，， ,2，

(1.中國科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150081；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150028)

0 引 言

大豆胞囊線蟲(Soybean cyst nematode，SCN)病是大豆產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的土傳病害，其病原為大豆胞囊線蟲(Heteroderaglycines)。由于大豆胞囊線蟲以胞囊形式存在于土壤中，造成連作大豆胞囊線蟲病危害加重[1-2]，但Hartwig[3]和Chen等[4]報道連續(xù)多年種植大豆感病品種，可減少大豆胞囊線蟲在土壤中的密度，稱此現(xiàn)象為 “大豆胞囊線蟲自然衰退”，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的土壤被稱為“線蟲抑制性土壤”，這種現(xiàn)象在我國大豆主產(chǎn)區(qū)也有報道[5-8]，孫玉秋等研究發(fā)現(xiàn)，大豆長期連作后土壤中胞囊數(shù)量接近輪作土壤中的胞囊數(shù)量，并且胞囊中的卵量也降低[9]。孫漫紅等研究發(fā)現(xiàn)，抑制性土壤中的空胞囊數(shù)量增加，并認為土壤中具有抑制因子可導(dǎo)致大豆胞囊線蟲衰退，并初步確定是食線蟲真菌的作用[10]。在美國也有報道大豆胞囊線蟲病土壤中雌蟲的寄生真菌有輔助鏈枝菌(Catenariaauxiliaris)、嗜雌線蟲菌(Nematophthoragynophila)和厚垣輪枝菌(Verticilliumchlamydosporium)[11]，這些真菌對降低大豆胞囊線蟲種群密度起了重要作用。2002年孫漫紅等發(fā)現(xiàn)在大豆連作多年土壤中胞囊定殖真菌數(shù)量較多，如淡紫擬青霉菌(Paecilomyceslilacinus)和厚垣輪枝菌[12]。Song等采用盆栽試驗在21年大豆連作土壤中加入真菌抑制劑匹馬霉素和細菌抑制劑硫酸鏈霉素，證明了抑制性土壤中的真菌對控制大豆胞囊線蟲的作用大于細菌的作用[13]；宋潔等[14]研究發(fā)現(xiàn)大豆連作20多年后，土壤中大豆胞囊線蟲不同蟲態(tài)上的厚垣輪枝菌和淡紫擬青霉菌分離數(shù)量明顯高于3 年連作和22 年輪作的。Song 等采用DGGE技術(shù)分析也得到了相同的結(jié)果[15]。陳立杰等報道連作6年的大豆田間土壤中鐮孢菌(Fusariumspp.)的分離頻率最高，認為鐮孢菌與連作田中不飽滿胞囊數(shù)量增多有關(guān)[16]。近年來有許多研究證明了厚垣輪枝菌、鐮孢菌和淡紫擬青霉菌等對大豆胞囊線蟲的寄生和抑制具有一定的影響[17-18]。

淡紫擬青霉菌是一種重要的線蟲寄生真菌，能寄生在多種植物病原線蟲卵、幼蟲和成蟲中，其代謝產(chǎn)物中含有一定濃度的乙酸等可殺線活性物質(zhì)，抑制線蟲卵孵化和二齡幼蟲活性[19]。有研究表明，實驗室條件下尖孢鐮孢芬芳變種(Fusariumoxysporumvar.redolens)和禾谷鐮孢菌(F.graminearum)發(fā)酵液，可有效地抑制大豆胞囊線蟲卵孵化，并對二齡幼蟲具有致死作用[20]。也有報道提出，厚垣輪枝菌發(fā)酵液同樣可抑制大豆胞囊線蟲卵孵化，使線蟲的二齡幼蟲致死[18,21]。Khan等研究表明，淡紫擬青霉菌的培養(yǎng)液能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和絲氨酸蛋白酶，并通過這兩種酶的作用破壞根結(jié)線蟲(Meloidogynejovanica)卵殼，而使菌絲侵入根結(jié)線蟲的卵并寄生于卵內(nèi)，因而有效地降低根結(jié)線蟲卵孵化成幼蟲[22]。但以往研究多集中于某種單一寄生真菌或發(fā)酵液對大豆胞囊線蟲的作用，由于大豆田土壤中微生態(tài)環(huán)境復(fù)雜，多種微生物并存。因此，本研究為了明確寄生真菌對大豆胞囊線蟲作用，采用大豆胞囊線蟲優(yōu)勢寄生菌群，探討其發(fā)酵液混合后對大豆胞囊線蟲的毒性大小，旨在為生產(chǎn)中大豆胞囊線蟲的生物生態(tài)防控提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試寄生真菌、線蟲及大豆品種

