馬春杰 莊嘉明 鄧順美 唐運革 秦衛(wèi)兵 王奇玲 張欣宗

[摘要]目的 研究甘油-卵黃-檸檬酸鹽（GEYC）冷凍保護劑中添加不同摩爾濃度二十二碳六烯酸（DHA）對人精子冷凍前后運動學(xué)參數(shù)的影響，探索n-3多不飽和脂肪酸在人精子冷凍中的應(yīng)用價值。方法 選取2016年3月～2017年4月廣東省計劃生育?？漆t(yī)院人類精子庫的篩查期供精者的33例精液標(biāo)本，以GEYC冷凍保護劑為基礎(chǔ)，外源性DHA在精液-GEYC混合液中的終濃度分別為對照組0 mmol/L、DHA 1組0.317 mmol/L、DHA 2組0.634 mmol/L、DHA 3組1.268 mmol/L。采用SCA 5.2計算機輔助精子分析系統(tǒng)分別檢測添加冷凍保護劑后以及冷凍復(fù)蘇后0～8 h的精子運動學(xué)參數(shù)。結(jié)果 冷凍前精液加入各組保護劑后，僅DHA 3組的VCL和VAP顯著低于對照組（P<0.05），其他各組間的各項運動學(xué)參數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；冷凍復(fù)蘇后0、4、5、6、8 h，僅見DHA 3組偶有運動學(xué)參數(shù)下降，與其他3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），凍后0～8 h大部分運動學(xué)參數(shù)各組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 甘油-卵黃-檸檬酸鹽冷凍保護劑中添加DHA未見冷凍前后人精子運動學(xué)參數(shù)的提高，適量添加DHA可能通過其他途徑對冷凍精子產(chǎn)生影響，大量添加DHA可能對冷凍前后部分運動學(xué)參數(shù)有負(fù)面影響。

[關(guān)鍵詞]n-3多不飽和脂肪酸；精液冷凍；精子運動學(xué)參數(shù)；二十二碳六烯酸

[中圖分類號] R691.9 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）4（a）-0004-05

Influence of addition of different molar concentration of DHA into Glycerol-Egg Yolk-Citrate Cryopreservative Mediums on the kinematic parameters of human sperm before and after cryosurgery

MA Chun-jie1 ZHUANG Jia-ming1 DENG Shun-mei1 TANG Yun-ge2 QIN Wei-bing1，2 WANG Qi-ling1 ZHANG Xin-zong1

1.Department of Andriatrics，Guangdong Institute of Family Planning Science and Technology （Guangzhou Family Planning Specialty Hospital），Guangzhou 510600，China；2.Key Laboratory of Male Reproductive and Heredity，State Health and Family Planning Commission，Guangdong Institute of Family Planning Science and Technology，Guangzhou 510600，China

[Abstract]Objective To study the influence of addition of different molar concentration of docosahexaenoic acid （DHA） into Glycerol-Egg Yolk-Citrate （GEYC） cryopreservative mediums on the kinematic parameters of human sperm before and after cryosurgery so as to explore the application value of n-3 polyunsaturated fatty acids in cryosurgery of human sperm.Methods Altogether 33 cases of semen samples which came from semen donors during human sperm bank screening period in Guangzhou Family Planning Specialty Hospital from March 2016 to April 2017 were selected.Based on GEYC cryopreservative mediums，the concentration of exogenous DHA in mixed semen-GEYC liquor were 0 mmol/L in the control group，0.317 mmol/L in the DHA 1 group，0.634 mmol/L in the DHA 2 group and 1.268 mmol/L in the DHA 3 group.SCA 5.2 computer-assisted sperm analysis system was used to detect the sperm kinematics parameters 0-8 hours after addition of cryopreservation and frozen resuscitation.Results After addition of cryopreservation and frozen resuscitation，only curve line velocity （VCL） and average path velocity （VAP） of the DHA 3 group were significantly lower than those of the control group （P<0.05），there was no statistically significant difference in kinematic parameters between the other groups （P>0.05）.After frozen recovery at 0，4，5，6，8 hours，only kinematic parameters of the DHA 3 group decreased occasionally，with statistically significant difference in contrast with 3 groups.After cryosurgery at 0-8 hours，most of the kinematic parameters had no statistically significant difference between each group （P>0.05）.Conclusion Addition of DHA into GEYC cryo-preservative mediums do not increase the sperm kinematic parameters before and after cryosurgery.The proper addition of DHA may affect frozen semen through other ways.Addition of a large number of DHA may have a negative impact on the part of the kinematic parameters before and after cryosurgery.

