王建偉 賀曉嵐,* 李文旭 陳新宏

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小麥近緣屬植物基因的克隆及功能分析

王建偉1賀曉嵐1,*李文旭3陳新宏2

1凱里學(xué)院大健康學(xué)院, 貴州凱里 556011;2西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 陜西省植物遺傳工程育種重點實驗室, 陜西楊凌 712100;3河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所, 河南鄭州 450002

果聚糖與植物碳素分配和抗逆性有關(guān), 在逆境脅迫中具有保護(hù)植物細(xì)胞免受傷害的作用。為明確不同來源的果聚糖1-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因在植物抗逆中的作用, 本研究分別以小麥近緣屬植物華山新麥草(, 2= 2x = 14, NsNs)、簇毛麥(, 2= 2x = 14, VV)、大賴草(, 2= 4x = 28, NsNsXmXm)為材料, 利用RACE技術(shù)克隆獲得3個果聚糖1-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因, 分別命名為、和。3個基因的完整開放閱讀框長度分別為1989、1950和1989 bp, 編碼662、649和662個氨基酸, 其編碼氨基酸序列均含有果糖基轉(zhuǎn)移酶保守結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列比對及進(jìn)化樹分析表明, Ph-1-FFT和Lr-1-FFT高度同源, 與Dv-1-FFT位于不同的分支, 而Dv-1-FFT與普通小麥、圓錐小麥、西爾斯山羊草和烏拉爾圖小麥1-FFT具有高度同源性。采用基因重組技術(shù)構(gòu)建p1300-35SN-//表達(dá)載體, 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將3個載體分別轉(zhuǎn)入煙草品種W38中。對經(jīng)過抗性篩選、PCR和RT-PCR驗證的轉(zhuǎn)基因植株鑒定發(fā)現(xiàn), 其抗旱和抗寒性明顯高于對照, 不同來源的轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性差異不明顯; 在逆境脅迫條件下, 轉(zhuǎn)基因株系的果聚糖、可溶性糖、脯氨酸含量都顯著高于對照, 而丙二醛的含量顯著低于對照, 不同來源的轉(zhuǎn)基因植株的果聚糖、可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量差異不顯著。本研究表明,、和基因均是典型的基因家族成員, 其表達(dá)可能對提高煙草抗旱和抗寒性起作用。

基因; 抗旱性; 抗寒性; 小麥近緣屬植物; 轉(zhuǎn)基因煙草

干旱、低溫、高鹽等非生物脅迫是影響植物生長發(fā)育的重要環(huán)境脅迫因子, 嚴(yán)重影響著作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。果聚糖既是溫帶和寒帶地區(qū)植物組織中重要的能量貯藏物質(zhì), 又是提高植物抗逆性(抗旱、抗寒、抗鹽等)的重要成分[2-3]?；谔擒真I的連鎖類型植物中的果聚糖可劃分為5個類型, 在高等植物中, 主要有4種不同的果聚糖基轉(zhuǎn)移酶參與果聚糖的合成[4]。其中1-FFT的主要功能是促進(jìn)果聚糖碳鏈的進(jìn)一步延伸, 產(chǎn)生高聚合度果聚糖[5]。除1-FFT之外, 果聚糖:果聚糖6G-果糖基轉(zhuǎn)移酶(fructan: fructansyltrans 6G-fructosyltcallsferase 6G-FFT)和蔗糖:果聚糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶(sucrose:fructan-6- fructosyltrans-ferase 6-SFT)也參與糖苷鍵進(jìn)一步延伸的生化反應(yīng), 但是不同酶催化可能形成不同的糖苷鍵類型[6]。對小麥族果聚糖合成酶的克隆和功能研究, 可為定向調(diào)控植物果聚糖的含量和組分, 提高植物抗逆性提供遺傳依據(jù)。

早在1966年就有關(guān)于菊芋的報道[7], 但直到20世紀(jì)80年代才從菊芋中分離純化得到[8-9], 隨后在藍(lán)刺頭[5]、維氏菊[10]、圓錐小麥[11]、普通小麥[11]、烏拉爾圖小麥[11]等植物中克隆得到, 并且對其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了深入研究。小麥族基因在進(jìn)化上相對較保守, 除節(jié)節(jié)麥外, 烏拉爾圖小麥、西爾斯山羊草、圓錐小麥和普通小麥基因的開放閱讀框(ORF)長度相等, 均為1947 bp, 并且不同物種基因所編碼氨基酸均含有3個高度保守的活性結(jié)構(gòu)域, 即NDPNG、RDP和ECID[2]。對增強植物的抗旱和抗寒性起重要作用[2], 但是是如何提高植物抗逆性的機制還不明確。轉(zhuǎn)入冰草基因的黑麥草, 其果聚糖積累量和可溶性總糖含量顯著增加[12]。Knipp和Honermeier[13]報道果聚糖合成酶基因的表達(dá)可能對脯氨酸的積累具有多向性效應(yīng)。Li等[14]報道果聚糖合成酶基因能增強轉(zhuǎn)基因植株氧化脅迫抗性, 降低植株電解質(zhì)滲漏率和丙二醛含量。在逆境脅迫條件下, 可溶性糖和脯氨酸等抗逆重要調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累有利于增強植物對旱脅迫和冷脅迫等的抗性[15-16]。因此, 在非果聚糖積累植物中表達(dá)果聚糖合成相關(guān)基因?qū)Ω牧贾参锟购导翱购跃哂兄匾饬x。

