郝玉林，楊文龍，侯偉欣，田甜，張秋云，高連印，杜宇瓊

(首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

慢加急性肝衰竭是在慢性肝病基礎(chǔ)上發(fā)生的急性肝功能失代償[1]，具有病情重、進(jìn)展迅速、并發(fā)癥多等特點(diǎn)。目前臨床上主要采用抗病毒、人工肝支持療法、肝移植等治療手段，但治療效果并不理想[2]。肝細(xì)胞的異常凋亡是肝衰竭的重要發(fā)病機(jī)制，而肝衰竭的發(fā)生與肝細(xì)胞增殖障礙也有密切關(guān)系。截?cái)嗄嫱旆绞清X英教授治療慢加急性肝衰竭的一個有效經(jīng)驗(yàn)方，課題組前期臨床研究結(jié)果證實(shí)了其有效性[3]。前期課題組實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,“截?cái)嗄嫱旆健睂CLF模型大鼠肝功能、肝組織都有一定的保護(hù)作用，并能減輕肝組織炎性損傷和肝細(xì)胞凋亡[4-10]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察截?cái)嗄嫱旆綄CLF大鼠肝細(xì)胞增殖過程中關(guān)鍵基因CyclinD1、CyclinA、CDK4及關(guān)鍵蛋白DP1表達(dá)量的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證該方通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞增殖預(yù)防性干預(yù)ACLF大鼠的作用機(jī)制，繼續(xù)為臨床應(yīng)用該方提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

Wistar雄性大鼠150只，SPF級，體質(zhì)量180～200 g，于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司采購，合格證號：SCXK(京)2012-0001。首都醫(yī)科大學(xué)動物房飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室合格證號：SYXK(京)2005-0022。每籠3只，自由飲食，室溫18～23℃，濕度(50.0±2.0)%，每隔12 h開燈照明。

1.2 主要試劑

人血清白蛋白(HSA)(Sigma，A9731-5G)；D-氨基半乳糖(D-GalN)(Sigma，G0500-25G)；脂多糖(LPS)(Sigma，109K4075)；Anti-DP1(Santa);RNA Prep Pure 動物組織總RNA提取試劑盒(離心柱型)(DP431)，TIAN Script cDNA第一鏈合成試劑盒(KP104)，Real Master Mix(SYBR Green)試劑盒(FP204)，2×Taq PCR Master Mix(KT201-01)，50bpDNA Ladder(MD108)，MarkⅢ(MD103)，Gene Green 核酸染料(RT210)均購自天根生化科技有限公司。

1.3 藥物

截?cái)嗄嫱旆?苦味葉下珠30 g、瓜蔞30 g、金錢草30 g、生黃芪30 g、槲寄生30 g、三七6 g、莪術(shù)6 g、丹參20 g、生地黃20 g、黑附片15 g)，藥材購自北京同仁堂中醫(yī)醫(yī)院中藥房，濃煎成4.34 g/ml，4℃保存，使用前水浴加熱。

1.4 主要儀器

1-14高速離心機(jī)(Sigma)；Universal 320R低溫離心機(jī)(Hettich)； F6/10超細(xì)勻漿器(Fluko)；EG720EAU-SS微波爐(美的)；Model680酶標(biāo)儀(Bio-Rad)；165-8003s水平電泳儀(Bio-Rad)；170-3930濕轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad)；Odysseey2.1紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(LI-COR)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 ACLF大鼠模型的建立

參照劉旭華[11]造模方法，ACLF大鼠模型建立方法分為兩個階段。1)肝硬化模型階段：Wistar雄性大鼠150只，隨機(jī)分為正常對照組10只和處理組140只，處理組皮下注射人血清白蛋白致敏，檢測人血白蛋白抗體是否陽性，取陽性大鼠繼續(xù)尾靜脈注射人血清白蛋白，每次0.5 ml/只，正常組大鼠注射等量生理鹽水，6周后對全部大鼠行肝活檢，按肝纖維化6級法判斷肝硬化程度。取肝纖維化三級以上大鼠繼續(xù)尾靜脈注射2周，造模成功98只，將98只成模大鼠隨機(jī)(采用random函數(shù)生成隨機(jī)序號)分為模型組、中藥組各49只。2)慢加急肝衰竭模型階段：模型組、中藥組同時給予D-GalN 400 mg/kg聯(lián)合LPS 100 μg/kg腹腔注射進(jìn)行急性攻擊，建立ACLF模型。

