶提前以0.1 g/L多聚賴氨酸包被過夜，使用前以PBS沖洗3次，將細(xì)胞以7×108/L的密度接種于培養(yǎng)瓶或者6孔板中，置于培養(yǎng)箱(37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 的CO2、相對(duì)濕度100%)中培養(yǎng)，根據(jù)神經(jīng)元貼壁情況24 h內(nèi)換為無血清的Neurobasal-A培養(yǎng)基。

1.4.2實(shí)驗(yàn)分組及處理 采用隨機(jī)數(shù)字表法將提取的原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞隨機(jī)分為6組：正常組(A組)在首次換液后根據(jù)神經(jīng)元生長情況及培養(yǎng)基顏色每2～3 d半量換液，培養(yǎng)至第8天，并繼續(xù)正常培養(yǎng)，不做任何處理；低氧復(fù)氧損傷組(B組)培養(yǎng)至第8天的神經(jīng)元采用氧糖剝奪法構(gòu)建大鼠海馬神經(jīng)元低氧復(fù)氧損傷模型[9]；過表達(dá)對(duì)照組(C組)將慢病毒空載體加入培養(yǎng)至第3天的原代海馬神經(jīng)元中共培養(yǎng)3～6 h后，換原培養(yǎng)基培養(yǎng)至第8天，進(jìn)行低氧復(fù)氧；TIGAR過表達(dá)組(D組)將過表達(dá)TIGAR的慢病毒加入第3天的原代海馬神經(jīng)元中共培養(yǎng)3～6 h后，換原培養(yǎng)基培養(yǎng)至第8天，進(jìn)行低氧復(fù)氧；沉默對(duì)照組(E組)將沉默隨機(jī)片段的慢病毒加入第3天的原代海馬神經(jīng)元中共培養(yǎng)3～6 h，換原培養(yǎng)基，進(jìn)行低氧復(fù)氧；TIGAR沉默組(F組)將沉默TIGAR的慢病毒加入第3天的原代海馬神經(jīng)元中共培養(yǎng)3～6 h，換原培養(yǎng)基培養(yǎng)至第8天，進(jìn)行低氧復(fù)氧。

1.4.3Western blot方法檢測線粒體分裂及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白TIGAR、Drp1、Fis1、AIF及ROCK1的表達(dá) 提取各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞的蛋白，BCA法測定蛋白濃度后調(diào)定。根據(jù)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分別配制丙烯酰胺體積分?jǐn)?shù)為0.06、0.10、0.15的分離膠和丙烯酰胺體積分?jǐn)?shù)為0.05的濃縮膠，依次將各組蛋白樣品上樣，電泳1.5 h后轉(zhuǎn)膜1 h，以體積分?jǐn)?shù)0.05的脫脂奶粉封閉2 h，分別加入兔抗大鼠單克隆一抗Fis1(1∶1 000)、兔抗大鼠單克隆一抗TIGAR(1∶1 000)、小鼠抗大鼠單克隆一抗Drp1(1∶2 000)、小鼠抗大鼠單克隆一抗AIF(1∶2 000)以及小鼠抗大鼠單克隆一抗ROCK1(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次(15 min/次)后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠、山羊抗兔、兔抗綿羊IgG二抗(1∶5 000)常溫下孵育1 h，TBST洗膜3次(每次15 min)后顯影，GADPH作為內(nèi)參照，利用Image pro軟件對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行灰度分析，目的蛋白灰度值和GADPH蛋白灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況 收集各組的海馬神經(jīng)元細(xì)胞于1.5 mL的EP管中，以預(yù)冷的PBS沖洗1次，然后以1 000 r/min離心3 min，1×Binding buffer 100 μL重懸以后分別加入AV PI各5 μL，室溫避光孵育15 min，1×Binding buffer補(bǔ)足至500 μL，即可上機(jī)檢測。采用Flow Jo軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.4.5激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度 Hank液沖洗各組海馬神經(jīng)元貼壁的細(xì)胞爬片后，向6孔板各孔內(nèi)加入10 μmol/L的DCFH-DA約1 mL，37 ℃避光孵育45 min，以無血清培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞3次后，以40 g/L的多聚甲醛固定45 min，甘油防止熒光猝滅，封片后，激光共聚焦顯微鏡觀察ROS熒光強(qiáng)度，采用Image J軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組海馬神經(jīng)元ROS濃度及細(xì)胞凋亡率比較