寄生真菌為淡紫擬青霉菌4個菌株(P-1、P-V、P-40和P-E)、鐮孢菌屬4個菌株(F-1、F-5、F-9和F-V)和厚垣輪枝菌4個菌株(V-1、V-2、V-21和 V-25)。供試真菌由中國科學(xué)院黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點實驗室從大豆胞囊線蟲抑制性土壤中分離、保存，并鑒定其對寄生大豆胞囊線蟲的致病性，結(jié)果顯示供試菌株寄生大豆胞囊線蟲胞囊、卵后可有效抑制線蟲孵化并使二齡幼蟲(J2)致死[23]。測定供試菌株的單獨發(fā)酵液對大豆胞囊線蟲毒力也表明其對大豆胞囊線蟲胞囊、卵和J2的毒性[20,24]。

供試線蟲為大豆胞囊線蟲3號生理小種，該小種是我國大豆主產(chǎn)區(qū)優(yōu)勢小種。盆栽試驗，供試大豆品種為合豐25，該品種對大豆胞囊線蟲3號生理小種感病。供試培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(PDB)[25]和水瓊脂培養(yǎng)基(WA)。

1.2 寄生真菌發(fā)酵液制備

將每個供試菌株分別挑取菌絲在PDA培養(yǎng)基上活化7 d后打取直徑為4 mm的菌塊15塊，接種于100 mL PDB培養(yǎng)液中，30 ℃、180 r·min-1震蕩培養(yǎng)24 h作為種子液。取4 mL種子液，接種到120 mL PDB培養(yǎng)液中，相同條件下震蕩培養(yǎng)5 d，在4 ℃條件下離心20 min (10 000 r·min-1)，上清液用細菌過濾器過濾，即為寄生真菌發(fā)酵原液。

1.3 大豆胞囊線蟲胞囊分離和卵及二齡幼蟲(J2)懸液制備

取田間5～20 cm耕層大豆根圍土，進行線蟲胞囊分離。將新鮮土在燒杯中加清水?dāng)嚢?，浸? h后過套篩(20目和80目)，將80目篩上的殘留物用63%蔗糖收集到離心管中，離心5 min(2 500 r·min-1)，將殘留物過濾，挑取成熟飽滿的線蟲胞囊，放4 ℃冰箱保存。

將飽滿胞囊放入套篩(200目和500目)中研磨，收集殘留物，用0.5% NaClO溶液消毒，清水沖洗，用滅菌水制備卵懸液，調(diào)整濃度到5 000個·mL-1，放4 ℃冰箱保存。

將線蟲卵置于420目篩網(wǎng)布上，放入含0.4 mmol·L-1ZnCl2溶液的孵化池中，25 ℃培養(yǎng)箱中進行孵化。

1.4 混合寄生真菌發(fā)酵液對大豆胞囊線蟲毒力測定

按1.2方法制備的3種寄生真菌發(fā)酵液按1∶1∶1比例混合[26]，采用正交試驗，篩選優(yōu)勢寄生菌組合，見表1。

表1 菌株混合方式正交表Table 1 Orthogonal table of mixed parasitic fungal strains

1.4.1 混合寄生真菌發(fā)酵液對SCN胞囊孵化的影響。新鮮飽滿的線蟲胞囊分別置于24孔細胞培養(yǎng)板中(每孔10個)，每孔加入2 mL混合寄生真菌發(fā)酵液，以空白培養(yǎng)液為對照，每個處理3次重復(fù)，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔3 d記錄孵化的線蟲數(shù)，計算孵化抑制率。

孵化抑制率(%)=(對照孵化線蟲數(shù)-處理孵化線蟲數(shù))/對照孵化線蟲數(shù)×100%

1.4.2 混合寄生真菌發(fā)酵液對SCN卵孵化的影響。在24孔細胞培養(yǎng)板中加入線蟲卵懸液，每孔0.4 μL(約200粒)，每孔加入2 mL混合寄生真菌發(fā)酵液，以空白培養(yǎng)液為對照，每個處理3次重復(fù)，置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔3 d記錄孵化的線蟲數(shù)，計算孵化率和相對抑制率。

