黃忠明 周延彪 唐曉丹 趙新輝 周在為 符星學(xué)王 凱 史江偉 李艷鋒 符辰建2, 楊遠(yuǎn)柱,2,,,*

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基于CRISPR/Cas9技術(shù)的水稻溫敏不育基因突變體的構(gòu)建

黃忠明1周延彪2,3,*唐曉丹3趙新輝3周在為3符星學(xué)3王 凱3史江偉3李艷鋒4符辰建2,3楊遠(yuǎn)柱1,2,3,4,*

1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 湖南長沙 410128;2袁隆平農(nóng)業(yè)高科技股份有限公司 / 抗病蟲水稻育種湖南省工程實驗室, 湖南長沙 410001;3湖南隆平高科種業(yè)科學(xué)研究院有限公司, 湖南長沙 410119;4湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 湖南長沙 410081

為創(chuàng)新優(yōu)良溫敏不育系, 促進(jìn)兩系雜交稻育種的發(fā)展, 我們以水稻溫敏不育基因為編輯對象, 設(shè)計了由水稻U3啟動子驅(qū)動、長20 bp的guide RNA (gRNA)靶點以靶向編輯基因的第1個外顯子, 將靶點與表達(dá)載體pCAMBIA1301連接, 再用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得水稻轉(zhuǎn)基因株系。提取T0代轉(zhuǎn)基因株系的基因組DNA, 并對編輯位點附近的DNA片段進(jìn)行PCR檢測及測序分析。結(jié)果表明, T0代植株的突變率為63.89%, 其中純合缺失突變率為34.78%。對T1代純合缺失突變體的不育起點溫度和農(nóng)藝性狀調(diào)查分析結(jié)果表明, 28℃是突變體花粉育性的轉(zhuǎn)換溫度。大田試驗結(jié)果表明, 與野生型相比,突變體的結(jié)實率和單株重均顯著降低。粳稻突變體的獲得為培育粳稻不育系奠定了材料基礎(chǔ)。

水稻; 基因編輯; CRISPR/Cas9; TMS5; 溫敏不育

水稻是我國最重要的糧食作物之一, 針對緊缺的自然資源和有限的耕地面積, 糧食的供需變得越來越不平衡, 培育高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)作物品種是確保糧食安全的根本途徑。雜交水稻的產(chǎn)量比常規(guī)水稻提高20%~30%, 因此發(fā)展雜交水稻是解決糧食短缺問題的重要方法[1]。

雜交水稻的育種方法主要包括兩系法和三系法。三系即保持系、不育系和恢復(fù)系, 主要是通過細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和恢復(fù)系雜交產(chǎn)生雜交種子, 利用保持系和不育系雜交繁殖細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。兩系即不育系和恢復(fù)系, 主要是利用光/溫敏雄性核不育系與恢復(fù)系雜交產(chǎn)生雜交種子。光/溫敏不育系在長日/高溫條件下花粉敗育, 而在短日/低溫條件下能恢復(fù)花粉育性, 故可一系兩用。光/溫敏雄性核不育系的育性由核基因控制, 無恢保關(guān)系限制, 配組自由, 選出優(yōu)良組合機率高[2]。因此, 光/溫敏不育系在雜交水稻育種中潛力巨大, 被廣泛應(yīng)用。雜交水稻的品種選育, 從三系發(fā)展到兩系, 如何進(jìn)一步突破產(chǎn)量潛力, 實現(xiàn)高產(chǎn)與優(yōu)質(zhì)高效結(jié)合, 是目前的迫切需求。2014年, Zhou等[3]克隆了安農(nóng)S-1和株1S的溫敏不育基因, 首次揭示了水稻溫敏雄性不育的分子機制。序列分析結(jié)果顯示, 安農(nóng)S-1和株1S中編碼區(qū)第71位堿基均由C突變成A, 形成了一個提前的終止密碼子, 導(dǎo)致TMS5蛋白不能正確合成。

