侯敏娜，何莉，郭颯

(陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046)

基金項(xiàng)目：2016年陜西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(No.2961)

作者簡(jiǎn)介：侯敏娜(1981-)，女，碩士研究生，講師，主要研究方向：中草藥中活性物質(zhì)研究。

收稿日期：2017-04-06

修回日期：2017-05-01

益母草(LeonurusjaponicusHoutt)是唇形科益母草屬1年生或2年生草本植物，其藥用部位多為益母草新鮮或干燥的地上部分，又稱(chēng)“莞蔚”。被歷代醫(yī)家譽(yù)為“血家圣藥”“經(jīng)產(chǎn)良藥”，是治療婦科疾病之要藥。《本草綱目》云:“益母草行經(jīng)養(yǎng)血，行血而不傷血，養(yǎng)血而不瘀血，誠(chéng)為血家之圣藥也。”活性成分主要有總生物堿，包括益母草堿和水蘇堿等，具有活血調(diào)經(jīng)、利尿消腫、抗炎鎮(zhèn)痛等多種生理活性[1-5]。益母草作為一種傳統(tǒng)的中藥，臨床應(yīng)用廣泛，但存在提取物中的活性成分含量低，藥材及制劑有效成分差異顯著。本次研究意在加快中藥現(xiàn)代化進(jìn)程，提高益母草資源利用效率，探索更先進(jìn)的提取工藝，使益母草劑型多樣化，充分利用益母草這一生物資源，現(xiàn)將研究情況報(bào)告如下。

1 材料

1.1 試劑及藥材

益母草(自行收集于陜西延安，經(jīng)我院生藥教研室雷國(guó)蓮教授鑒定為益母草正品)；雷氏銨鹽(北京華科盛精細(xì)化工產(chǎn)品貿(mào)易有限公司)；95%乙醇(天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠)；丙酮(天津市鼎盛鑫化工有限公司)；鹽酸(西安三浦化學(xué)試劑有限公司)；水為純化水；其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

TU-1810紫外分光光度計(jì)(上海長(zhǎng)城制造有限公司)；KQ5200DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HH-2電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；FW100粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。

2 方法

2.1 益母草中生物堿的含量測(cè)定方法

本實(shí)驗(yàn)采用雷氏鹽比色法進(jìn)行測(cè)定[6-7]。原理是利用雷氏鹽在酸性介質(zhì)中可與大部分生物堿生成難溶于水的絡(luò)合物，將生物堿的硫氰酸鉻銨鹽沉淀溶于丙酮中,所得到的紫紅色溶液在波長(zhǎng)為510 nm處有最大吸收,可利用公式(1)。

W=A·M·V/ε

(1)

其中，M表示益母草中含量較多的水蘇堿鹽酸鹽(C7H13NO2·HCl)，相對(duì)分子質(zhì)量為179.63；ε表示硫氰酸鉻銨在丙酮中的克分子吸收系數(shù)，為106.5；V表示溶解沉淀所取丙酮的毫升數(shù)，為10 ml；測(cè)其吸光度A,經(jīng)計(jì)算可得到生物堿的含量W(mg)，得率Y可由公式(2)計(jì)算。

(2)

2.2 含量測(cè)定[8-11]

準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)干燥、粉碎、過(guò)80目篩的益母草粉10.0 g，加入一定濃度的適量0.5%鹽酸乙醇溶液,進(jìn)行超聲提取，過(guò)濾,濾液水浴蒸干，加入0.1 mol/L HCl溶解,過(guò)濾,用等濃度的5 ml HCl洗滌,定容于25 ml容量瓶中。移取6 ml于錐形瓶中,加入0.1 mol/L HCl 6 ml,緩慢滴加新配制的2%雷氏銨鹽溶液6 mL，置冰箱中過(guò)夜,抽濾,沉淀用10 ml冷水洗滌至溶液無(wú)色,抽干。沉淀加丙酮溶解并定容于10 ml容量瓶中,以丙酮為空白,在最大吸收波長(zhǎng)為510 nm處測(cè)定吸光度,代入公式(1)、(2)中計(jì)算,可得到益母草中總生物堿的得率。

