(青島大學附屬醫(yī)院麻醉科，山東 青島 266021)

近年來，關于缺血再灌注損傷的研究越來越多，其中腦缺血再灌注損傷(CIRI)已逐漸成為研究熱點，CIRI指各種原因致腦組織缺血后恢復血供，其缺血損傷未減輕反而加重的現(xiàn)象[1]。線粒體介導的凋亡途徑在此過程中發(fā)揮重要作用，本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體分裂可以促進細胞凋亡的發(fā)生，而抑制線粒體分裂可以減輕缺血再灌注引起的神經(jīng)細胞損傷[2-5]。Tp53誘導的糖酵解和凋亡調(diào)節(jié)因子(TIGAR)是p53下游基因，其過表達可以抑制體內(nèi)低氧狀態(tài)下的糖酵解過程并活化磷酸戊糖途徑，降低細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，從而減輕氧化應激對細胞的損傷[6]。研究顯示，在小鼠體內(nèi)外CIRI模型中，過表達TIGAR可以升高神經(jīng)細胞中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)水平，降低神經(jīng)元細胞內(nèi)ROS水平，從而減少腦梗死面積和神經(jīng)元凋亡情況[7-8]。目前關于TIGAR過表達是否是通過調(diào)控線粒體分裂來發(fā)揮缺血再灌注過程中的腦保護作用的研究較少。本實驗擬探討TIGAR基因表達在大鼠神經(jīng)元低氧復氧損傷中對線粒體分裂的影響，為CIRI的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物來源

出生24 h內(nèi)SPF級Wistar大鼠300只，皮膚黏膜紅潤，運動活躍，體質(zhì)量(8±3) g，無性別要求(購自青島市藥檢所動物中心)。

1.2 儀器與試劑

流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司，酶標儀購自瑞士TECAN公司，激光共聚焦顯微鏡購自于日本JEOL公司；倒置光學顯微鏡購自日本Olympus公司。DMEM/F12培養(yǎng)基以及2.5 g/L胰蛋白消化酶、Earle平衡鹽溶液購自Hyclone公司；胎牛血清、Neurobasal-A培養(yǎng)基、B27均購自美國Gibco公司；L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、多聚賴氨酸購買自美國Sigma公司；TIGAR過表達的慢病毒(LV-TIGAR)及其對照組(LV-GFP)，TIGAR沉默的慢病毒(LV_sh-TIGAR)及其對照組(LV_sh-scramble)購買自上海吉瑪公司；小鼠抗大鼠Drpl、AIF、ROCK1單克隆抗體、兔抗大鼠Fis1、TIGAR單克隆抗體均購自美國Millipore公司；山羊抗鼠IgG/FITC、山羊抗兔IgG/RBITC購自北京博奧森生物技術有限公司。ROS熒光素探針(DCFH-DA)購于中國碧云天生物技術有限公司。

1.3 液體的配制

細胞種植液：DMEM/F12高糖培養(yǎng)基80 mL+體積分數(shù)0.20的胎牛血清20 mL，4 ℃環(huán)境下進行保存；Neurobasal-A培養(yǎng)液：Neurobasal-A基礎培養(yǎng)液100 mL，其中含體積分數(shù)0.02的B27，體積分數(shù)0.01的1 mol/L谷氨酰胺，體積分數(shù)為0.01的0.1 mol/L丙酮酸鈉，4 ℃環(huán)境下保存；L-多聚賴氨酸包被液：以高純水配制多聚賴氨酸至1 g/L，并以直徑0.22 μm無菌微孔過濾器過濾除菌(儲存液)，在-20 ℃環(huán)境下保存，稀釋多聚賴氨酸儲存液至50 mg/L(工作液)用于培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)皿包被。

1.4 方法

1.4.1原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng) 取新生的Wistar大鼠，以體積分數(shù)為0.75的乙醇表面消毒后冰上斷頭取腦，逐層分離皮膚及硬腦膜，剔除表面軟腦膜及血管后獲取海馬組織，培養(yǎng)皿中將海馬組織剪碎后加入2.5 g/L的胰酶，輕微吹打并置于37 ℃水浴鍋中消化25 min。用含有體積分數(shù)為0.20的胎牛血清的DMEDM/F12培養(yǎng)基終止消化，過200目篩網(wǎng)，1 000 r/min離心5 min后用含有體積分數(shù)0.20胎牛血清的DMEDM/F12重懸，并在倒置顯微鏡下進行細胞計數(shù)。將25 mm×25 mm大小的培養(yǎng)瓶提前以0.1 g/L多聚賴氨酸包被過夜，使用前以PBS沖洗3次，將細胞以7×108/L的密度接種于培養(yǎng)瓶或者6孔板中，置于培養(yǎng)箱(37 ℃、含體積分數(shù)0.05 的CO2、相對濕度100%)中培養(yǎng)，根據(jù)神經(jīng)元貼壁情況24 h內(nèi)換為無血清的Neurobasal-A培養(yǎng)基。