孵化率(%)=孵化線蟲數(shù)×100/供試卵數(shù)

相對抑制率(%)=(對照孵化率-處理孵化率)×100/對照孵化率

1.4.3 混合寄生真菌發(fā)酵液對SCN J2毒力測定。在24孔細胞培養(yǎng)板中加入線蟲J2(每孔約50條)，每孔加入2 mL混合寄生真菌發(fā)酵液，以空白培養(yǎng)液為對照，每個處理3次重復(fù)，置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在1 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h后記錄線蟲死亡數(shù)量，計算線蟲死亡率。

線蟲死亡率(%)=死亡線蟲數(shù)/供試線蟲數(shù)×100%

1.5 寄生真菌發(fā)酵液對大豆胞囊線蟲防效

試驗設(shè)3種處理：空白對照、接種大豆胞囊線蟲J2、施入混合寄生真菌發(fā)酵液+接種大豆胞囊線蟲J2。選擇室內(nèi)測定結(jié)果中對大豆胞囊線蟲3種蟲態(tài)毒力強的真菌發(fā)酵液4個組合，進行溫室盆栽試驗，接種二齡幼蟲35 d后調(diào)查混合寄生真菌發(fā)酵液對大豆胞囊線蟲的防治效果。

試驗用土取自菜地，經(jīng)分離測定無大豆胞囊線蟲胞囊，土和河沙均過20目孔篩，經(jīng)121 ℃高壓滅菌1 h。將土和沙子按2∶1比例混合，盆中加入300 cm3滅菌沙土?；ㄅ璧讖? cm、口徑10 cm、高8 cm。在溫室內(nèi)無菌蛭石中播種大豆，7 d后每盆移栽豆苗2株，置于溫室中生長，4次重復(fù)。大豆胞囊線蟲J2接種量為1 500條·株-1，混合寄生真菌發(fā)酵液施入量為100 mL[27]。大豆出苗35 d后扣盆，用清水沖洗掉根系土壤，測定大豆株高、大豆地上和根系鮮重。清水沖洗根系后計數(shù)根表大豆胞囊線蟲雌蟲數(shù)量。

大豆根內(nèi)J2、胞囊及卵分離和測定：將新鮮去土的大豆根在-20 ℃冰箱中冷凍24 h，取出室溫下融化，加適量水后在組織搗碎機中搗碎。將溶液轉(zhuǎn)移到套篩網(wǎng)上(80目和500目)，500目篩上物用蔗糖離心法分離[28]，同時將黏在離心管壁和蓋內(nèi)的線蟲進行收集清洗。體式顯微鏡下計數(shù)J2數(shù)量。胞囊及卵分離測定同1.3。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2007和SPSS17.0進行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合寄生真菌發(fā)酵液對胞囊孵化的影響

對大豆胞囊線蟲在混合寄生真菌發(fā)酵液中胞囊孵化結(jié)果調(diào)查表明，16組混合寄生真菌發(fā)酵液均對胞囊孵化具有強烈抑制作用，孵化抑制率在59.1%～87.8%，與對照差異極顯著(P<0.01)，見表2。

表2 混合寄生真菌發(fā)酵液組合的大豆胞囊線蟲胞囊孵化抑制率Table 2 Inhibition rates of SCN cyst hatch in mixed fermentation filtrate

注:數(shù)字后字母為Duucan′S新復(fù)極差測驗結(jié)果，不同英文字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

Note：Means in column followed by the different capital letter(s)indicate significant differences according to the Duucan′S multiple range test at 0.01 level.The same is as below.

其中F-V+P-V+V-21、F-V+P-E+V-25、F-9+P-V+V-25和 F-9+P-E+V-21處理的孵化抑制率均為80%以上，極顯著高于其他處理；F-1+P-40+V-21、F-1+P-1+V-25、F-5+P-1+V-21、F-5+P-V+V-2和F-5+P-E+V-1處理的混合寄生真菌發(fā)酵液的孵化抑制率稍低一些，抑制率在59%～60%。