不同物種基因的功能不盡相同, 且的聚合度具有物種特異性[17]。華山新麥草(, 2= 2x = 14, NsNs)是多年生異花授粉植物, 屬禾本科小麥亞家族, 具有早熟、耐旱、抗寒、抗鹽、抗病等優(yōu)異性狀[18]; 簇毛麥(,2=2x=14, VV)是一年生異花授粉植物[19], 屬禾本科小麥亞家族[20], 具有抗旱、抗寒、抗鹽、抗多種病害、分蘗力強、小穗數(shù)多、蛋白質(zhì)含量高等優(yōu)良性狀[20-21]; 大賴草(, 2=4x=28,NsNsXmXm)屬禾本科賴草屬多年生根莖型草本植物, 具有大穗、多花、抗旱、抗寒、抗多種病害及高耐鹽堿性[22]。目前, 關(guān)于果聚糖酶基因的研究主要集中于挖掘來源于細(xì)菌[23]、真菌[24]、植物[25]等的果聚糖合成相關(guān)基因, 并轉(zhuǎn)化非果聚糖植物, 研究轉(zhuǎn)基因植株的果聚糖積累效應(yīng)、相關(guān)生理生化指標(biāo)及非生物脅迫抗性等。本研究從華山新麥草、簇毛麥和大賴草中分別克隆基因, 比較序列間結(jié)構(gòu)差異, 并在轉(zhuǎn)基因煙草中初步驗證該基因的抗逆功能, 以期為深入研究不同來源基因在干旱和寒冷逆境中的作用, 以及利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)制抗逆作物新種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 cDNA全長克隆

1.1.1保守區(qū)的克隆 將華山新麥草、簇毛麥和大賴草材料種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗地(陜西楊凌), 用總RNA提取試劑盒(RNeasy Plant Mini kit, Qiagen, Germany)從葉片中提取總RNA。使用SuperScript III Reverse Transcriptase cDNA第1鏈合成試劑盒(Invitrogen)合成cDNA第1鏈。參照烏拉爾圖小麥、普通小麥、粗山羊草、大麥和圓錐小麥5種植物的1-FFT蛋白氨基酸保守區(qū)序列設(shè)計1對簡并引物(Dp1-FFTsen: 5′-AYGAYCCNAAYGGN CCNGT-3′, DP1-FFTantisen: 5′-NSWRTCCATRTCR TGNAC-3′; Y=CT, N=ACGT, R=AG), 并用LA(TaKaRa)擴(kuò)增小麥近緣屬植物基因的cDNA中間保守區(qū)。反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性3 min; 94°C變性30 s, 55°C退火30 s, 72°C延伸2 min, 35個循環(huán); 72°C延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收純化目的片段, 與pMD19-T載體(TaKaRa)連接, 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞, 將菌落PCR和質(zhì)粒單雙酶切鑒定正確的5個重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.1.2 3￠端和5￠端序列的克隆 按照3￠-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒和5￠-Full RACE Kit試劑盒(TaKaRa)說明書分別克隆小麥近緣屬植物基因cDNA的3￠和5′端序列, 特異引物序列為GSOP3￠-PDL: 5′-TCCAGTCGATTCCGAG AACG-3′, GSIP3￠-PDL: 5′-TACCCTCCGCATCAAC ACC-3′; GSOP5￠-PDL: 5′-GGTCATCCTGCTCTACA CG-3′, GSIP5￠-PDL: 5′-ATTGGTACGACATCGAG GGC-3′。小麥近緣屬植物不同組織總RNA提取、PCR產(chǎn)物的克隆和測序方法如前所述。

1.2 cDNA編碼區(qū)的獲得及生物信息學(xué)分析

根據(jù)5￠和3￠-RACE的結(jié)果, 并參考小麥基因cDNA序列設(shè)計克隆基因的引物(PDL-1-FFT-F: 5￠-CATGGAGTCGTCACGCGGC ATC-3￠; PDL-1-FFT-R: 5￠-CCGACCGAGCAAACAG TCCATAAC-3￠), 通過PCR法擴(kuò)增基因編碼區(qū)序列, 并測序驗證。

采用National Center for Biotechnology Information (NCBI)網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的在線工具DNAMAN 4.0、MegAlign軟件和多序列比對程序ClustalX2進(jìn)行cDNA序列BLAST分析, 用WebLogo (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi)分析殘基保守性。蛋白質(zhì)1-FFT結(jié)構(gòu)域及核定位信號預(yù)測軟件分別為2ZIP (http://www.expasy.org/)和PSORT II (http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/- psort2.pl)。采用ExPASy proteomics server (http:// www.expasy.ch/tools/dna.html)氨基酸的翻譯工具; 應(yīng)用Conserved Domains數(shù)據(jù)庫分析氨基酸序列的保守區(qū)域; 使用NCBI的ORF Finder (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) 進(jìn)行基因ORF分析, 借助ClustalX2和MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 葉盤法轉(zhuǎn)化煙草及轉(zhuǎn)基因植株的驗證

