(1 青島大學附屬醫(yī)院胸外科，山東 青島 266003； 2 青島大學轉化醫(yī)學研究院； 3 濱州市濱城區(qū)市立醫(yī)院檢驗科)

肺癌是中國乃至世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。肺癌包括小細胞肺癌(SCLC)以及非小細胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC是最為常見的肺癌病理類型，約占全部肺癌病人的85%[1-2]。NSCLC包括腺癌、鱗狀細胞癌以及大細胞癌等，其中以腺癌最為多見[3]。由于肺癌早期缺乏有效的診斷方法，臨床發(fā)現(xiàn)時往往已處于晚期階段，總的5年生存率僅為15%[3]。微小RNA(miRNA)是一類小的(長度為19～24個核苷酸)且高度保守非編碼RNA。miRNA通過與特異的靶mRNA結合調(diào)控其降解或者抑制其翻譯，從而降低相關靶基因蛋白質(zhì)的表達[4]。生物信息學數(shù)據(jù)表明，miRNA參與調(diào)控多種生物活動，包括發(fā)育、器官形成、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等[5]。不同的miRNA可以通過多種途徑發(fā)揮促癌或抑癌作用，具體取決于其在細胞中的表達方式、靶基因或者細胞環(huán)境[6]。HUR等[7]研究發(fā)現(xiàn),miRNA-200c在介導人結直腸癌轉移中的上皮-間質(zhì)轉化(EMT)中發(fā)揮重要作用，并且miR-200c可以作為結直腸癌病人的潛在診斷標記和治療靶標。SEOL等[8]研究顯示，miR-373通過組蛋白修飾在肺癌細胞中表達下調(diào)，并通過下調(diào)IRAK2和LAMP1來抑制腫瘤的生長。ZHOU等[9]發(fā)現(xiàn)miR-27a-5p以及miR-27-3p兩種亞型在胃癌組織和細胞系中均高表達，但miR-27a的主要亞型miR-27a-3p的表達水平顯著地高于miR-27a-5p并可以促進胃癌細胞的增殖能力。目前關于miR-27a的主要亞型miR-27a-3p在肺腺癌病人中的表達以及對肺腺癌細胞生物學行為的影響未見相關研究報道。本研究旨在測定肺腺癌組織和細胞中miRNA-27a-3p的表達水平，以及miR-27a-3p過表達或沉默對肺腺癌細胞增殖和遷移能力的影響，從而為臨床治療該病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

收集2017年5月—2017年9月于我院胸外科行根治性或姑息性切除術的21例肺腺癌病人原發(fā)病灶及癌旁組織(距離癌組織5 cm以上)標本。所有病人病歷資料完整，均經(jīng)過病理學檢查確診為肺浸潤性腺癌，并且術前均未進行輔助放化療。所有收集的臨床標本均立即在液氮中冷凍，然后凍存于-80 ℃冰箱中。本研究獲得了我院倫理委員會批準。試驗參與者均知情同意參與本研究。

1.2 細胞培養(yǎng)及試劑

人肺腺癌細胞A549細胞系購自中國科學院上海細胞庫。胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基均購自以色列Biological Industries。將A549細胞在含有體積分數(shù)0.10的胎牛血清，1×105U/L的青霉素，100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于含體積分數(shù)0.05 CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。miR-27a-3p模擬物(miR-27a-3p mimics)及其陰性對照物，miR-27a-3p抑制劑(miR-27a-3p inhibitor)及其陰性對照物均由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成。RNA反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit)以及RT-qPCR試劑盒(SYBR Green I kit)均購自日本TaKaRa公司，MTT試劑盒購自上海拜力生物科技有限公司，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000及RNA提取試劑(trizol)購自Life Technologies公司(Carlsbad，CA，USA)。

1.3 RNA提取及RT-qPCR

按照RNA提取試劑盒說明書用TRIzol提取癌組織和相應癌旁組織的細胞總RNA，以細胞總RNA為模板，應用miRNA逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，根據(jù)RT-qPCR試劑盒說明書對cDNA進行擴增，使用U6作為內(nèi)參基因來檢測miR-27a-3p的相對表達量。RT-qPCR總反應體系為25 μL。反應條件為：95 ℃預變性5 min；然后95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共進行40個循環(huán)。miR-27a-3p逆轉錄引物5′-GTCGTATCCAG-TGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATAC-GACGCGGAA-3′；miR-27a-3p上游引物5′-CGCC-GTTCACAGTGGCTAAG-3′，下游引物5′-GTGC-AGGGTCCGAGGT-3′；內(nèi)參U6上游引物5′-CTC-GCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-27a-3p和U6表達水平根據(jù)閾值周期(Ct)定義。使用2-△△Ct方法評估相對表達水平。實驗重復3次，取均值。