2.2 混合寄生真菌發(fā)酵液對卵孵化影響

16個混合寄生真菌發(fā)酵液組合均對大豆胞囊線蟲卵孵化均具有顯著抑制作用，處理的卵孵化率在2.3%～4.2%，均極顯著低于空白對照，見表3；卵孵化相對抑制率在72.1%～84.7%。其中F-V+P-V+V-21、F-V+P-E+V-25、F-9+P-V+V-25和F-9+P-E+V-21孵化相對抑制率為81%～85%，顯著高于其他處理(P<0.05)，與胞囊孵化試驗結(jié)果一致，說明對大豆胞囊線蟲的抑制效果穩(wěn)定。

表3 混合寄生真菌發(fā)酵液中大豆胞囊線蟲卵孵化率和相對抑制率Table 3 The SCN egg hatch rates and relative hatch inhibition rates of in mixed fermentation filtrates

注:大寫英文字母表示差異極顯著(P<0.01),小寫英文字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Note：Captial letters mean significant differences at 0.01 level；Small letters mean significant differences at 0.05 level.The same is as below.

2.3 混合寄生真菌發(fā)酵液對J2毒力

試驗結(jié)果表明16組混合寄生真菌發(fā)酵液均對大豆胞囊線蟲二齡幼蟲有致死作用，見圖1?；旌霞纳婢l(fā)酵液對J2的致死作用隨作用時間延長而增強，在1 h就顯現(xiàn)出致死作用，二齡幼蟲死亡率在13%～31%，24 h增至63%以上，48 h增至94%以上，72 h達到了100%。16個處理中對大豆胞囊線蟲二齡幼蟲毒力較強的仍是F-V+P-V+V-21、F-V+P-E+V-25、F-9+P-V+V-25和 F-9+P-E+V-21組合，1 h時4個處理使二齡幼蟲迅速死亡，死亡率25.2%～31.3%，顯著高于其他處理；到24 h時，這4個處理的二齡幼蟲死亡率均高達90%以上；在48 h即達到了100%的二齡幼蟲死亡率，較其他處理提前了24 h。F-V+P-V+V-21、F-V+P-E+V-25、F-9+P-V+V-25和 F-9+P-E+V-21處理與對胞囊和卵的抑制作用非常吻合。

圖1 寄生真菌發(fā)酵液中大豆胞囊線蟲二齡幼蟲死亡率Fig.1 Death rate of SCN J2 in mixed fermentation filtrates

2.4 混合寄生真菌發(fā)酵液對大豆胞囊線蟲防治效果

盆栽試驗結(jié)果顯示，施用混合真菌發(fā)酵液可明顯降低盆內(nèi)線蟲密度，見表4。施用混合真菌發(fā)酵液后，大豆根表雌蟲數(shù)量防效27.9%～40.7%，胞囊數(shù)量防效33.5%～41.2%，卵量防效36.3%～45.3%，根內(nèi)J2數(shù)量防效17.3%～38.3%，其中8號處理(F-9+P-E+V-21)對根表雌蟲、胞囊、卵量和根內(nèi)J2防效均在40%左右，綜合防治效果最為顯著。

表4 混合寄生真菌發(fā)酵液對大豆胞囊線蟲控制效果Table 4 Control effects of mixed parasitic fungal fermentation filtrate on SCN

注(Note)：3：F-V+P-V+V-21；4：F-V+P-E+V-25；7：F-9+P-V+V-25；8：F-9+P-E+V-21

2.5 混合寄生真菌發(fā)酵液對大豆生長發(fā)育的影響

盆栽試驗調(diào)查結(jié)果顯示，接種J2同時施用混合真菌發(fā)酵液與只接種J2處理相比，可增加大豆株高，提高大豆植株鮮重、根重及總鮮重，總鮮重增加范圍在17.9%～26.9%?；旌险婢l(fā)酵液4個處理組合中，以8號(F-9+P-E+V-21)發(fā)酵液對大豆生長影響較為明顯，但不同混合發(fā)酵液組合間差異不顯著；除3號處理(F-V+P-V+V-21)外，4號、7號和8號施用混合發(fā)酵液處理的株高均顯著高于只接種J2對照的株高；在只施用混合發(fā)酵液處理中，大豆植株總鮮重是8.1～8.7 g，植株高度范圍在25.4～26.0 cm，均與不施用混合發(fā)酵液對照(CK)差異不顯著(P>0.05)(表5)，說明4個處理均未對大豆生長造成負面影響。

表5 混合寄生真菌發(fā)酵液對大豆生長發(fā)育的影響Table 5 Effects of mixed parasitic fungal fermentation filtration on the growth and development of soybean