分別將、和的完整編碼區(qū)序列插入植物表達(dá)載體p1300-35SN的d III-R I位點, 構(gòu)建表達(dá)載體p1300-35SN-(圖1), 通過測序確保目的基因在載體中的插入方向及完整性。采用凍融法[27]將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101 (本實驗室保存), 再利用葉盤法[28]轉(zhuǎn)化煙草W38, 最后將經(jīng)過10 mg L–1潮霉素篩選的抗性植株移入溫室培養(yǎng)。

圖1 植物表達(dá)載體p1300-35SN-Ph-1-FFT/Dv-1-FFT/Lr-1-FFT示意圖

LB和RB: T-DNA的左、右邊界; 35S￠: CaMV 35S poly A; 35S2: 含雙增強子的CaMV 35S啟動子; p35S1: CaMV 35S啟動子; Tnos: 終止子。

LB and RB: left and right border of T-DNA; 35S￠: CaMV 35S poly A; p35S2: CaMV 35S promoter with double enhancer sequences; p35S1: CaMV 35S promoter; Tnos: terminator.

采用CTAB法提取煙草葉片基因組DNA, 利用特異引物1-FFT (F: 5￠-CATGGAGTCGTCACGC GGCATC-3￠; R: 5￠-CCGACCGAGCAAACAGTCCA TAAC-3￠)進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 檢測目的基因。反應(yīng)條件為94°C 5 min; 94°C 30 s, 60°C 30 s, 72°C 2 min, 35個循環(huán); 72°C 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠電泳、染色并照相。

為了分析不同來源基因在RNA水平的表達(dá)情況, 對PCR陽性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析。按前述方法提取煙草總RNA, 并合成cDNA第1鏈。以測試煙草葉片cDNA為模板, 首先以煙草基因特異引物(ActF: 5￠-TGGCATCATACCTTTTACA A-3￠; ActR: 5￠-TCCGGGCATCTGAACCTCT-3￠)對各樣本進(jìn)行擴(kuò)增, 根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果調(diào)整模板濃度, 以使模板cDNA濃度均一化。反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性3 min; 94°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 30 s, 35個循環(huán); 72°C延伸10 min。然后用基因的特異引物(Rp1-FFT-F: 5￠-GCATCATCATCGGCTCCAA-3￠; Rp1- FFT-R: 5￠-TCGTCAAGCTCCACCGTTCT-3￠)進(jìn)行半定量RT-PCR分析, 反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性3 min; 94°C 45 s, 55°C 35 s, 72°C 30 s, 35個循環(huán); 72°C延伸10 min。重復(fù)3次。

1.4 轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱及抗寒性分析

按He等[26]、賀曉嵐等[27]描述的方法鑒定轉(zhuǎn)基因植株的抗旱和抗寒性。選擇基因表達(dá)量相對較高的T0代植株, 采集逆境脅迫前及干旱脅迫(20 d)或冷脅迫(10°C 10 d或–20°C 5 min)后T0植株和對照植株的葉片, 用蒽酮比色法測定可溶性糖含量[28], 用茚三酮法測定脯氨酸含量[29], 用植物丙二醛測定試劑盒(南京建成)測定丙二醛含量, 并用Plant Fructan Colorimetric Assay Kit (GenMed Scientifics Inc., USA)測定果聚糖含量, 重復(fù)測定4次。

用SAS V8.1軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù), 用檢驗法比較均數(shù)(<0.05), 用OriginPro 2015軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆

以華山新麥草葉片、簇毛麥根、大賴草葉片的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 3個基因的保守區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物均約1300 bp (圖2)。電泳結(jié)果顯示3′端和5′端片段長約450 bp和500 bp, 而測序結(jié)果顯示3′端的片段長度均為448 bp, 華山新麥草和簇毛麥該基因5′端片段長514 bp, 簇毛麥該基因5′端片段長475 bp (圖2)。通過PCR擴(kuò)增獲得3條約2000 bp的全長cDNA序列(圖2)?；厥漳康钠? 測序結(jié)果證明3個片段為、和的編碼區(qū)。

2.2 基因序列分析

cDNA序列分析表明,和的ORF長度相等, 均為1989 bp;的ORF為1950 bp, 等電點為4.87~5.00, 分子量預(yù)測為71.3~ 72.2 kD (表1)。經(jīng)Blast比對, 發(fā)現(xiàn)、和基因與普通小麥基因序列相似度分別為86%、85%和91%。與已知序列比對發(fā)現(xiàn),、和均存在3個高度保守的結(jié)構(gòu)域; 與其他植物不同的是,和基因的蔗糖結(jié)合框由“NDPNG”變?yōu)椤癗DPCG”, 但是仍然包含一個活躍的天冬氨酸(D)殘基, 在YECID保守區(qū)包含一個谷氨酸(E)殘基, 在YRDP框包含一個天門冬氨酸(D)殘基(圖3)。Ph-1-FFT和Lr-1-FFT序列相似性最高, 在進(jìn)化樹上聚為一類; Dv-1-FFT與小麥族其他物種的1-FFT序列相似性最高, 在進(jìn)化樹上聚為一類(圖4)。、和的序列相似度高達(dá)96%,除缺失長度為9 nt (5￠-CCTCGGCCG-3￠)和30 nt (5￠-ACGGAGTTCCC GAGGAGCAGGGGCAAGGAC-3￠)的2個序列片段外, 還存在207個單堿基變異, 但這些單堿基變異大多屬同義突變, 未改變編碼蛋白, 即在氨基酸水平上, Dv-1-FFT比Ph-1-FFT和Lr-1-FFT在N端缺失兩處共13個氨基酸。編碼的氨基酸序列與小麥族其他物種編碼的氨基酸序列相似度較高。和與小麥族其他物種編碼的氨基酸序列在N-端差異較大, 但功能區(qū)域較保守。

