馮冠潮

摘要：本項(xiàng)目通過(guò)單光子計(jì)數(shù)器對(duì)水稻真菌病害孢子活性進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)使用微流控芯片配合單光子計(jì)數(shù)器簡(jiǎn)化原有檢測(cè)過(guò)程，縮短檢測(cè)周期，達(dá)到對(duì)于水稻病害包子的早期及時(shí)預(yù)測(cè)，具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和項(xiàng)目前景

關(guān)鍵詞：水稻真菌病害；單光子計(jì)數(shù)；縮短檢測(cè)周期

稻作為世界主要糧食作物之一。中國(guó)水稻播種面占全國(guó)糧食作物的1/3，而稻谷產(chǎn)量則糧食總產(chǎn)量的45%，同時(shí)我國(guó)65%以上的人口以大米為主食。水稻的產(chǎn)量又與水稻病害息息相關(guān)，稻瘟病、紋枯病和白葉枯病并稱(chēng)水稻三大病害，每年對(duì)水稻生產(chǎn)造成巨大損失，其中稻瘟病、紋枯病都是由真菌引起。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在現(xiàn)有防治水平下，全國(guó)平均每年水稻因水稻病害引起的減產(chǎn)達(dá)400-500萬(wàn)噸，所以對(duì)由真菌引起的水稻病害的孢子檢測(cè)與預(yù)防工作刻不容緩。

針對(duì)上述水稻病害即稻瘟病、紋枯病，研究表明，這兩種病害都是由真菌引起，同時(shí)孢子傳播途徑都是空氣傳播。因此，對(duì)這兩類(lèi)病害的最佳檢測(cè)手段就是對(duì)植株周邊空氣中致病孢子的濃度和活性進(jìn)行檢測(cè)?，F(xiàn)階段，對(duì)植物取樣孢子活性的傳統(tǒng)檢測(cè)需要先將取得的樣品進(jìn)行殺菌純化后經(jīng)行培養(yǎng)，如點(diǎn)植法、稀釋平板計(jì)數(shù)法等，然后通過(guò)化學(xué)染色法如亞甲基藍(lán)[8]或通過(guò)熒光素二乙酸酯等進(jìn)行染色，再進(jìn)行如直接顯微鏡記數(shù)法、最近似數(shù)測(cè)定法等進(jìn)行計(jì)數(shù)測(cè)量得到孢子活性。這類(lèi)方法雖然實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單，成本低廉，對(duì)設(shè)備要求較低，但是測(cè)量周期較長(zhǎng)，無(wú)法對(duì)水稻病害進(jìn)行早期檢測(cè)和預(yù)防。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)免疫學(xué)和基因技術(shù)的發(fā)展，對(duì)孢子活性的檢測(cè)也產(chǎn)生了很多多樣化的手段，如多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、直接表面熒光濾膜計(jì)數(shù)技術(shù)（DEFT）等[4，8]。由于水稻致病真菌的氣傳孢子具有濃度極低，孢子尺寸極小且樣本中雜菌、雜質(zhì)含量高的特，點(diǎn)現(xiàn)有檢測(cè)手段雖然可以準(zhǔn)確測(cè)定孢子個(gè)體數(shù)量變化，但是由于檢測(cè)試劑如底物、輔酶的限制，對(duì)被測(cè)對(duì)象存在檢測(cè)的盲目性和滯后性。而且為了提高檢測(cè)結(jié)果，避免外界干擾，需要嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，導(dǎo)致較高的設(shè)備需求和檢測(cè)成本。

光子計(jì)數(shù)器（PMT）是一種基于直接探測(cè)量子限理論的極微弱光脈沖檢測(cè)設(shè)備。它利用光電倍增管的單光子檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)對(duì)電子計(jì)數(shù)器鑒別并測(cè)量單位時(shí)間內(nèi)的光子數(shù)，從而檢測(cè)離散微弱光脈沖信號(hào)功率[6]（見(jiàn)圖2）。由于光子計(jì)數(shù)器對(duì)微弱光照的敏感性，目前國(guó)內(nèi)外單光子計(jì)數(shù)法在微弱熒光生物測(cè)量方面有著較為廣泛運(yùn)用，如通過(guò)基于時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)法測(cè)量生物組織光學(xué)參數(shù)[5]（見(jiàn)圖3）利用時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)法測(cè)量人體癌細(xì)胞的熒光光譜特性[10，11]。但是，目前的國(guó)內(nèi)單光子計(jì)數(shù)器對(duì)于孢子活性的熒光檢測(cè)方面研究尚存較大空白，首先并無(wú)可以直接進(jìn)行檢測(cè)的針對(duì)性裝備，其次亦無(wú)對(duì)熒光強(qiáng)度與孢子活性間適配的數(shù)學(xué)模型。而且現(xiàn)存對(duì)其他對(duì)象的檢測(cè)方案對(duì)待測(cè)樣本的要求較高，需要經(jīng)過(guò)一定的預(yù)處理過(guò)程，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有較高要求；同時(shí)檢測(cè)方案多為通過(guò)光子的散射和反射來(lái)間接測(cè)量樣本，后期數(shù)據(jù)處理過(guò)程較為復(fù)雜，計(jì)算量大。

本項(xiàng)目擬采用以下技術(shù)思路，技術(shù)路線如圖所示：

光傳孢子的特性以及分布模型選擇合適的微流控材料并設(shè)計(jì)特定的微流控芯片，設(shè)計(jì)并構(gòu)建光學(xué)通路，并創(chuàng)建基于單光子計(jì)數(shù)器的熒光檢測(cè)平臺(tái)，用熒光檢測(cè)平臺(tái)對(duì)目標(biāo)孢子進(jìn)行熒光檢測(cè)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)合已有文獻(xiàn)資料建立數(shù)學(xué)模型，并用該數(shù)學(xué)模型進(jìn)行軟件仿真以求復(fù)現(xiàn)數(shù)據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)主要研究?jī)?nèi)容：

（1）、解決微流控芯片芯片對(duì)于氣傳孢子的純化、富集問(wèn)題，尋找合適的對(duì)水稻氣傳孢子具有靶向檢測(cè)效果的熒光試劑；

（2）、解決單光子計(jì)數(shù)裝置與微流控芯片光學(xué)耦合的問(wèn)題；

（3）、解決病害種類(lèi)及程度與熒光光子吸收量間的模型關(guān)系問(wèn)題；

平臺(tái)創(chuàng)建構(gòu)思：

（1）、解決微流控芯片芯片對(duì)于氣傳孢子的純化、富集問(wèn)題，尋找合適的對(duì)水稻氣傳孢子具有靶向檢測(cè)效果的熒光試劑；

（2）、解決單光子計(jì)數(shù)裝置與微流控芯片光學(xué)耦合的問(wèn)題；

（3）、解決病害種類(lèi)及程度與熒光光子吸收量間的模型關(guān)系問(wèn)題；

3、針對(duì)數(shù)學(xué)模型的建立問(wèn)題：、

（1）、根據(jù)前期建立的孢子生化反應(yīng)模型和物理空間分布特性模型結(jié)合實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)建立先期模型；

（2）、通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)學(xué)模型分析結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，修正數(shù)學(xué)模型。

（作者單位：江蘇大學(xué)）