[Key words]n-3 polyunsaturated fatty acids；Semen cryosurgery；Sperm kinematics parameters；Docosahexaenoic acid

精液的冷凍保存是精子庫和輔助生殖技術(shù)實驗室的一項重要工作。冷凍復(fù)溫過程能夠破壞人精子結(jié)構(gòu)的完整性，從而影響精子功能。很多動物實驗顯示，飲食添加[1-6]和冷凍稀釋液[7]中直接添加n-3多不飽和脂肪酸（n-3 polyunsaturated fatty acids，n-3 PUFA），尤其是添加二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）（n-3 PUFA的一種）可以提高哺乳動物新鮮和冷凍后精液質(zhì)量。Vireque等[8]的研究顯示，含有卵黃的人精子冷凍保護劑中添加富含n-6和n-3 PUFA的大豆卵磷脂可以使人精子有效抵御冷凍損傷。已知CASA所檢測的運動學(xué)參數(shù)的結(jié)果與體內(nèi)、體外受精率及受孕所需時間有顯著相關(guān)性[9]。DHA是與精子功能相關(guān)的最主要的n-3 PUFA[10]，在男性生殖過程[11-12]和動物精子發(fā)生及受精過程中[13]發(fā)揮非常重要的作用。目前，有關(guān)人精子冷凍保護劑中單獨添加DHA對人精子運動學(xué)參數(shù)的影響卻鮮有報道。本文以世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）《人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版[9]推薦使用的甘油-卵黃-檸檬酸鹽（glycerol-egg yolk-citrate，GEYC）冷凍保護劑為基礎(chǔ)人精子冷凍保護劑，添加不同摩爾濃度的DHA，檢測加入含有不同摩爾濃度的冷凍保護劑后以及復(fù)蘇后0～8 h的人精子運動學(xué)參數(shù)的改變，探索DHA型n-3 PUFA在人精子冷凍保存中的應(yīng)用價值。

1資料與方法

1.1一般資料

選取我機構(gòu)人類精子庫2016年3月～2017年4月的33例篩查期供精者，年齡22～36歲，身體健康，無遺傳性疾病家族史，體檢未發(fā)現(xiàn)睪丸、附睪及輸精管異常。禁欲2～7 d，用消毒皂洗手，消毒濕巾清潔陰莖和尿道外口，手淫法取精，精液射入1個干燥無菌的廣口取精杯中，37℃水浴充分液化。

33例供精者精液標(biāo)本以GEYC冷凍保護劑為基礎(chǔ)，外源性DHA在精液-GEYC混合液中的終摩爾濃度分別為對照組0 mmol/L、DHA 1組0.317 mmol/L、DHA 2組0.634 mmol/L、DHA 3組1.268 mmol/L。對照組為精液+GEYC冷凍保護劑，不添加DHA；DHA 1、DHA 2、DHA 3組為DHA添加組，由精液+GEYC冷凍保護劑+DHA組成，添加的DHA在精液和冷凍保護劑混合物中的終濃度分別為DHA 1組0.317 mmol/L、DHA 2組0.634 mmol/L、DHA 3組1.268 mmol/L。

1.2試劑和儀器

1.2.1試劑 GEYC冷凍保護劑按照WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版的方法進行制備和存儲，pH值為7.0，細菌培養(yǎng)結(jié)果為無菌生長，無精子毒性；DHA和配制GEYC冷凍保護劑所需的葡萄糖、檸檬酸三鈉二水、甘氨酸、甘油均購買自Sigma公司（Sigma，America）。

1.2.2儀器 Makler計數(shù)池（Sefi-Medical Instrument，Israel）；計算機輔助精子分析（computeraided sperm analysis，CASA）系統(tǒng)為SCA 5.2（MicropticInc，Spain）。

1.3方法

1.3.1 SCA 5.2系統(tǒng)分析精子運動學(xué)參數(shù) 各組精液加入到DHA含量不同的冷凍保護劑后，充分混勻并孵育5 min后，用移液器量取10 μl精液和冷凍保護劑的混合液，加入到Makler計數(shù)池，溫度始終保持在37℃，于SCA 5.2系統(tǒng)檢測200條以上活動精子，獲得精子運動學(xué)參數(shù)，包括平均路徑速度（average path velocity，VAP）、直線速度（straight-line velocity，VSL）、曲線速度（curvilinear velocity，VCL）、精子頭側(cè)擺幅度（amplitude of lateral head displacement，ALH）、鞭打頻率（beat-cross frequency，BCF）、前向性（straightness，STR）、直線性（linearity，LIN）。