注(Note)：3：F-V+P-V+V-21；4：F-V+P-E+V-25；7：F-9+P-V+V-25；8：F-9+P-E+V-21

3 結(jié)論和討論

本研究發(fā)現(xiàn)，淡紫擬青霉菌、厚垣輪枝菌和鐮孢菌的混合寄生真菌發(fā)酵液，可顯著降低盆栽中大豆胞囊線蟲各種蟲態(tài)的數(shù)量，對二齡幼蟲具有致死毒性，對SCN有顯著的抑制作用。而且，篩選出的4個組合不僅對大豆胞囊線蟲離體毒力強，而且對土壤中大豆胞囊線蟲的防控具有穩(wěn)定的效果。

淡紫擬青霉菌、厚垣輪枝菌和鐮孢菌這3種真菌在大豆田中普遍存在，尤其在長期連作大豆田中[14]。有研究認為大豆胞囊線蟲寄生真菌可產(chǎn)生酶類物質(zhì)、毒素及對線蟲有毒害的其他次生代謝物質(zhì)[29]。不同真菌產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物，殺線活性也不盡相同，而且不同的大豆胞囊線蟲寄生真菌都有其獨特的作用方式和機制。林茂松等[30]發(fā)現(xiàn)，淡紫擬青霉菌培養(yǎng)濾液的代謝產(chǎn)物的生理活性物質(zhì)存在于蛋白組分中。此外，淡紫擬青霉菌能夠產(chǎn)生代謝物乙酸，該菌可寄生線蟲的卵而影響幼蟲生長發(fā)育，致使線蟲在胚胎中產(chǎn)生氣泡，從而使線蟲造成畸形或停止發(fā)育，甚至麻痹而死[22]。厚垣輪枝菌也可寄生在大豆胞囊線蟲的各蟲態(tài)中，對控制田間植物寄生線蟲種群密度起著重要的作用，也是歐洲燕麥胞囊線蟲衰退的主要原因[5]。也有報道輪枝菌產(chǎn)生一些替代物會導(dǎo)致南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)卵表面收縮并無活力，說明有幾丁質(zhì)降解酶或者一些其他活性物質(zhì)的產(chǎn)生[31]。Chen等[32]報道在線蟲胞囊上分離的茄腐鐮孢菌(Fusariumsolani)的發(fā)酵液對二齡幼蟲具有毒力。本研究采用這些大豆胞囊線蟲寄生真菌代謝物混合，可充分發(fā)揮單個寄生真菌的作用，從不同作用方式對大豆胞囊線蟲進行抑制。室內(nèi)試驗中F-V+P-V+V-21、F-V+P-E+V-25、F-9+P-V+V-25和 F-9+P-E+V-21組合對大豆胞囊線蟲的胞囊、卵孵化抑制和對J2的致死作用非常一致，說明這些組合作用穩(wěn)定，此4組混合菌液對大豆胞囊線蟲的作用都很強。而且，發(fā)酵液可促進大豆生長，降低其對大豆生長發(fā)育造成的危害，室內(nèi)抑制作用與土壤中施用效果反應(yīng)一致。因此，應(yīng)用不同生物活性的發(fā)酵液組成混合制劑能提高其環(huán)境適應(yīng)性而加強對線蟲的防治效果，值得進一步應(yīng)用開發(fā)。

目前對大豆胞囊線蟲生物防治的研究多集中在實驗室條件下對線蟲的抑制作用及某種真菌活體菌劑的應(yīng)用，而發(fā)酵液對線蟲作用更直接迅速，對發(fā)酵液制備技術(shù)的研發(fā)和多種生防菌混合發(fā)酵液的開發(fā)需深入探討。應(yīng)用生防菌劑防治大豆胞囊線蟲等土傳病害，關(guān)鍵在于作物根際的生態(tài)環(huán)境，該微環(huán)境非常復(fù)雜，作物根際-線蟲-真菌相互關(guān)系、土壤溫濕度、pH、作物殘體、其它微生物的代謝產(chǎn)物、除草劑和農(nóng)藥等化學(xué)物質(zhì)的干擾，都會影響到生防真菌在田間應(yīng)用過程中防效的穩(wěn)定性，今后應(yīng)加強這些方面的研究。

致 謝

中國科學(xué)院“十三五”信息化專項科學(xué)大數(shù)據(jù)工程項目(XXH13505-07)。

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