A～F組ROS濃度分別為0.021±0.001、0.076±0.002、0.075±0.001、0.051±0.001、0.077±0.003、0.089±0.002，細(xì)胞的凋亡率分別為3.117±0.179、42.657±1.661、40.597±0.587、25.602±0.744、41.690±1.193、50.253±0.863。與A組相比，B～F組海馬神經(jīng)元的細(xì)胞凋亡率和ROS熒光強(qiáng)度均明顯增高(F=900.89、1161.10，P<0.05)。與B組相比，D組海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率和ROS熒光強(qiáng)度均明顯降低，F(xiàn)組海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率及ROS熒光強(qiáng)度明顯升高(P<0.05)，而C組和E組海馬神經(jīng)元的細(xì)胞凋亡率和ROS熒光強(qiáng)度比較差異無顯著性(P>0.05)。

2.2 各組海馬神經(jīng)元線粒體分裂及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平比較

與A組相比，其他5組神經(jīng)元TIGAR表達(dá)水平均明顯升高(F=73.73，P<0.05)；與B組相比，F(xiàn)組神經(jīng)元的TIGAR表達(dá)水平明顯下降，D組神經(jīng)元的TIGAR表達(dá)水平明顯上升(P<0.05)，C組和E組神經(jīng)元的TIGAR表達(dá)量差異無顯著意義(P>0.05)。與A組相比較，其他5組神經(jīng)元的Drp1、Fis1、AIF及ROCK1的表達(dá)水平均明顯升高(F=96.756～667.63，P<0.05)；與B組相比，F(xiàn)組的上述蛋白表達(dá)水平均明顯升高，D組的上述蛋白表達(dá)水平均明顯下降(P<0.05)，C組和E組上述蛋白的表達(dá)水平差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

表1 各組海馬神經(jīng)元線粒體及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較

3 討 論

線粒體是真核細(xì)胞最為重要的細(xì)胞器之一，通過氧化磷酸化為機(jī)體的各種生命活動(dòng)提供能量。過去認(rèn)為線粒體的形態(tài)是一成不變的，但是近年來的研究表明線粒體在不斷地進(jìn)行著分裂融合并維持相對(duì)的動(dòng)態(tài)平衡[10-11]。這種動(dòng)態(tài)平衡一旦被破壞，則易引發(fā)疾病。線粒體動(dòng)力學(xué)變化尤其是線粒體分裂在腦缺血再灌注過程中占據(jù)重要地位[11-12]。

線粒體呼吸鏈?zhǔn)荝OS最主要的來源，缺血再灌注過程中，低氧使得線粒體氧化呼吸鏈解耦聯(lián)，產(chǎn)生大量的ROS[13]，直接損傷mtDNA和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞凋亡。一定濃度的ROS又可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和肌漿網(wǎng)大量開放使得Ca2+的濃度升高，胞漿中的Ca2+作為第二信使又會(huì)啟動(dòng)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)一步升高ROS水平[14-15]。我們課題組之前的研究顯示，Ca2+水平的升高可激活胞漿內(nèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶，該酶的激活可以導(dǎo)致線粒體分裂動(dòng)力蛋白Drp1-sr637位點(diǎn)的絲氨酸磷酸化，使得位于胞漿的Drp1向線粒體轉(zhuǎn)移，并與位于線粒體外膜上的招募蛋白Fis1錨定，通過水解GTP改變分子間的距離和角度，微管重新分布最終引起線粒體分裂[16-18]。線粒體分裂使得線粒體完整性受到破壞，釋放細(xì)胞色素C、AIF等促凋亡因子，激活caspase3并啟動(dòng)不可逆的程序化細(xì)胞凋亡途徑[19]。

此外，有研究表明，ROS也可以通過Rho/Rho-Kinase信號(hào)通路調(diào)節(jié)心臟以及腎臟缺血再灌注損傷，并且參與調(diào)節(jié)線粒體的功能及動(dòng)態(tài)變化[20-21]。NOMA等[22]的研究也證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)的ROS含量升高可以通過激活Rho-A提高下游的ROCK1活性，從而引起Drp1-ser600位點(diǎn)絲氨酸的磷酸化導(dǎo)致線粒體分裂。

TIGAR作為p53下游的調(diào)控因子，作用類似于PFKFB，可在低氧的環(huán)境下表達(dá)升高，同時(shí)減低2，6-二磷酸果糖水平，抑制糖酵解，并通過促進(jìn)磷酸戊糖途徑升高細(xì)胞內(nèi)NADPH的水平，降低ROS的水平[6-8]。

本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建海馬神經(jīng)元低氧復(fù)氧損傷模型，通過外源性轉(zhuǎn)染慢病毒提高海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的TIGAR水平，可顯著降低神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，抑制ROCK1、Drp1和Fis1蛋白的表達(dá)水平，減輕線粒體損傷程度，減少AIF釋放，進(jìn)一步驗(yàn)證了TIGAR過表達(dá)可通過抑制線粒體分裂減輕細(xì)胞凋亡、保護(hù)神經(jīng)元的作用。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)仍有一定的局限性，TIGAR過表達(dá)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)ROS的具體途徑及表達(dá)方式，仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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