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的獲得與鑒定

通過葉盤轉(zhuǎn)化法獲得T0代轉(zhuǎn)基因煙草, 經(jīng)抗生素篩選后, 首先利用1-FFT-F/1-FFTR引物進(jìn)行PCR驗證, 共獲得195株陽性植株(圖5-A), 再用Rp1- FFT-F/Rp1-FFT-R引物分析驗證基因表達(dá), 鑒定獲得172株陽性植株。RT-PCR分析結(jié)果顯示,//在轉(zhuǎn)基因煙草中均能正常表達(dá), 而在對照植株中未檢測到轉(zhuǎn)錄信號(圖5-B)。

圖2 華山新麥草、簇毛麥和大賴草1-FFT基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析

M1: DL2000; M2: marker Ш. a: 基因保守區(qū)段擴(kuò)增產(chǎn)物; b: 3￠RACE擴(kuò)增產(chǎn)物; c: 5￠RACE 擴(kuò)增產(chǎn)物; d:(1~3泳道)、(4~6泳道)和(7~9泳道)的cDNA。

M1: DL2000; M2: marker Ш.a: amplification of gene conserved fragment;b: PCR product of 3￠RACE; c: PCR product of 5￠RACE; d: cDNA of(lanes 1–3),(lanes 4–6), and(lanes 7–9).

表1 不同來源1-FFT基因的cDNA及其編碼產(chǎn)物的長度、分子量和等電點比較

(圖3)

圖3 華山新麥草、簇毛麥、大賴草及其他物種1-FFT序列分析

方框顯示序列保守區(qū); 星號(*)表示相同殘基; 冒號(:)表示保守替換; 點號(.)表示半保守替換。比對物種有普通小麥(Ta)、圓錐小麥(Tt)、西爾斯山羊草(As)、烏拉爾圖小麥(Tu)、簇毛麥(Dv)、華山新麥草(Ph)、粗山羊草(AE)、大麥(BA)和大賴草(Lr)。

Conserved regions are boxed. Asterisks (*), colons (:), and periods (.) show the identical residues, conserved substitutions, and semiconserved substitutions, respectively. The 1-FFT sequences were obtained from(Ta),subsp.(Tt),(As),(Tu),(Dv),(Ph),(AE),subsp.(BA), and(Lr).

2.4 轉(zhuǎn)基因煙草逆境脅迫前后表型分析

在正常生長條件下, 轉(zhuǎn)、和基因的煙草植株之間及轉(zhuǎn)基因植株與對照植株的生長無明顯差異。干旱脅迫35 d后, 對照植株全部干枯, 而轉(zhuǎn)基因植株的心葉仍然保持綠色, 轉(zhuǎn)不同來源基因的植株間無明顯差異(圖6-a); 復(fù)水后, 對照植株未能復(fù)活, 而轉(zhuǎn)基因植株在14 d后有少許新葉長出, 轉(zhuǎn)不同來源的基因的植株間生長狀態(tài)無明顯差異。

低溫脅迫處理后, 對照全部枯萎, 而轉(zhuǎn)基因植株心葉仍然保持正常生長勢, 轉(zhuǎn)基因的植株間生長狀態(tài)無明顯差異(圖6-b); 轉(zhuǎn)移至室溫繼續(xù)培養(yǎng)7 d, 對照植株全部死亡, 轉(zhuǎn)基因植株能夠恢復(fù)生長, 只是生長發(fā)育遲緩, 且轉(zhuǎn)不同基因的植株間生長狀態(tài)無明顯差異。

各節(jié)點處數(shù)值表示bootstrap值(迭代1000次)。比對物種為華山新麥草(Ph)、大賴草(Lr)、簇毛麥(Dv)、圓錐小麥(Tt)、西爾斯山羊草(As)、烏拉爾圖小麥(Tu)、普通小麥(Ta)、粗山羊草(AE)和大麥(BA)。

The bootstrap percentages (>50%) are shown next to the branches (based on 1000 replicates). The 1-FFT sequences were obtained from(Ph),(Lr),(Dv),subsp.(Tt) ,(As),(Tu),(Ta),(AE), andsubsp(BA).