培育優(yōu)良的雜交水稻組合, 首要要實現(xiàn)不育系的突破。常規(guī)雜交轉(zhuǎn)育是培育兩系不育系較常用的方法。但常規(guī)雜交育種有選育周期漫長和一些優(yōu)良性狀會丟失等缺點, 越來越難以實現(xiàn)日益提高的育種目標(biāo)。目前, CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR- associated protein 9)基因編輯技術(shù)可對作物內(nèi)源基因進(jìn)行定向改造, 并且具有成本低廉、技術(shù)門檻低、操作簡單、試驗周期短等優(yōu)點, 為作物遺傳改良提供了新的途徑[4-6]。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)主要包括 Cas9核酸酶和 sgRNA 兩個重要組分。這兩個組分形成復(fù)合體, 切割與sgRNA上的間隔序列(spacers)互補的基因組DNA, 引起DNA雙鏈斷裂, 并通過體內(nèi)的非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)進(jìn)行修復(fù)形成堿基缺失、插入、替換等突變類型[7-8]。2013年, Shan等[9]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻基因進(jìn)行編輯, 獲得及突變體, 可以用于水稻香米株系和耐冷性株系的創(chuàng)建。同年, 馮爭艷等[10]對水稻基因進(jìn)行突變, 可以用于水稻卷葉育種及糯性育種。2016 年, 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究組和李家洋研究組合作利用在修復(fù)途徑中占主導(dǎo)地位的非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)方式在水稻中建立了基于 CRISPR/Cas9 技術(shù)的基因替換以及基因定點插入體系, 并通過堿基替換策略獲得抗草甘膦的水稻材料[11]。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的發(fā)展使其在水稻遺傳改良中的應(yīng)用越來越廣泛[12-13]。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)定點編輯溫敏不育基因, 獲得了粳稻F197的突變體, 并對其不育起點溫度進(jìn)行了研究, 為利用基因創(chuàng)制新型的溫敏不育新種質(zhì)提供了材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 靶位點設(shè)計

設(shè)計(LOC_Os02g12290)靶點序列參照Xie等的方法[14]。在第1外顯子上, 靠近編碼蛋白質(zhì)的N’端, 設(shè)計長度為20 bp的靶位點序列, PAM序列為CGG (圖1)。靶點序列正義鏈和反義鏈的5￠端分別添加TGGC和AAAC, 使其與中間載體18T-Cas9經(jīng)I酶切后形成黏性互補末端。

圖1 TMS5靶點位置

紅色的字母為靶點序列; 藍(lán)色的字母為PAM序列。

The red letters are the target genome sequences; The blue letters are the protospacer adjacent motif (PAM) sequences.

1.2 CRISPR/Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建

利用合成的靶點序列引物Target-1 (表1), 經(jīng)過98℃處理30 s, 再室溫放置5 min制成互補雙鏈DNA, 用于載體構(gòu)建。用I酶切18T-Cas9載體、酶切體系包括18T-Cas9載體2 μg、10×FastDigest buffer 2 μL、I 0.1 μL (10 U μL–1), 加ddH2O至20 μL。對酶切后的18T-Cas9質(zhì)粒進(jìn)行膠回收, 然后用T4 DNA連接酶將的接頭與回收后的18T-Cas9載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a, 用18T-Cas9載體上的引物M13F與靶點序列引物Target-1R進(jìn)行菌液PCR檢測, 挑選陽性菌株送公司測序, 篩選正確的重組中間載體18T-Cas9-TMS5- gRNA, 然后分別用I和d III酶切植物表達(dá)載體pCAMBIA1301和重組的中間載體, 回收酶切產(chǎn)物, 再通過T4 DNA連接酶連接, 構(gòu)建pCAMBIA1301-Cas9-TMS5-gRNA表達(dá)載體, 再通過酶切鑒定確認(rèn)植物表達(dá)載體構(gòu)建成功后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105, 載體構(gòu)建的具體流程見圖2。

1.3 轉(zhuǎn)基因陽性植株的獲得

將構(gòu)建好的陽性農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化粳稻F197的愈傷組織, 用潮霉素篩選獲得T0代植株。提取T0代植株的DNA, 用載體上的特異引物GUS-JC-F/ GUS-JC-R (表1)進(jìn)行PCR擴增, 擴增產(chǎn)物大小為718 bp, 能擴增出目的大小片段的植株為陽性轉(zhuǎn)基因植株。同時, 因為pCAMBIA1301載體上有GUS報告基因, 因此可以通過GUS組織化學(xué)染色[15]的方法快速鑒定陽性轉(zhuǎn)基因植株。