2.2 分組與給藥方法

急性攻擊前，中藥組根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)得出的有效劑量[4]給予生藥量為21.7 g/(kg·d)的截?cái)嗄嫱旆?，濃度?.34 g/mL連續(xù)灌胃3天，正常組及模型組給予同等劑量生理鹽水灌胃。各組大鼠分別于急性攻擊4 h、8 h、12 h后進(jìn)行平行取材，每組每個時間點(diǎn)14只。另外模型、中藥各設(shè)24 h生存組各7只。大鼠麻醉后腹主動脈取血，摘取肝右葉同一部分置于10%福爾馬林溶液固定，余下部分于液氮中快速凍存。

2.3 Western Blot法檢測肝組織中DP1蛋白的表達(dá)量

于-80℃冰箱取出凍存肝組織，每組每個時間點(diǎn)取6只進(jìn)行勻漿、蛋白定量，按照蛋白定量試劑盒說明書步驟測定蛋白濃度。每支上樣蛋白84 μg，經(jīng)10% SDS-聚丙烯凝膠電泳分離后300 mA電轉(zhuǎn)1 h至0.22 μm NC膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，DP1抗體(1∶100)4℃孵育過夜，TBST洗滌，加二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h。暗室曝光，將膠片進(jìn)行掃描，以β-actin作為參照蛋白，用Quantity One圖像分析軟件分析目標(biāo)條帶的光密度值，通過灰度比較的方法來確定目的蛋白相對于內(nèi)參的表達(dá)量，以分析樣本之間目的蛋白表達(dá)量差異。

2.4 實(shí)時熒光定量法檢測CyclinD1、CDK4、CyclinA mRNA的表達(dá)量

根據(jù)RNA Pre Pure 動物組織總RNA提取試劑盒的說明提取總RNA。用Model680酶標(biāo)儀檢測總RNA的濃度和純度，取A260/A280在1.8～2.2的RNA樣品做下一步實(shí)驗(yàn)，利用2%瓊脂糖凝膠檢測其完整性。根據(jù)TIAN Script cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。引物采用TaKaRa公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見表1；擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 sec，54℃退火10 sec，72℃延伸10 sec，共循環(huán)40次，4℃保存。以基因β-actin為內(nèi)參對照，用2-△△Ct(Ct代表循環(huán)閾值)表示CyclinD1、CDK4、CyclinA mRNA相對表達(dá)量。

表1 引物序列

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 24 h生存率觀察

觀察模型組、截?cái)嗄嫱旆浇M急性攻擊后24 h組存活率發(fā)現(xiàn)，模型組急性攻擊后24 h內(nèi)7只存活2只，存活率為28%。截?cái)嗄嫱旆浇M7只存活4只，存活率為57%，模型組低于截?cái)嗄嫱旆浇M，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。截?cái)嗄嫱旆酱婊顣r間長于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠生存時間比較

注：與模型組比較，*P<0.05

3.2 截?cái)嗄嫱旆綄CLF大鼠肝組織DP1蛋白表達(dá)的影響

如表3所示，與正常組相比，模型4 h組DP1蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并呈逐漸降低趨勢，至12 h表達(dá)最少，但仍較正常組略高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與4 h、8 h模型組相比，截?cái)嗄嫱旆浇M蛋白表達(dá)有升高趨勢，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而至12 h末表達(dá)量明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見圖1～2。

表3 各組大鼠DP1表達(dá)IOD值比較

注：與同一時間點(diǎn)模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖1 各組大鼠肝組織DP1蛋白表達(dá)量比較 注：與同一時間點(diǎn)模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖2 各組大鼠肝組織DP1蛋白表達(dá)免疫印跡電泳圖 注：A：截?cái)嗄嫱旆? h組；B：截?cái)嗄嫱旆?8 h組；C：截?cái)嗄嫱旆?2 h組；D：正常組；E：模型4 h組；F：模型8 h組；G：模型12 h組