2.5 轉(zhuǎn)基因植株逆境脅迫前后生理指標(biāo)分析

正常條件下, 轉(zhuǎn)基因T0植株的果聚糖含量顯著高于對照植株, 轉(zhuǎn)華山新麥草、簇毛麥和大賴草基因植株的果聚糖含量分別為5.37~5.52、5.86~6.40和5.40~5.80 mg g–1, 差異不顯著, 而在對照植株中沒有檢測到果聚糖; 轉(zhuǎn)基因植株可溶性糖、脯氨酸的含量均略高于對照植株, 丙二醛的含量略低于對照植株, 未達(dá)顯著差異(圖7)。

干旱脅迫20 d后, 轉(zhuǎn)基因植株的果聚糖含量顯著增加, 轉(zhuǎn)華山新麥草、簇毛麥和大賴草基因植株的果聚糖含量分別為12.84、12.27和12.97 mg g-1, 是脅迫前的2.0~2.2倍, 而在對照植株中沒有檢測到果聚糖; 轉(zhuǎn)基因植株的可溶性糖為0.20%~ 0.21%, 脯氨酸含量為21.94~22.52 μg g-1, 均顯著高于對照植株; 轉(zhuǎn)基因植株的丙二醛含量僅為17.50~ 18.64 nmol g-1, 顯著低于對照植株的28.95~29.64 nmol g-1(圖7)。

與干旱脅迫相似, 冷脅迫后轉(zhuǎn)華山新麥草、簇毛麥和大賴草基因植株的果聚糖含量分別為13.08、13.36和12.96 mg g-1, 是脅迫前的2.0~2.4倍, 而在對照植株中沒有檢測到果聚糖; 轉(zhuǎn)基因植株的可溶性糖和脯氨酸含量也均顯著高于對照植株, 而丙二醛含量(17.31~18.53 nmol g–1)卻顯著低于對照植株(圖7)。

總之, 干旱和冷脅迫后, 轉(zhuǎn)不同來源基因植株中丙二醛的含量略有提高, 而對照植株中丙二醛的含量顯著增加。在脅迫條件下, 轉(zhuǎn)不同來源基因植株中的碳水化合物和脯氨酸含量都顯著高于對照植株, 無論在正常條件還是在脅迫條件下, 轉(zhuǎn)不同來源基因植株之間果聚糖、可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量無顯著差異。

3 討論

3.1 Ph-1-FFT/Dv-1-FFT/Lr-1-FFT基因的cDNA及其編碼氨基酸序列的特征分析

植物中果聚糖合成相關(guān)基因廣泛參與植物抗性逆境脅迫[30]。本研究克隆獲得的3個小麥近緣屬基因與其他物種的相似性在85%以上, 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析表明這3個基因編碼產(chǎn)物屬于GH32家族。簇毛麥1-FFT的氨基酸序列包含NDPNG、RDP和ECID保守結(jié)構(gòu)域; 與其他植物不同, 華山新麥草和大賴草基因的蔗糖結(jié)合框由NDPNG變?yōu)镹DPCG, 表明華山新麥草和大賴草可能屬于基因家族F型的FT類[31]。在1-FFT蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹上, 小麥近緣屬植物1-FFT序列與小麥族其他物種的同源序列處于不同分支, 華山新麥草與大賴草1-FFT序列處于同一分支(圖4)。簇毛麥1-FFT序列與小麥族其他物種1-FFT序列相似度較高, 華山新麥草和大賴草1-FFT序列雖然與小麥族其他物種在N-端差異較大, 但功能區(qū)域相對較保守。因此推測,可能在果聚糖合成路徑中起重要作用, 在進(jìn)化過程中保持著較高的遺傳穩(wěn)定性。

圖5 T0代轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

A: 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定; B: 轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)鑒定。M: D15000 marker; P: 陽性對照(質(zhì)粒); WT: 陰性對照; NT: 轉(zhuǎn)空載體的陰性對照; 1~12: 轉(zhuǎn)基因植株。

A: PCR analysis of transgenic plants; B:expression patterns ofgene; M: D15000 marker; P: positive control (plasmid); WT: negative control plants; NT: negative control (non-transgenic plants); 1–12: T0-tobacco transgenic plants.

圖6 轉(zhuǎn)華山新麥草(Ph)、簇毛麥(Dv)和大賴草(Lr) 1-FFT基因煙草干旱和冷脅迫后的表型

a: 干旱脅迫處理35 d后; b: 冷脅迫(10°C 10 d, –20°C 35 min)處理后轉(zhuǎn)移至溫室培養(yǎng)7 d。NT為轉(zhuǎn)空質(zhì)粒對照。

a:after thirty-five days of drought stress; b: recovery growth at room temperature for seven days after cold stress (10°C for 10 days and –20°C for 35 min). NT indicates the non-transgenic tobacco plant.

圖7 轉(zhuǎn)華山新麥草(Ph)、簇毛麥(Dv)和大賴草(Lr) 1-FFT基因煙草干旱和冷脅迫后的生理指標(biāo)變化

NT為轉(zhuǎn)空質(zhì)粒對照。在相同條件下, 誤差線上不同字母表示4類轉(zhuǎn)基因植株間差異顯著(< 0.05)。

NT indicates the non-transgenic tobacco plant. Different letters above the error bars indicate significant difference among the four types of transgenic plants (< 0.05).