1.3.2精子冷凍與復(fù)溫 各組精液與DHA含量不同的冷凍保護劑混勻并檢測精子運動學(xué)參數(shù)后，置于液氮上方1 cm處熏蒸10 min，然后置于液氮中保存。凍存1周后，將精液標(biāo)本從液氮中取出，室溫放置1 min后置于37℃水浴6 min，之后按照上述方法分別檢測復(fù)蘇后0、1、2、3、4、5、6、7、8 h精子的運動學(xué)參數(shù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組精液與DHA含量不同冷凍保護劑混勻后運動學(xué)參數(shù)的比較

各組精液加入到DHA含量不同的GEYC冷凍保護劑后充分混勻并孵育5 min后，DHA 1組的VAP與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；DHA 3組的VCL和VAP與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；其他各組間運動學(xué)參數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

2.2各組精液復(fù)蘇后0～8 h運動學(xué)參數(shù)的比較

DHA 3組冷凍復(fù)蘇后0 h和4 h的BCF、6 h的VCL、8 h的STR與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；DHA 3組冷凍復(fù)蘇后4 h的VAP、WOB、BCF和5 h的STR與DHA 1組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；DHA 3組冷凍復(fù)蘇后4 h的BCF和6 h的VCL與DHA 2組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；冷凍復(fù)蘇后其他各時段各組間各項運動學(xué)參數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

3討論

多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）主要包括n-3、n-6和n-9系列脂肪酸，但有重要生物學(xué)意義的是n-3和n-6 PUFA。目前，有關(guān)PUFA，尤其是n-3 PUFA能提高精子濃度和活力以及提高家畜繁殖能力的相關(guān)研究得到了國內(nèi)外許多研究人員的青睞。現(xiàn)有研究顯示[10]，DHA是與精子功能相關(guān)的最主要的n-3 PUFA，DHA可以促進動物精子的成熟；當(dāng)DHA整合到精子細胞膜中時，精子質(zhì)膜才能呈現(xiàn)良好的流動性；DHA還參與精子細胞膜中蛋白介導(dǎo)的細胞應(yīng)答，影響脂質(zhì)介導(dǎo)體的產(chǎn)生、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因的表達。Martinez-Soto等[14]的研究顯示，精子細胞膜的PUFA主要是DHA，占PUFA總量的50%；精漿中的DHA含量占PUFA總量的25%；在復(fù)蘇率>50%的精液標(biāo)本中，精子細胞膜DHA的含量明顯高于復(fù)蘇率<50%的精液標(biāo)本。Aurich等[15]的研究提示，馬因為季節(jié)性攝入PUFA量不同，導(dǎo)致馬精子的冷凍復(fù)蘇率不同。