1.4 MTT檢測細胞增殖情況

將A549細胞消化離心后，用含體積分數(shù)0.10胎牛血清1640培養(yǎng)基重懸細胞。按照5×106/L的密度接種于96孔板中，每孔200 μL，置于含體積分數(shù)0.05 CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設置對照組、miR-27a-3p mimics組(A組)、miR-27a-3p mimics control組(B組)、miR-27a-3p inhibitor組(C組)和miR-27a-3p inhibitor control組(D組)。孵育6 h后，更換為無血清培養(yǎng)基，用miR-27a-3p mimics和miR-27a-3p inhibitor及其陰性對照物轉染細胞，將轉染后細胞置于含體積分數(shù)0.05 CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。將細胞繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72和96 h，每孔加入滅菌MTT溶液15 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，搖床緩慢振蕩10 min，用酶標儀在492 nm波長下測定吸光度(A)值。每組設6個復孔，實驗重復3次，取均值。

1.5 細胞劃痕實驗

將A549細胞以1×108/L的密度接種于6孔板內(nèi)，每孔1 mL。設置對照組、A組、B組、C組和D組。將細胞進行轉染24 h后，用規(guī)格為200 μL的Tip頭對細胞進行劃痕，用PBS洗滌去除懸浮的細胞。分別于劃痕后0和24 h進行拍照，然后采用Image Pro Plus6分析圖像，計算劃痕愈合面積。實驗重復3次，取均值。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 兩種組織中miR-27a-3p的表達

RT-qPCR檢測結果顯示，與癌旁組織相比，21例肺腺癌組織中有13例組織中的miR-27a-3p表達水平上調(diào)，其中11例組織中miR-27a-3p呈現(xiàn)高表達；3例組織中miR-27a-3p表達水平無明顯變化；5例組織中miR-27a-3p表達水平降低。癌旁組織與相應的肺腺癌組織中miR-27a-3p的平均表達水平分別為1.00±0.01、1.82±0.11，與癌旁組織相比，肺腺癌組織中的表達水平明顯升高(t=12.912，P<0.01)。本研究選取了3組樣本的PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳實驗。PCR產(chǎn)物凝膠電泳結果顯示，與癌旁組織相比，肺腺癌組織中miR-27a-3p表達水平明顯增高。見圖1。

T：肺腺癌組織；N：癌旁組織。

2.2 A549細胞系中miR-27a-3p的表達

在A549細胞轉染24 h后，設對照組細胞表達水平為1.00，A組和B組細胞的miR-27a-3p表達水平分別為27.96±1.69、1.51±0.53，與B組相比A組表達水平顯著增高(t=25.866，P<0.01)。C組以及D組的表達水平明分別為0.10±0.019、1.47±0.32，與D組相比，C組表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=7.441，P<0.05)。

2.3 A549細胞增殖能力檢測結果

通過MTT增殖實驗檢測對照組、A組、B組、C組和D組細胞在轉染后不同時間點細胞的增殖活性。與B組相比，在48、72、96 h時間點，A組細胞的增殖能力明顯增強(t=5.459～6.793，P<0.05)；與D組相比，C組細胞的增殖能力則顯著降低(t=4.593～5.322，P<0.05)。見表1。

表1 組細胞增殖活力比較

2.4 A549細胞遷移能力檢測結果

將相應轉染后的不同組別細胞進行劃痕實驗。A組以及B組細胞劃痕的愈合面積百分比分別為0.70±0.08、0.23±0.04。與B組相比，A組細胞愈合面積顯著增加(t=9.102，P<0.01)。C組和D組細胞劃痕的愈合面積百分比分別為0.14±0.03、0.39±0.05。與D組相比，C組細胞愈合面積明顯降低(t=7.426，P<0.01)。

3 討 論

近年來，大量研究證實miRNA的表達失調(diào)或功能異常可能導致包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生。研究顯示在人類腫瘤中存在miRNA表達的失調(diào)，miRNA通過發(fā)揮促癌或抑癌作用參與腫瘤細胞的增殖、凋亡以及分化調(diào)控[10，12]。例如HUANG等[13]研究顯示，miR-10b在NSCLC組織中異常高表達，miR-10b的沉默通過阻滯G0/G1期中的細胞周期進程并且促進NSCLC細胞中的細胞凋亡來抑制癌細胞進展。而CAMPAYO等[14]發(fā)現(xiàn)miR-145在NSCLC組織中表達降低，提高其表達水平可抑制肺癌的發(fā)生發(fā)展。因此，了解miRNA在腫瘤中的表達及其對腫瘤細胞生物學功能的影響對于發(fā)現(xiàn)癌癥治療策略具有重要價值。