華山新麥草和大賴草基因的cDNA序列長度相等, 但其推導(dǎo)氨基酸存在較大序列差異, 暗示華山新麥草和大賴草基因的cDNA序列差異較大, 因此推測大賴草的可能來自Xm基因組。另外, 本研究克隆的小麥近緣屬植物基因與Gao等[11]從小麥族中分離到的多個基因cDNA序列長度不等, 說明本研究克隆的小麥近緣屬植物基因可能是該家族的新基因。

3.2 Ph-1-FFT、Dv-1-FFT和Lr-1-FFT表達(dá)對轉(zhuǎn)基因煙草果聚糖含量和抗逆性的影響

Suárez-González等[30]報道,或基因在龍舌蘭中表達(dá)可以提高其對逆境脅迫的抗性, 說明基因?qū)μ岣咦魑锟鼓嫘云鹨欢ㄗ饔?。本研究? 在干旱和寒冷脅迫后, 轉(zhuǎn)不同材料煙草植株表現(xiàn)出明顯高于對照植株的抗逆性, 轉(zhuǎn)基因植株葉片的平均果聚糖含量為5.40~5.86 mg g–1, 逆境脅迫后, 轉(zhuǎn)不同來源基因植株的果聚糖含量顯著增加, 提高植株的抗旱、抗寒性, 這些結(jié)果與前人報道[2, 32]相似。

可溶性糖含量增加對提高植物活性氧清除能力有重要作用[33], 脯氨酸含量也與抗逆性密切相關(guān)。無論在逆境脅迫前或逆境脅迫后, 轉(zhuǎn)不同來源的陽性植株, 葉片中可溶性糖和脯氨酸含量均高于對照植株, 說明不同來源的基因均能提高植株的抗旱、抗寒性。碳水化合物代謝的改變可能對脯氨酸的積累起誘導(dǎo)作用[13], 但二者之間的關(guān)系很復(fù)雜, 其機制有待深入研究。

通過對轉(zhuǎn)基因煙草丙二醛含量的測定, 發(fā)現(xiàn)正常條件下轉(zhuǎn)基因植株丙二醛含量較對照植株略低; 干旱和冷脅迫后, 對照的丙二醛含量顯著增加, 轉(zhuǎn)基因植株略有增加, 顯著低于對照。這表明本研究克隆的3個基因, 在轉(zhuǎn)基因煙草中合成的果聚糖降低了逆境脅迫下的膜脂質(zhì)過氧化程度, 減輕了細(xì)胞膜受損。因為小麥屬果聚糖合成植物, 將外源果聚糖合成相關(guān)基因?qū)胄←準(zhǔn)欠窨梢蕴岣咂淇购岛涂购陨胁磺宄? 但是小麥果聚糖合成相關(guān)基因在水稻中表達(dá)可以使轉(zhuǎn)基因水稻葉片中積累大量的果聚糖, 并且明顯提高轉(zhuǎn)基因水稻苗期的抗寒性[34]。

無論是否存在脅迫條件, 3個不同來源的基因在轉(zhuǎn)入煙草后, 所觀測的生理指標(biāo)均沒有顯著差異, 因此還需設(shè)計新的實驗來比較這3個基因的功能, 如合成果糖成分、參與非生物脅迫過程及生物學(xué)功能等。

4 結(jié)論

通過RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù), 克隆獲得小麥3個近緣屬植物的果聚糖合成相關(guān)基因, 生物信息學(xué)分析表明它們都屬于糖基水解酶第32家族, 在轉(zhuǎn)基因煙草中初步驗證了3個基因能夠顯著提高抗旱和抗寒性。3個不同來源的基因的編碼產(chǎn)物相似度較高, 轉(zhuǎn)入煙草后生理指標(biāo)差異不顯著。

[1] Zhang S J, Song G Q, Li Y L, Gao J, Liu J J, Fan Q Q, Huang C Y, Sui X X, Chu X S, Guo D, Others. Cloning of 9--epoxy-carote- noid dioxygenase gene () from wheat and its heterologous expression in tobacco., 2014, 58: 89–98

[2] Bie X M, Wang K, She M Y, Du L, Zhang S X, Li J R, Gao X, Lin Z S, Ye X G. Combinational transformation of three wheat genes encoding fructan biosynthesis enzymes confers increased fructan content and tolerance to abiotic stresses in tobacco., 2012, 31: 2229–2238

[3] Khoshro H H, Taleei A, Bihamta M R, Shahbazi M, Abbasi A, Ramezanpour S S. Expression analysis of the genes involved in accumulation and remobilization of assimilates in wheat stem under terminal drought stress., 2014, 74: 165–176

[4] Ritsema T, Joling J, Smeekens S. Patterns of fructan synthesized by onion fructan: fructan 6G-fructosyltransferase expressed in tobacco BY2 cells-is fructan: fructan 1-fructosyltransferase needed in onion?, 2003, 160: 61–67

[5] Van den Ende W, Clerens S, Vergauwen R, Boogaerts D, Le Roy K, Arckens L, Van Laere A. Cloning and functional analysis of a high DP fructan: fructan 1-fructosyl transferase from(Asteraceae): comparison of the native and recombinant enzymes., 2006, 57: 775–789