3.3 截?cái)嗄嫱旆綄CLF大鼠肝組織CyclinD1 mRNA表達(dá)的影響

如表4所示，與正常組相比，模型4 h CyclinD1 mRNA表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型8 h、12 h表達(dá)量雖高于正常組，但相對于4 h逐漸降低。與模型組相比，截?cái)嗄嫱旆浇M4 h CyclinD1 mRNA表達(dá)量差異不大，8 h較模型組升高，12 h時截?cái)嗄嫱旆浇M表達(dá)量明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。截?cái)嗄嫱旆浇MCyclinD1 mRNA表達(dá)量在8 h降低，在12 h明顯增高。結(jié)果見圖3。

表4 各組大鼠CyclinD1 mRNA表達(dá)量的比較

注：與同一時間點(diǎn)模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖3 各組大鼠肝組織中Cyclin D1表達(dá)量比較注：與同一時間點(diǎn)模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.4 截?cái)嗄嫱旆綄CLF大鼠肝組織CDK4 mRNA表達(dá)的影響

如表5所示，與正常組相比，模型組4 h、8 h CDK4 mRNA表達(dá)量升高，12 h時有所降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且模型組隨著時間的推移，表達(dá)量逐漸降低。與模型組相比，截?cái)嗄嫱旆浇M4 h、8 h CDK4 mRNA 表達(dá)量有所升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。12 h時截?cái)嗄嫱旆浇MCDK4 mRNA表達(dá)量明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見圖4。

表5 各組大鼠CDK4 mRNA表達(dá)量的比較

注：與同一時間點(diǎn)模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖4 各組大鼠肝組織中CDK4 mRNA表達(dá)量比較注：與同一時間點(diǎn)模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.5 截?cái)嗄嫱旆綄CLF大鼠肝組織CyclinA mRNA表達(dá)的影響

如表6所示，與正常組相比，模型4 h CyclinA mRNA表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型8 h、12 h表達(dá)量雖高于正常組，但相對于4 h逐漸降低。與模型組相比，截?cái)嗄嫱旆浇M4 h CyclinA mRNA表達(dá)量差異不大，8 h較模型組升高，12 h時截?cái)嗄嫱旆浇M表達(dá)量明顯高于模型組(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。截?cái)嗄嫱旆浇MCyclinA mRNA表達(dá)量在8 h降低，在12 h明顯增高。見圖5。

表6 各組大鼠CyclinA mRNA表達(dá)量的比較

注：與同一時間點(diǎn)模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖5 各組大鼠肝組織中CyclinA mRNA表達(dá)量比較注：與同一時間點(diǎn)模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01

4 討論

ACLF的發(fā)生是在多種因素作用下，引起大量肝細(xì)胞過度死亡的結(jié)果。其發(fā)生機(jī)制，除肝細(xì)胞死亡外，肝細(xì)胞的異常凋亡在肝衰竭過程中起著重要作用，而肝細(xì)胞的凋亡又可誘導(dǎo)肝細(xì)胞的代償性增殖[12-13]，如果肝細(xì)胞過度凋亡，而肝細(xì)胞代償性增殖又障礙，則必然導(dǎo)致肝衰竭。