表1 本研究所用的引物

1.4 測序檢測靶位點

為了檢測靶位點的突變情況, 在的靶位點兩端分別設(shè)計測序引物TMS5-CX-F和TMS5- CX-R (表1), 擴增產(chǎn)物大小為974 bp。將測序引物擴增的目的片段送測序公司測序。同時, 以野生型F197的基因組DNA為模板, 將測序引物擴增目的片段的測序結(jié)果作為對照序列。

1.5 T1代無選擇標(biāo)記基因突變株的獲得

對T1代植株的葉片進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色, 不能染上藍(lán)色的為無選擇標(biāo)記基因的植株, 以野生型葉片的染色為對照。再以無選擇標(biāo)記基因植株的基因組為模板用TMS5-JC-F和TMS5-JC-R引物擴增, 將目的條帶測序, 根據(jù)測序結(jié)果分析是否有突變。

1.6 碘-碘化鉀染色檢測花粉育性

對照F197和T1代無轉(zhuǎn)基因元件且功能缺失的突變株在主莖幼穗分化到六期的時候進(jìn)行人工控光溫處理, 分別用24℃、28℃和32℃處理14 d (12 h光照/12 h黑夜)后, 在自然條件下生長, 用碘-碘化鉀染色[16]觀察除主莖外的其他莖節(jié)上花粉的育性, 并調(diào)查成熟期F197和突變體的結(jié)實率。

1.7 大田農(nóng)藝性狀調(diào)查

參照Zhou等的方法[17], 以F197為對照, 于2017年5月至10月在湖南長沙自然條件下調(diào)查突變體的田間農(nóng)藝性狀。5月25日播種, 8月11日至20日為突變體幼穗敏感期, 這期間日平均氣溫為27.8℃。在成熟期選擇F197和突變體各20株, 分別考察株高、千粒重、有效穗、結(jié)實率和單株產(chǎn)量, 采用檢驗統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPR/Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建

為了獲得粳稻F197的基因敲除的突變體, 根據(jù)CRISPR/Cas9技術(shù)原理, 結(jié)合生物信息學(xué)網(wǎng)站http://www.genome.arizona.edu/crispr/, 在第1外顯子區(qū)域設(shè)計20 bp的靶點序列Target-1 (表1和圖1)。退火形成的雙鏈互補靶序列與中間載體18T-Cas9連接形成重組載體18T-Cas9-Rice-TMS5- gRNA (圖2-A)。重組載體經(jīng)I和d III雙酶切, 將CRISPR/Cas9元件連接到植物表達(dá)載體pCAMBIA1301中形成重組載體pCAMBIA1301- Cas9-TMS5-gRNA (圖2-B, C)。通過酶切鑒定, 說明pCAMBIA1301-Cas9-TMS5-gRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖3-A)。將構(gòu)建成功的重組載體通過電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105, 再用pCAMBIA1301載體上的報告基因GUS的檢測引物GUS-JC-F/GUS-JC-R (表1)進(jìn)行菌液PCR, 擴增產(chǎn)物大小為718 bp (圖3-B), 能擴增出目的片段大小的菌液為陽性菌株, 將陽性的農(nóng)桿菌菌株用于轉(zhuǎn)化粳稻F197。

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定及突變位點測序分析

采用CTAB法提取T0代水稻植株葉片的基因組DNA, 用GUS報告基因的特異引物GUS-JC-F/GUS- JC-R進(jìn)行PCR, 擴增目的片段大小為718 bp的植株為陽性轉(zhuǎn)基因植株(圖4-A)。另外, 對T0代植株進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色可以快速地鑒定轉(zhuǎn)基因植株, 能染上藍(lán)色的為陽性轉(zhuǎn)基因植株(圖4-B)。在F197中共獲得57株組培苗, 其中有36株陽性轉(zhuǎn)基因植株。為了分析T0代陽性轉(zhuǎn)基因植株的突變情況, 在靶點附近設(shè)計測序引物TMS5-CX-F/ TMS5-CX-R。PCR測序結(jié)果表明, 在36株陽性轉(zhuǎn)基因植株中, 檢測到23株發(fā)生突變, 其中純合突變有8株, 純合突變率為34.78%, 其余15株的靶序列突變位點附近出現(xiàn)雙峰。將出現(xiàn)雙峰的測序文件通過在線工具DSDecode (http://skl.scau.edu.cn/ dsdecode/)自動解碼[18], 結(jié)果顯示均為雜合突變(附圖)。純合突變主要來自PAM前第3和第4堿基之間有單堿基A、T和G的插入, 分別占62.5%、25.0%和12.5%, 而沒有檢測到單堿基C的插入(圖5)。