[6] 胡翠. 果糖基轉(zhuǎn)移酶融合基因轉(zhuǎn)化玉米胚乳中果聚糖的積累. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 四川成都, 2009 Hu C. Fructan Accumulation in Maize Endosperm Transformed with Fused Fructosyltransferase Genes. MS Thesis of Sichuan Agricultural University, Chengdu, Sichuan, China 2009 (in Chinese with English abstract)

[7] Edelman J, Dickerson A G. The metabolism of fructose polymers in plants: transfructosylation in tubers ofL., 1966, 98: 787–794

[8] Chalmers J, Johnson X, Lidgett A, Spangenberg G. Isolation and characterisation of a sucrose: sucrose 1-fructosyltransferase gene from perennial ryegrass ()., 2003, 160: 1385–1391

[9] Van Den Ende W, Van Wonterghem D, Verhaert P, Dewil E, Van Laere A. Purification and characterization of fructan: fructan fructosyl transferase from chicory (L.) roots., 1996, 199: 493–502

[10] Van den Ende W, Van Laere A, Le Roy K, Vergauwen R, Boogaerts D, Figueiredo-Ribeiro R C, De Carvalho M A M. Molecular cloning and characterization of a high DP fructan: fructan 1-fructosyl transferase from(Asteraceae) and its heterologous expression in., 2005, 125: 419–429

[11] Gao X, She M Y, Yin G X, Yu Y, Qiao W H, Du L P, Ye X G. Cloning and characterization of genes coding for fructan biosynthesis enzymes (FBEs) in Triticeae plants., 2010, 9: 313–324

[12] 張小蕓, 何近剛, 孫學(xué)輝, 吳金霞. 轉(zhuǎn)果聚糖合成關(guān)鍵酶基因多年生黑麥草的獲得及抗旱性的提高. 草業(yè)學(xué)報, 2011, 20(1): 111–118 Zhang X Y, He J G, Sun X H, Wu J X. Transformation ofwith a fructan:fructan 1-fructosyltransferase gene fromand enhancement of drought tolerance in transgenic plants., 2011, 20(1): 111–118 (in Chinese with English abstract)

[13] Knipp G, Honermeier B. Effect of water stress on proline accumulation of genetically modified potatoes (L.) generating fructans., 2006, 163: 392–397

[14] Li H J, Yang A F, Zhang X C, Gao F, Zhang J R. Improving freezing tolerance of transgenic tobacco expressing sucrose: sucrose 1-fructosyltransferase gene from., 2007, 89: 37–48

[15] Ruelland E, Vaultier M, Zachowski A, Hurry V. Cold signalling and cold acclimation in plants. In: Jacquot J, Delseny M, eds. Advances in Botanical Research, Salt Lake City: Academic Press, 2009. pp 35–150

[16] Szabados L, Savouré A. Proline: a multifunctional amino acid., 2010, 15: 89–97

[17] Hellwege E M, Raap M, Gritscher D, Willmitzer L, Heyer A G. Differences in chain length distribution of inulin fromandare reflected in a transient plant expression system using the respectivecDNAs., 1998, 427: 25–28

[18] 陳漱陽, 張安靜, 傅杰. 普通小麥與華山新麥草的雜交. 遺傳學(xué)報, 1991, 18: 508–512 Chen S Y, Zhang A J, Fu J. The hybridization betweenand., 1991, 18: 508–512 (in Chinese with English abstract)

[19] Zhang W, Zhang R, Feng Y, Bie T, Chen P. Distribution of highly repeated DNA sequences inand its application in the identification of alien chromatin., 2013, 58: 890–897

[20] 劉成. 多年生簇毛麥基因組新重復(fù)序列的分離及其在小麥抗病新種質(zhì)鑒定中的應(yīng)用. 電子科技大學(xué)博士學(xué)位論文, 四川成都, 2010 Liu C. Isolate New Repetitive DNA Sequence from Daypyrum breviaristatum Genome and Its Application in Identifying New Resistant Wheat Germplasm. PhD Dissertation of Electronic Science and Technology of China, Chengdu, Sichuan, China 2010 (in Chinese with English abstract)

[21] De Pace C, Snidaro D, Ciaffi M, Vittori D, Ciofo A, Cenci A, Tanzarella O A, Qualset C O, Mugnozza G S. Introgression ofchromatin into common wheat improves grain protein quality., 2001, 117: 67–75

[22] Mcguire P E, Dvorak J. High salt-tolerance potential in wheatgrasses., 1981, 21: 702–705

[23] Pilon-Smits E A, Ebskamp M J, Paul M J, Jeuken M J, Weisbeek P J, Smeekens S C. Improved performance of transgenic fructan-accumulating tobacco under drought stress., 1995, 107: 125–130

[24] Heyer A G, Wendenburg R. Gene cloning and functional characterization by heterologous expression of the fructosyltransferase ofIAM 2544., 2001, 67: 363–370

[25] Chen H, Nelson R S, Sherwood J L. Enhanced recovery of transformants ofafter freeze-thaw transformation and drug selection., 1994, 16: 664–668