有研究顯示，精子和精液中DHA含量可以作為衡量精子耐凍潛能和凍后精子授精潛能的一個指標(biāo)，且精子細胞膜n-3 PUFA特別是DHA的含量與冷凍后精子運動學(xué)參數(shù)呈正相關(guān)[14]；Safarinejad等[16]的研究提示，少弱畸形精子癥患者補充n-3 PUFA可以改善精液質(zhì)量的報道，所以有必要探索在精液里直接添加DHA，提高精子和精漿局部DHA含量對人精子的冷凍復(fù)蘇前后運動學(xué)參數(shù)的影響，從而進一步影響精子的受精潛能。本文結(jié)合目前國內(nèi)人類精子庫的現(xiàn)狀，在人精子GEYC型冷凍保護液中添加不同比例DHA，研究其對人精子冷凍前后運動學(xué)參數(shù)的影響，擬探索n-3 PUFA在供精者精子冷凍中的應(yīng)用前景。結(jié)果顯示，終摩爾濃度分別為0.317 mmol/L（DHA 1組）、0.634 mmol/L（DHA 2組）、1.268 mmol/L（DHA 3組）的外源性DHA添加各組，無論是冷凍前還是冷凍后均未見人精子運動學(xué)參數(shù)提高。冷凍前精液加入各組保護劑后，僅摩爾濃度最高組（DHA 3組）的VCL和VAP顯著低于對照組，其他各組間的各項運動學(xué)參數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；冷凍復(fù)蘇后0、4、5、6、8 h，僅見DHA 3組偶有運動學(xué)參數(shù)下降，與其他3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，大部分時間各項運動學(xué)參數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。雖然有研究提示DHA在人精子功能完整性和冷凍過程中發(fā)揮重要作用，也與精子運動學(xué)參數(shù)息息相關(guān)；也有動物實驗提示在冷凍保護液中添加DHA可以提高精液冷凍效果[7]，但是本研究顯示在人精子GEYC型冷凍保護液中添加外源性DHA并不能顯著提高冷凍前后的人精子運動學(xué)參數(shù)。本文的研究結(jié)果與人口服DHA后精液參數(shù)變化相似[17]，試驗組人員日服1500 mg富含DHA的油劑10周后，精液參數(shù)和精子膜脂肪酸組成未見改變，但是精液的抗氧化水平升高，DNA碎片率降低。DHA對人精子的影響可能不表現(xiàn)在改善精液常規(guī)參數(shù)，而是表現(xiàn)在降低DNA碎片率等遺傳物質(zhì)抗氧化方面。最近也有研究人員報道了類似的動物實驗結(jié)果，膳食添加n-3 PUFA（來源于微藻類）使牛精子VPA、VCL、VSL、ALH等運動學(xué)參數(shù)顯著降低，游動距離變短，能量代謝受損[18]，但是膜流動性顯著增加可能在精子冷凍中發(fā)揮作用；不論是膳食單獨添加PUFA還是PUFA和維生素E聯(lián)合添加，牛持續(xù)攝入60 d后，均對凍融后精子的動力學(xué)參數(shù)有負(fù)面影響[19]；飲食攝入n-3和n-6 PUFA對奶牛和公羊新鮮精液的精液量以及冷凍前后的精子濃度和直線性運動精子數(shù)無影響，精子膜流動性也無顯著改變[20-21]。已知PUFA尤其是DHA和DPA，可以促進精子質(zhì)膜的流動性。精子冷凍保存的成功率與質(zhì)膜流動性關(guān)系是：精子質(zhì)膜適度的流動性有助于冷凍保護劑進入精子細胞內(nèi)和精子細胞脫水，但是過高的流動性會損害精子的完整性。本研究所選用精液均為捐精者的正常精液，外源性添加DHA與其他各組發(fā)生差異的組也是DHA 3組，即摩爾濃度最高組，可能原因就是DHA濃度高導(dǎo)致精子膜流動性也高，反而不能提高人精子冷凍前后的運動學(xué)參數(shù)。已有研究顯示[14]，精液參數(shù)正常的人精子膜的n-3 PUFA，特別是DHA含量，顯著高于少精癥、弱精子癥、少弱精子癥患者。所以根據(jù)本研究提示的結(jié)果，可以進一步研究外源性添加DHA對少精癥、弱精子癥、少弱精子癥患者精液的冷凍效果是否有利；也可以進一步探索對參數(shù)正常人精液冷凍保存最佳的DHA添加濃度以及人精子冷凍保護劑中單獨添加DHA后對人精子運動學(xué)參數(shù)以外的影響，如DNA碎片率等。

目前有關(guān)DHA對精液影響的研究主要集中在兩個途徑，即膳食添加和直接添加到精液。多數(shù)動物實驗提示[1-6]，膳食添加n-3 PUFA可以改變精子膜的脂肪酸組成，特別是提高DHA的含量，從而改善新鮮和凍后精液質(zhì)量。除了飲食添加DHA，有學(xué)者嘗試在綿羊冷凍保護液里直接添加深海魚油PUFA（主要成分是DHA和EPA）[7]，由于其具有強的膜通過性，滲透入精子細胞對頭部保護，防止了酶的滲出和鈣離子的流入，使解凍后的綿羊精子活力和頂體完整率明顯高于未添加PUFA的對照組。上述兩種途徑添加DHA又分別有單獨添加和聯(lián)合添加兩種。雖然單獨添加PUFA在某些物種顯示出了一定的改善精子功能的工作，但也有一些研究顯示，聯(lián)合使用L-半胱氨酸能明顯改善解凍后精液質(zhì)量，特別是精子的運動能力和完整性，PUFA聯(lián)合使用維生素E直接添加到冷凍保護液[22]能使PUFA的精子保護作用更穩(wěn)定。盡管如此，近期陸續(xù)有研究報道膳食添加n-3或n-6 PUFA后不論新鮮精液還是凍后精液參數(shù)均無改善[17-21，23]，這與本文的研究結(jié)果類似。整理相關(guān)文獻后發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)結(jié)論不一致的原因可能是DHA發(fā)揮相關(guān)作用與物種有關(guān)，同樣地添加途徑在不同物種間發(fā)揮的作用可能不同，也可能與PUFA添加的種類和純度有關(guān)。

目前，有關(guān)PUFA尤其是與精子生理功能密切相關(guān)的n-3 PUFA對人精子影響的研究處于起步階段。本研究僅對人冷凍保護劑中單獨添加DHA（n-3 PUFA的1種）對人精子運動學(xué)參數(shù)的影響進行了初步探索，有關(guān)正常和不育人群單獨添加DHA或聯(lián)合添加n-3 PUFA和抗氧化劑對凍后精液影響的研究正在進一步探索中，通過這些研究將會越來越了解以DHA為代表的n-3 PUFA在人精子冷凍保存中可能發(fā)揮的作用。

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（收稿日期：2017-12-18 本文編輯：祁海文）