圖2 CRISPR/Cas9-TMS5載體構(gòu)建示意圖

A: 18T-Cas9-TMS5-gRNA重組載體結(jié)構(gòu)示意圖; B: pCAMBIA1301載體的T-DNA片段; C: pCAMBIA1301-Cas9-TMS5-gRNA重組載體結(jié)構(gòu)示意圖。LB: 左邊界; RB: 右邊界。

A: schematic diagram of the recombinant vector of 18T-Cas9-TMS5-gRNA; B: T-DNA fragment of pCAMBIA1301 vector; C: schematic diagram of the pCAMBIA1301-Cas9-TMS5-gRNA construct. LB: left border; RB: right border.

圖3 酶切和PCR鑒定pCAMBIA1301-Cas9-TMS5-gRNA載體

A:I和d III酶切鑒定pCAMBIA1301-Cas9-TMS5-gRNA載體。箭頭所示為CRISPR/Cas9系統(tǒng)元件的片段; B: 利用GUS-JC-F和GUS-JC-R引物PCR鑒定農(nóng)桿菌中的pCAMBIA1301-Cas9-TMS5-gRNA載體。M: DL2000; 1: 18T-Cas9-TMS5-gRNA; 2: pCAMBIA1301; 3: pCAMBIA1301-Cas9-TMS5-gRNA。

A: identification of the pCAMBIA1301-Cas9-TMS5-gRNA plasmid digested withI andd III; B: identification of the pCAMBIA1301-Cas9-TMS5-gRNA plasmid inby PCR with primers of GUS-JC-F and GUS-JC-R. M: DL2000; 1: 18T-Cas9-TMS5-gRNA; 2: pCAMBIA1301; 3: pCAMBIA1301-Cas9-TMS5-gRNA.

圖4 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

A: PCR檢測陽性轉(zhuǎn)基因植株; B: GUS組織化學(xué)染色檢測陽性轉(zhuǎn)基因植株。M: DL2000; +: 陽性對照; 1–18: 轉(zhuǎn)基因植株。

A: identification of the positive transgenic plants by PCR; B: identification of the positive transgenic plants by GUS histochemical staining. M: DL2000; +: positive control; 1–18: transgenic plants.

圖5 T0代轉(zhuǎn)基因植株TMS5純合突變類型和頻率

A: 純合突變類型序列比對; B: 純合突變類型不同堿基插入的頻率。紅色字母為靶點序列; 藍(lán)色字母為PAM序列; 綠色的字母為插入的堿基。

A: Sequence alignment of homozygous mutation types; B: Frequency of different base inserts in homozygous mutation types. The red letters are the target genome sequences; The blue letters are PAM; The green letters are the insert base.

2.3 T1代無選擇標(biāo)記基因突變株的獲得及突變株不育起點溫度的鑒定

將上述單堿基A或T或G插入的純合突變單株自交, 結(jié)實后得到T1代種子, 將其播種成苗后進(jìn)行GUS染色, 沒有染上藍(lán)色的為不含轉(zhuǎn)基因成分的單株, 然后提取非轉(zhuǎn)基因植株葉片的基因組DNA進(jìn)行PCR測序, 分別得到單堿基A或T或G插入的不含轉(zhuǎn)基因成分的單株, 編號分別為用于不育起點溫度的鑒定。

當(dāng)野生型(WT)和突變體主莖的幼穗處于六期的時候, 將WT和突變體置于24℃、28℃和32℃的恒溫培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)14 d, 然后對除主莖外的其他莖節(jié)上的花粉進(jìn)行鏡檢, 并考察成熟期結(jié)實率。結(jié)果表明, 在24℃培養(yǎng)下, WT和突變體的花粉都是可育的, 在成熟期WT和突變體的結(jié)實率沒有顯著變化; 28℃培養(yǎng)下,突變體的花粉大部分是不育的, 而WT的花粉是可育的, 在成熟期突變體的結(jié)實率顯著低于WT的; 32℃培養(yǎng)下,突變體的花粉是完全不育的, 而野生型的花粉是可育的, 在成熟期突變體的結(jié)實率為0 (圖6)。因此, 28℃是突變株花粉育性的轉(zhuǎn)換溫度。