2.3 單因素考察

超聲波輔助提取益母草中生物堿的影響因素主要包括超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率、料液比、乙醇濃度、pH值等。本次研究考察超聲時(shí)間、乙醇濃度和料液比這三個(gè)因素。

2.3.1 乙醇濃度對(duì)益母草中生物堿得率的影響

稱(chēng)取干燥、粉碎、過(guò)80目篩的益母草粉5份，每份10 g，置于250 ml錐形瓶中，依次加入200 ml濃度為50%、60%、70%、80%、90%的0.5%鹽酸乙醇溶液，進(jìn)行超聲提取，超聲功率為180 W，超聲溫度為40℃，超聲時(shí)間為30 min?？疾煲掖紳舛葘?duì)益母草生物堿得率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇濃度對(duì)益母草生物堿得率的影響

由圖1可知，益母草生物堿的得率，隨著乙醇濃度的增加，不斷增大。當(dāng)乙醇濃度大于70%時(shí)得率也在繼續(xù)增加，但增加的幅度很小。所以，考慮到節(jié)省溶劑資源等原因，我們選取70%乙醇作為益母草生物堿乙醇提取的溶劑濃度。

2.3.2 料液比對(duì)益母草中生物堿得率的影響

稱(chēng)取干燥、粉碎、過(guò)80目篩的益母草粉5份，每份10 g，分別加入70%的0.5%鹽酸乙醇溶液140 ml、160 ml、180 ml、200 ml、220 ml，進(jìn)行超聲提取，超聲功率定為180 W，超聲溫度為40℃，超聲時(shí)間為30 min?？疾炝弦罕葘?duì)益母草生物堿得率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)益母草生物堿得率的影響

由圖2可知，益母草生物堿得率隨著料液比的增加呈不斷增大趨勢(shì)。當(dāng)達(dá)到18 BV時(shí)得率也在繼續(xù)增加，但增加的幅度很小。所以，綜合考慮各方面原因，選取料液比為18 BV，作為益母草生物堿乙醇提取的溶劑用量。

2.3.3 超聲時(shí)間對(duì)益母草中生物堿得率的影響

稱(chēng)取干燥、粉碎、過(guò)80目篩的益母草粉5份，每份10 g，分別加入70%的0.5%鹽酸乙醇180 ml，進(jìn)行超聲提取，超聲功率為180 W，超聲溫度為40℃，超聲時(shí)間分別為30 min、35 min、40 min、45 min、50 min?？疾斐晻r(shí)間對(duì)益母草生物堿得率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)益母草生物堿得率的影響

由圖3可知，在30～50 min內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，得率也增加，但時(shí)間超過(guò)40 min后，隨著時(shí)間繼續(xù)增加，得率開(kāi)始逐漸降低，表明益母草生物堿得率并不會(huì)隨著時(shí)間的增加而無(wú)限增加，而在40 min時(shí)達(dá)到最高值。

2.4 響應(yīng)曲面優(yōu)化

2.4.1 響應(yīng)曲面優(yōu)選分析

在單因素的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)因素水平表1，按照響應(yīng)曲面Box-Behnken的設(shè)計(jì)原理，共有17組實(shí)驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1～2。

表1 因素水平表

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)該模型進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方差分析表

注：*P<0.05顯著;**P<0.01高度顯著;***P<0.001極其顯著

通過(guò)Design-Expert8.0.6軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到益母草生物堿得率對(duì)乙醇濃度(A)，提取時(shí)間(B)，料液比(C)的二次多元回歸方程。

得率：

Y=-2.503 13+0.013 475A+0.047 775B+0.135 69C+2.500 0E-005AB-8.750 00E-005AC-1.500 00E-004BC-8.750 00E-005A2-5.800 00E-004B2-3.375 00E-003C2