研究表明，miR-27a-3p在多種癌癥組織中高表達，包括胰腺癌、卵巢癌等，并與癌細胞的生物學行為密切相關[9]。miR-27a在乳腺癌、胃癌、胰腺癌和結腸癌中作為致癌miRNA高度表達[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)miR-27a在乳腺癌中異常高表達，并且表達水平與乳腺癌病人的臨床分期和總體生存時間密切相關，其通過調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的細胞凋亡、細胞周期和分化而起作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)，在口腔鱗癌干細胞和腎癌細胞中miR-27a-3p的過表達與癌細胞轉移和侵襲性有關[16-17]。miR-27a在急性白血病中表達下調(diào)，這表明miR-27a可能在急性白血病中發(fā)揮腫瘤抑制劑樣作用[18]。也有研究表明miR-27a-3p表達水平在食管鱗狀細胞癌中顯著降低，miR-27a-3p在這些癌癥中具有腫瘤抑制作用[19]。miR-27a-3p在腫瘤中的作用機制較復雜，目前已發(fā)現(xiàn)多個下游作用靶點。研究發(fā)現(xiàn)miR-27a-3p在胃癌細胞中過表達可以降低BTG2蛋白的表達，通過胃癌細胞中的Ras/MEK/ERK途徑來促進C-myc的活化從而抑制胃癌細胞的凋亡[9]。LI等[20]研究證實miR-27a-3p在肝細胞癌組織中表達下調(diào)，細胞實驗結果證實miR-27a-3p表達可以下調(diào)肝細胞癌中DUSP16的表達，從而通過DUSP16靶向抑制癌細胞生長、遷移和侵襲能力。以上研究表明目前miR-27a-3p在腫瘤中的表達及生物學作用還需要進一步研究，而其在肺腺癌中的表達和意義目前還沒有證實。

本研究測定了肺腺癌組織和細胞中miR-27a的主要亞型miRNA-27a-3p的表達水平，同時構建miR-27a-3p過表達或沉默的A549細胞株來探究miR-27a-3p表達水平對肺腺癌細胞增殖和遷移能力的影響。為研究miR-27a-3p在肺腺癌中的表達水平，我們選取21例肺腺癌病人的腫瘤組織和癌旁組織進行檢測。結果顯示，與癌旁正常組織相比，miR-27a的主要亞型miR-27a-3p在肺腺癌組織中的表達水平明顯升高。研究證實miR-27a-3p在肺腺癌中高表達，這提示miR-27a-3p的上調(diào)可能在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中起一定作用。進一步通過轉染miR-27a-3p mimics或miR-27a-3p inhibitor來上調(diào)或沉默肺腺癌A549細胞中miR-27a-3p的表達水平，并觀察轉染后細胞增殖和遷移能力的變化。研究顯示，miR-27a-3p的上調(diào)能夠顯著增強腫瘤細胞的增殖和遷移能力，這說明miR-27a-3p可以明顯促進肺腺癌細胞的生長和侵襲能力。相反，miR-27a-3p的下調(diào)則明顯降低了肺腺癌細胞的增殖和遷移能力。這提示miR-27a-3p在肺腺癌細胞侵襲和轉移中扮演重要角色。肺癌細胞的增殖和侵襲能力是肺癌進展快惡性度高的重要因素，我們的數(shù)據(jù)首次證實miR-27a-3p在肺腺癌中表達上調(diào)，并能增強肺腺癌細胞的增殖和侵襲能力。因此，miR-27a主要亞型miR-27a-3p是肺腺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用的癌基因，可能為肺腺癌的治療提供潛在的治療靶點。本研究僅局限于臨床樣本和細胞功能的研究，今后還需要加大樣本量再深入研究miR-27a-3p表達水平與肺腺癌病人分期等臨床因素的關系以及在細胞中發(fā)揮作用的分子機制。

綜上所述，miR-27a主要亞型miR-27a-3p在肺腺癌組織中顯著異常高表達，其表達水平與肺腺癌細胞的增殖和遷移能力呈正相關。因此，miRNA-27a-3p的異常表達可能在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中起一定的作用，其作用的機制我們還會進一步研究，期望能更好地應用于肺腺癌早期診斷和防治。

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