1.4.2實驗分組及處理 采用隨機數(shù)字表法將提取的原代海馬神經(jīng)元細胞隨機分為6組：正常組(A組)在首次換液后根據(jù)神經(jīng)元生長情況及培養(yǎng)基顏色每2～3 d半量換液，培養(yǎng)至第8天，并繼續(xù)正常培養(yǎng)，不做任何處理；低氧復氧損傷組(B組)培養(yǎng)至第8天的神經(jīng)元采用氧糖剝奪法構(gòu)建大鼠海馬神經(jīng)元低氧復氧損傷模型[9]；過表達對照組(C組)將慢病毒空載體加入培養(yǎng)至第3天的原代海馬神經(jīng)元中共培養(yǎng)3～6 h后，換原培養(yǎng)基培養(yǎng)至第8天，進行低氧復氧；TIGAR過表達組(D組)將過表達TIGAR的慢病毒加入第3天的原代海馬神經(jīng)元中共培養(yǎng)3～6 h后，換原培養(yǎng)基培養(yǎng)至第8天，進行低氧復氧；沉默對照組(E組)將沉默隨機片段的慢病毒加入第3天的原代海馬神經(jīng)元中共培養(yǎng)3～6 h，換原培養(yǎng)基，進行低氧復氧；TIGAR沉默組(F組)將沉默TIGAR的慢病毒加入第3天的原代海馬神經(jīng)元中共培養(yǎng)3～6 h，換原培養(yǎng)基培養(yǎng)至第8天，進行低氧復氧。

1.4.3Western blot方法檢測線粒體分裂及細胞凋亡相關蛋白TIGAR、Drp1、Fis1、AIF及ROCK1的表達 提取各組海馬神經(jīng)元細胞的蛋白，BCA法測定蛋白濃度后調(diào)定。根據(jù)蛋白的相對分子質(zhì)量分別配制丙烯酰胺體積分數(shù)為0.06、0.10、0.15的分離膠和丙烯酰胺體積分數(shù)為0.05的濃縮膠，依次將各組蛋白樣品上樣，電泳1.5 h后轉(zhuǎn)膜1 h，以體積分數(shù)0.05的脫脂奶粉封閉2 h，分別加入兔抗大鼠單克隆一抗Fis1(1∶1 000)、兔抗大鼠單克隆一抗TIGAR(1∶1 000)、小鼠抗大鼠單克隆一抗Drp1(1∶2 000)、小鼠抗大鼠單克隆一抗AIF(1∶2 000)以及小鼠抗大鼠單克隆一抗ROCK1(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次(15 min/次)后，用辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠、山羊抗兔、兔抗綿羊IgG二抗(1∶5 000)常溫下孵育1 h，TBST洗膜3次(每次15 min)后顯影，GADPH作為內(nèi)參照，利用Image pro軟件對蛋白質(zhì)條帶進行灰度分析，目的蛋白灰度值和GADPH蛋白灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.4.4流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 收集各組的海馬神經(jīng)元細胞于1.5 mL的EP管中，以預冷的PBS沖洗1次，然后以1 000 r/min離心3 min，1×Binding buffer 100 μL重懸以后分別加入AV PI各5 μL，室溫避光孵育15 min，1×Binding buffer補足至500 μL，即可上機檢測。采用Flow Jo軟件分析細胞凋亡率。

1.4.5激光共聚焦顯微鏡檢測細胞內(nèi)ROS熒光強度 Hank液沖洗各組海馬神經(jīng)元貼壁的細胞爬片后，向6孔板各孔內(nèi)加入10 μmol/L的DCFH-DA約1 mL，37 ℃避光孵育45 min，以無血清培養(yǎng)基沖洗細胞3次后，以40 g/L的多聚甲醛固定45 min，甘油防止熒光猝滅，封片后，激光共聚焦顯微鏡觀察ROS熒光強度，采用Image J軟件對圖片進行分析。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 各組海馬神經(jīng)元ROS濃度及細胞凋亡率比較