[26] He X L, Chen Z Z, Wang J W, Li W X, Zhao J X, Wu J, Wang Z H, Chen X H. A sucrose:fructan-6-fructosyltransferase () gene fromconfers abiotic stress tolerance in tobacco., 2015, 570: 239–247

[27] 賀曉嵐, 王建偉, 李文旭, 陳真真, 趙繼新, 武軍, 王中華, 陳新宏. 大賴草基因的克隆及其轉(zhuǎn)基因煙草抗旱和抗寒性分析. 作物學(xué)報, 2016, 42: 389–398 He X L, Wang J W, Li W X, Chen Z Z, Zhao J X, Wu J, Wang Z H, Chen X H. Cloning of 6-SFT gene fromand analysis of tolerance to drought and cold stresses in transgenic tobacco., 2016, 42: 389–398 (in Chinese with English abstract)

[28] Fales F W. The assimilation and degradation of carbohydrates by yeast cells., 1951, 193: 113–124

[29] Bates L S, Waldren R P, Teare I D. Rapid determination of free proline for water-stress studies., 1973, 39: 205–207

[30] Suárez-González E M, López M G, Délano-Frier J P, Gómez-Leyva J F. Expression of theandgenes and consequent fructan accumulation inandis differentially induced by diverse (a)biotic-stress related elicitors., 2014, 171: 359–372

[31] Lasseur B, Schroeven L, Lammens W, Le Roy K, Spangenberg G, Manduzio H, Vergauwen R, Lothier J, Prud’Homme M P, Van den Ende W. Transforming a fructan:fructan 6G-fructosyltransferase from perennial ryegrass into a sucrose:sucrose 1-fructosyltrans-ferase., 2009, 149: 327–339

[32] Chazen O, Neumann P M. Hydraulic signals from the roots and rapid cell-wall hardening in growing maize (L.) leaves are primary responses to polyethylene glycol-induced water deficits., 1994, 104: 1385–1392

[33] Ravikumar G, Manimaran P, Voleti S R, Subrahmanyam D, Sundaram R M, Bansal K C, Viraktamath B C, Balachandran S M. Stress-inducible expression oftranscription factor greatly improves drought stress tolerance in transgenicrice., 2014, 23: 421–439

[34] Kawakami A, Sato Y, Yoshida M. Genetic engineering of rice capable of synthesizing fructans and enhancing chilling tolerance., 2008, 59: 793–802

Molecular Cloning and Functional Analysis ofin Wheat Relatives

WANG Jian-Wei1, HE Xiao-Lan1,*, LI Wen-Xu3, and CHEN Xin-Hong2

1School of Life and Health Science, Kaili University, Kaili 556011, Guizhou, China;2Shaanxi Provincial Key Laboratory of Plant Genetic Engineering Breeding / College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi, China;3Wheat Research Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, Henan, China

Fructan is closely related to carbon distribution and the response to adverse stresses in plant, protecting plant cell membrane stabilization in stress conditions. To determine the effects of fructan:fructan-1-fructosyltransferase genes from different species, we cloned three genes of full-length cDNA from(2= 2x = 14, NsNs),(2= 2x = 14, VV) and(2= 4x = 28, NsNsXmXm), designated,, and, respectively, usingreverse transcriptase PCR (RT-PCR) and rapid-amplification of cDNA ends (RACE) techniques. The full-length open reading frames (ORF) are 1989, 1950, and 1989 bp in length, encoding 662, 649, and 662 amino acids, respectively. The predicted protein contains a conserved fructosyltransferase domain. Multiple sequences alignment and phylogenetic analysis indicated that the Dv-1-FFT shared a high similarity with 1-FFT from,subsp.,and, Ph-1-FFT and Lr-1-FFTwere clustered into the same evolutionary branch, which was different from those of Dv-1-FFT. Furthermore, the plant expression vector pCAMBIA1300-35SN-was constructed and transferred into tobacco () cv. W38 via-mediated transformation. The validation with PCR and RT-PCR assay showed that drought and cold tolerance was obviously improved in all types of transgenic tobacco compared with the wild type, and no significant difference between transgenic genotypes. Under drought and cold stresses, the contents of carbohydrate and proline were significantly higher in the transgenic tobacco lines than in the wild type, whereas, malondialdehyde content was significantly lower in the transgenic lines, which was no significant difference between the transgenic plants withfrom different species. These results suggest that,, andare typical members of the gene family coding glycoside hydrolase 32 (GH32) and play a role in drought and cold resistance in tobacco.

gene; drought tolerance; cold tolerance; wheat relatives; transgenic tobacco

2017-08-26;

2018-03-26;

2018-04-08.

10.3724/SP.J.1006.2018.00814

賀曉嵐, E-mail: helingzhi123@126.com

E-mail: agan1982@126.com

本研究由凱里學(xué)院博士專項基金(BS201606)和貴州省教育廳科技拔尖人才支持計劃項目(黔教合KY字[2017]094)資助。

This study was supported by the Special Fund for the Doctoral Program of Kaili University (BS201606) and the Science and Technology Top Talents Support Program of Guizhou Provincial Education Department (Guizhou Education KY [2017]094).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180408.0718.002.html