圖6 野生型和tms5突變體在不同溫度處理條件下的花粉育性和結(jié)實率

數(shù)據(jù)表示平均值±方差。**表示突變體與WT之間存在顯著差異(< 0.01)。

Data are presented as average values ± standard error of the mean. **, significant difference betweenmutant and WT (< 0.01).

2.4 T1代植株農(nóng)藝性狀分析

為了研究F197的基因缺失后對植株農(nóng)藝性狀的影響。我們調(diào)查了野生型和突變體的株高、千粒重、結(jié)實率、有效穗和單株重。結(jié)果表明突變體的結(jié)實率和單株重比野生型明顯降低(<0.01), 而株高、千粒重、有效穗與野生型相比均無顯著差異(表2)。

表2 野生型(WT)和tms5突變體的農(nóng)藝性狀

數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(=20)。**表示突變體與WT之間存在顯著差異(< 0.01)。

Data are presented as average values ± standard error (=20).**, significant difference betweenmutant and WT (< 0.01)

3 討論

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是一種新興的基因組定點編輯技術(shù), 具有操作簡單、編輯效率高、成本低廉等特點。由于插入位置與作用位點分離, 在轉(zhuǎn)基因植物的后代中通過自交等手段可將轉(zhuǎn)基因成分從基因組中分離出去, 從而最小范圍地特異性地改變植物基因組。因此, CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)可以幫助育種工作者更加快速、準(zhǔn)確地定向改造作物品種。目前該技術(shù)已經(jīng)在許多作物中廣泛應(yīng)用, 如水稻[19-20]、玉米[21-22]、小麥[23-24]、大豆[25-26]等。2014年, Zhou等[3]克隆了安農(nóng)S-1和株1S的溫敏不育基因, 首次揭示了水稻溫敏雄性不育的分子機制。本研究為探討基因功能缺失在粳稻中的效應(yīng), 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在粳稻品種F197中敲除基因, 成功獲得了功能缺失的突變體, 并在T1代功能缺失的非轉(zhuǎn)基因材料中考察了花粉育性的起點溫度和農(nóng)藝性狀。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的Cas9核酸酶以PAM上游第3堿基處為切割中心進(jìn)行突變[27]。其中, 超過一半的突變?yōu)閱螇A基插入, 其中又以A 或T插入為主[28-29]。本研究中,基因的純合突變發(fā)生在PAM上游第3堿基和第4堿基之間, 并且是單堿基A或T或G的插入, 其中單堿基A插入占62.5%, 單堿基T插入占25%, 單堿基G插入占12.5%?；虻耐蛔兦闆r與前人的研究結(jié)果類似。

研究顯示我國25個主要使用的兩用光/溫敏核不育系中有24個均含有基因, 表明基因是控制我國溫敏型不育系的主要不育基因[1]。Zhou等[3]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對粳稻品種中花11、GAZ和秈稻品種粵晶絲苗、泰豐B、五山絲苗、ReB、珍汕97B的基因進(jìn)行敲除, 并分別獲得了這些品種的功能缺失的突變體。粳稻品種中花11和GAZ的突變體在28℃培養(yǎng)下花粉表現(xiàn)為完全不育, 而秈稻品種粵晶絲苗、泰豐B、五山絲苗、ReB、珍汕97B的突變體分別在24℃、26℃、26℃、26℃、28℃培養(yǎng)下花粉表現(xiàn)為完全不育[18]。同時, 水稻廣親和溫敏不育系秈稻株1S的不育起點溫度為22.6℃[30-31]。因此, 可以看出秈稻品種的功能缺失突變體的不育起點溫度較粳稻品種低, 這種結(jié)果可能是粳稻和秈稻的遺傳背景不同造成的, 同時也說明基因功能缺失與不育起點溫度無關(guān)。本研究中, 粳稻F197的突變體花粉在24℃培養(yǎng)下完全可育, 28℃培養(yǎng)下大部分不育, 32℃培養(yǎng)下完全不育(圖6)。因此, 28℃可能是突變體花粉育性的轉(zhuǎn)換溫度。