A～F組ROS濃度分別為0.021±0.001、0.076±0.002、0.075±0.001、0.051±0.001、0.077±0.003、0.089±0.002，細胞的凋亡率分別為3.117±0.179、42.657±1.661、40.597±0.587、25.602±0.744、41.690±1.193、50.253±0.863。與A組相比，B～F組海馬神經(jīng)元的細胞凋亡率和ROS熒光強度均明顯增高(F=900.89、1161.10，P<0.05)。與B組相比，D組海馬神經(jīng)元細胞凋亡率和ROS熒光強度均明顯降低，F(xiàn)組海馬神經(jīng)元細胞凋亡率及ROS熒光強度明顯升高(P<0.05)，而C組和E組海馬神經(jīng)元的細胞凋亡率和ROS熒光強度比較差異無顯著性(P>0.05)。

2.2 各組海馬神經(jīng)元線粒體分裂及細胞凋亡相關蛋白的表達水平比較

與A組相比，其他5組神經(jīng)元TIGAR表達水平均明顯升高(F=73.73，P<0.05)；與B組相比，F(xiàn)組神經(jīng)元的TIGAR表達水平明顯下降，D組神經(jīng)元的TIGAR表達水平明顯上升(P<0.05)，C組和E組神經(jīng)元的TIGAR表達量差異無顯著意義(P>0.05)。與A組相比較，其他5組神經(jīng)元的Drp1、Fis1、AIF及ROCK1的表達水平均明顯升高(F=96.756～667.63，P<0.05)；與B組相比，F(xiàn)組的上述蛋白表達水平均明顯升高，D組的上述蛋白表達水平均明顯下降(P<0.05)，C組和E組上述蛋白的表達水平差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

表1 各組海馬神經(jīng)元線粒體及凋亡相關蛋白表達水平的比較

3 討 論

線粒體是真核細胞最為重要的細胞器之一，通過氧化磷酸化為機體的各種生命活動提供能量。過去認為線粒體的形態(tài)是一成不變的，但是近年來的研究表明線粒體在不斷地進行著分裂融合并維持相對的動態(tài)平衡[10-11]。這種動態(tài)平衡一旦被破壞，則易引發(fā)疾病。線粒體動力學變化尤其是線粒體分裂在腦缺血再灌注過程中占據(jù)重要地位[11-12]。

線粒體呼吸鏈是ROS最主要的來源，缺血再灌注過程中，低氧使得線粒體氧化呼吸鏈解耦聯(lián)，產(chǎn)生大量的ROS[13]，直接損傷mtDNA和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，引起細胞凋亡。一定濃度的ROS又可誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和肌漿網(wǎng)大量開放使得Ca2+的濃度升高，胞漿中的Ca2+作為第二信使又會啟動多條信號轉(zhuǎn)導途徑進一步升高ROS水平[14-15]。我們課題組之前的研究顯示，Ca2+水平的升高可激活胞漿內(nèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶，該酶的激活可以導致線粒體分裂動力蛋白Drp1-sr637位點的絲氨酸磷酸化，使得位于胞漿的Drp1向線粒體轉(zhuǎn)移，并與位于線粒體外膜上的招募蛋白Fis1錨定，通過水解GTP改變分子間的距離和角度，微管重新分布最終引起線粒體分裂[16-18]。線粒體分裂使得線粒體完整性受到破壞，釋放細胞色素C、AIF等促凋亡因子，激活caspase3并啟動不可逆的程序化細胞凋亡途徑[19]。

此外，有研究表明，ROS也可以通過Rho/Rho-Kinase信號通路調(diào)節(jié)心臟以及腎臟缺血再灌注損傷，并且參與調(diào)節(jié)線粒體的功能及動態(tài)變化[20-21]。NOMA等[22]的研究也證實，細胞內(nèi)的ROS含量升高可以通過激活Rho-A提高下游的ROCK1活性，從而引起Drp1-ser600位點絲氨酸的磷酸化導致線粒體分裂。

TIGAR作為p53下游的調(diào)控因子，作用類似于PFKFB，可在低氧的環(huán)境下表達升高，同時減低2，6-二磷酸果糖水平，抑制糖酵解，并通過促進磷酸戊糖途徑升高細胞內(nèi)NADPH的水平，降低ROS的水平[6-8]。

本實驗通過構(gòu)建海馬神經(jīng)元低氧復氧損傷模型，通過外源性轉(zhuǎn)染慢病毒提高海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)的TIGAR水平，可顯著降低神經(jīng)細胞內(nèi)ROS水平，抑制ROCK1、Drp1和Fis1蛋白的表達水平，減輕線粒體損傷程度，減少AIF釋放，進一步驗證了TIGAR過表達可通過抑制線粒體分裂減輕細胞凋亡、保護神經(jīng)元的作用。當然，本實驗仍有一定的局限性，TIGAR過表達調(diào)控細胞內(nèi)ROS的具體途徑及表達方式，仍需要進一步的實驗研究。

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