正常情況下，肝細(xì)胞為暫不增殖細(xì)胞群，即G0期，在肝細(xì)胞大量凋亡的刺激作用下，肝細(xì)胞可迅速重新進(jìn)入細(xì)胞周期，產(chǎn)生增殖再生。E2F1調(diào)控細(xì)胞周期的作用,主要受視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,pRB)的調(diào)控，E2F1與pRb一起參與調(diào)控細(xì)胞由G0/G1期向S期的過度。CyclinD1、CDK4、CyclinA和DP1是E2F1介導(dǎo)的細(xì)胞增殖途徑的關(guān)鍵蛋白，CyclinD1與細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(CDKs)CDK4/6結(jié)合, CDK4/6被激活, CDK4/6-Cyclin D復(fù)合物與其底物pRb作用，pRb被磷酸化，破壞E2F1-DP1-pRb復(fù)合物，使DP1被釋放出來，正反調(diào)節(jié)某些基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生細(xì)胞進(jìn)入S期的必需的蛋白產(chǎn)物，如Cyclin A、Cyclin E、Cdc25等[14]。在本試驗(yàn)中，模型4 h組的肝組織中CyclinD1、CDK4、CyclinA及DP1的表達(dá)量均顯著高于正常組，推測這是由于肝細(xì)胞大量凋亡，刺激肝細(xì)胞增殖相關(guān)通路，上調(diào)了CyclinD1、CDK4、CyclinA及DP1的表達(dá)量。隨著時間的推移，模型組CyclinD1、CDK4、CyclinA及DP1表達(dá)量逐漸降低?？梢?，隨著時間的推移模型組的肝細(xì)胞增殖活動呈下降趨勢，實(shí)驗(yàn)前期結(jié)果顯示，隨著時間推移，大鼠肝細(xì)胞凋亡逐漸增多，直至肝細(xì)胞大面積凋亡、壞死[5-10]，此時細(xì)胞增殖不足于代償肝細(xì)胞過度凋亡、死亡，必然導(dǎo)致肝衰竭。進(jìn)一步對模型組和截?cái)嗄嫱旆浇M進(jìn)行分析比較，結(jié)果顯示,截?cái)嗄嫱旆? h組CyclinD1、CDK4、CyclinA及DP1表達(dá)量與模型組比較無明顯差異，8 h組CyclinD1、CDK4、CyclinA及DP1表達(dá)量與模型組比較有升高趨勢，12 h 組CyclinD1、CDK4、CyclinA及DP1表達(dá)量較模型組明顯升高(P<0.01)，說明截?cái)嗄嫱旆筋A(yù)防干預(yù)，可以通過調(diào)節(jié)E2F1信號通路CyclinD1、CDK4、CyclinA及DP1表達(dá)量，促進(jìn)肝細(xì)胞的代償性增殖，其作用在攻擊后4 h尚不明顯，8 h已有體現(xiàn)，至12 h已有明顯體現(xiàn)；既往研究結(jié)果提示,截?cái)嗄嫱旆? h組和12 h組肝細(xì)胞凋亡明顯減弱[5-10]。如此，增殖提升，凋亡減弱，肝功能得到較好的代償，則可以改善肝衰竭，避免最終走向死亡的不良結(jié)局。如果后續(xù)繼續(xù)給與截?cái)嗄嫱旆街委?，推測其在提高肝細(xì)胞增殖，減少凋亡，抑制肝衰竭方面能取得更好的療效。

截?cái)嗄嫱旆绞菄颐现嗅t(yī)錢英教授臨床治療慢性重型肝炎的經(jīng)驗(yàn)方，其主要功效為解毒化瘀，扶助正氣。慢加急性肝衰竭的主要病因?yàn)闈駸嵋叨緭p傷肝絡(luò)，阻遏氣機(jī)，氣機(jī)受阻，則血行不暢，久而化瘀，瘀久化熱，進(jìn)而暗耗營血，血傷則氣亦傷，從而形成毒瘀膠著，正氣虧虛的病機(jī)，與截?cái)嗄嫱旆讲C(jī)相符，其中苦味葉下珠、瓜蔞、金錢草、莪術(shù)、丹參清熱解毒化瘀，祛除實(shí)邪，減少對正氣的損害；生黃芪、槲寄生、三七、生地黃、黑附片扶助正氣，祛邪與扶正共同作用增強(qiáng)，使細(xì)胞增殖活動加強(qiáng)，達(dá)到減緩肝衰竭進(jìn)程的目的。

綜上所述，截?cái)嗄嫱旆娇捎行У难娱L大鼠存活時間，并能通過調(diào)節(jié)E2F1肝細(xì)胞增殖信號通路CyclinD1、CDK4、CyclinA及DP1表達(dá)量，促進(jìn)了肝細(xì)胞的代償性增殖，從而改善肝細(xì)胞的大面積壞死，抑制肝衰竭。

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