產(chǎn)量是作物最重要的性狀之一, 由多個產(chǎn)量相關(guān)性狀共同決定, 并且易受外界環(huán)境的影響。產(chǎn)量的決定因素主要有千粒重、結(jié)實率和有效穗數(shù)[32]。編碼一個短版的RNAase Z同源蛋白RNAase ZS1, 通過對UbmRNA的加工調(diào)控水稻溫敏雄性不育[1,3]。本試驗中粳稻品種F197的突變體由于花粉育性降低, 導(dǎo)致其結(jié)實率比野生型的低, 但是突變體的株高、千粒重和有效穗數(shù)與野生型相比沒有明顯變化。

4 結(jié)論

利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了敲除溫敏不育基因的粳稻品種F197的突變體, 為培育水稻溫敏雄性核不育系提供了重要材料基礎(chǔ)。28℃是突變體的育性轉(zhuǎn)換溫度, 并且在32℃表現(xiàn)為完全不育, 這為敲除的粳稻品種不育起點溫度的研究提供了重要參考。

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附圖1 靶位點突變序列分析

Supplementary Fig. 1 Analysis of mutation sequences of target

紅色的字母為靶點序列; 藍(lán)色的字母為PAM序列; 綠色的字母為插入的堿基; +表示插入; WT表示野生型; Ho表示純合突變; He表示雜合突變。

The red letters are the target genome sequences; the blue letters are PAM; the green letters are the insert base; +: Insertion; WT: Wild-type; Ho: homozygous mutation; He: heterozygous mutation.

Construction ofMutants in Rice Based on CRISPR/Cas9 Technology

HUANG Zhong-Ming1, ZHOU Yan-Biao2,3,*, TANG Xiao-Dan3, ZHAO Xin-Hui3, ZHOU Zai-Wei3, FU Xing-Xue3, WANG Kai3, SHI Jiang-Wei3, LI Yan-Feng4, FU Chen-Jian2,3, and YANG Yuan-Zhu1,2,3,4,*

1College of Agronomy, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, Hunan, China;2Yuan Longping High-Tech Agriculture Co. Ltd., Hunan / Hunan Engineering Laboratory for Disease and Pest Resistance Rice Breeding, Changsha, 410001, Hunan, China;3Hunan Longping High-Tech Seeds Science Academy Co. Ltd., Changsha 410119, Hunan, China;4College of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha 410081, Hunan, China

In order to create excellent temperature sensitive sterile line and promote the development of two line hybrid rice breeding. a 20 bp guide RNA (gRNA) was targeted to the first exon ofa thermo-sensitive genic male sterile geneas the editable object in present study, and driven by the rice U3 promoter. The target site of gRNA was ligated into the vector pCAMBIA1301, and its transgenic lines were obtained via-mediated transformation. The genomic DNA of T0transgenic lines was then extracted, and thelocus was detected by PCR and sequenced. The mutagenesis frequency forwas 63.89%, of which the frequency of homozygous deletion mutation was 34.78%. Furthermore, the fertility transition temperature and agronomic traits of T1homozygous deletion mutants were investigated, showing that the fertility transition temperature ofmutants was 28°C. Both seed setting rate and grain yields inmutants were significantly decreased compared with those in wild-type plants in paddy field condition. Together, the successful construction ofmutants lays a material foundation for breeding the thermo-sensitive male sterile line ofrice.

rice; genome editing; CRISPR/Cas9; TMS5; thermo-sensitive genic male sterile

2017-10-25;

2018-03-26;

2018-04-08.

10.3724/SP.J.1006.2018.00844

楊遠(yuǎn)柱, E-mail: yzhuyah@163.com; 周延彪, E-mail: zhouyb@lpht.com.cn

E-mail: 604654239@qq.com

本研究由國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2016ZX08001-004)和湖南省重點研發(fā)計劃項目(2016JC2026)資助。

This study was supported by the Major Project of China on New Varieties of GMO Cultivation (2016ZX08001-004) and the Key Research Program of Hunan Province (2016JC2026).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180408.1014.010.html