對(duì)該模型數(shù)據(jù)，進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，模型P值(<0.000 1)及F值(119.70>0.05)，說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)選用的二次多項(xiàng)式模型極為顯著。同時(shí)失擬項(xiàng)F=0.317 7>0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，可以對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)，實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)合理正確。

2.4.2 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用Design-Expert 8.0.6軟件，繪制相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖及等高線圖，見(jiàn)圖4、圖5、圖6。

圖4 乙醇濃度與超聲時(shí)間的三維圖和等高線

圖4為乙醇濃度與超聲時(shí)間對(duì)益母草中總生物堿得率的響應(yīng)曲面圖，由圖4可以看出，當(dāng)料液比一定時(shí)，益母草中總生物堿得率隨著乙醇濃度增加呈增加趨勢(shì)，但達(dá)到70%時(shí)，坡面增加的幅度較緩；超聲時(shí)間不斷延長(zhǎng)，得率也在上升，但是在40 min后，呈下降趨勢(shì)，且整個(gè)坡度比乙醇濃度的坡面要陡，說(shuō)明得率受超聲時(shí)間二次項(xiàng)的影響比乙醇濃度大。由圖4可以確定最佳參數(shù)范圍：乙醇濃度72%～76%，超聲時(shí)間38～42 min。在此范圍內(nèi)益母草中總生物堿得率最大。

圖5 乙醇濃度和料液比的三維圖和等高線

圖5為料液比和乙醇濃度對(duì)益母草中總生物堿得率的響應(yīng)曲面圖，由圖5可以看出料液比的坡面比乙醇濃度的坡面陡，表明料液比的二次項(xiàng)對(duì)益母草中總生物堿得率具有明顯影響，而乙醇濃度對(duì)其影響較小。由圖5可以確定兩因素最佳參數(shù)范圍：乙醇濃度72%～76%，料液比為1∶17～1∶19。在此范圍內(nèi)的益母草中總生物堿得率最大。

圖6 料液比與超聲時(shí)間的三維圖和等高線

圖6為料液比與超聲時(shí)間對(duì)益母草中總生物堿得率的響應(yīng)曲面圖，由圖6可以看出料液比與超聲時(shí)間的坡面都比較陡，說(shuō)明他們的二次項(xiàng)對(duì)益母草中總生物堿得率的影響都比較顯著，等高線趨于橢圓，說(shuō)明超聲時(shí)間與料液比的交互項(xiàng)對(duì)益母草中總生物堿得率的影響顯著。由圖6可以確定兩因素的最佳參數(shù)范圍：料液比1∶17～1∶19，超聲時(shí)間38～42 min。

由此可知，優(yōu)選的益母草中總生物堿提取工藝為：料液比為1∶18.25，提取時(shí)間為40.14 min，乙醇濃度為73.63%，在此條件下，益母草中總生物堿預(yù)測(cè)值為0.196 53%。綜合考慮各方面因素，將實(shí)驗(yàn)參數(shù)修正為：料液比為1∶18，提取時(shí)間為40 min，乙醇濃度為74%，平行3次實(shí)驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算平均得率為0.195 27%，與理論值相差0.001 26%。因此，本方法確定的益母草中總生物堿提取工藝參數(shù)可靠，并且有一定的實(shí)際參考價(jià)值。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用響應(yīng)曲面法，優(yōu)化益母草中總生物堿的超聲提取工藝參數(shù)，經(jīng)綜合考慮修正，最終優(yōu)化條件為：料液比為1:18，提取時(shí)間為40 min，乙醇濃度為74%，此時(shí)益母草中總生物堿得率為0.195 27%。通過(guò)回歸分析及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，證明了該響應(yīng)面法的合理性、可行性，可為益母草資源的開(kāi)發(fā)及合理利用提供依據(jù)。

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