楊 杰 陳曉云 郭玉茹 高 翔 田春蓮 劉明春

(沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，沈陽 110866)

苘麻(AbutilontheophrastiMedic.)為錦葵科苘麻屬植物苘麻的全草或葉[1]，具有清熱利濕，解毒開竅之功效，常用于痢疾、中耳炎、耳鳴、耳聾、化膿性扁桃體炎和癰疽腫毒等疾病的治療。苘麻中含有黃酮、多酚、鞣質(zhì)、有機酸等化學成分。目前關于苘麻黃酮和多酚的研究較多，但鞣質(zhì)的相關研究鮮有報道。鞣質(zhì)類成分具有較好的收斂作用，可以用于潰瘍、腹瀉、創(chuàng)傷、灼傷等的治療[2]。此外，鞣質(zhì)還有局部止血、抑菌抗炎、抗病毒、抗氧化、抗變態(tài)反應、抗炎、驅(qū)蟲、降血壓等作用[3-8]。近年來，隨著畜牧業(yè)集約化和規(guī)?；陌l(fā)展，氧化應激給畜禽帶來的危害日益嚴重[9]；此外，隨著人工合成抗氧化劑副作用報道的不斷增加，天然抗氧劑逐漸引起了相關研究者的關注。本試驗以苘麻葉為研究對象，采用超聲波輔助提取方法結合單因素試驗和響應面試驗考察了總鞣質(zhì)的提取工藝，并評價了其抗氧化活性，以期為天然抗氧劑的研究和開發(fā)奠定一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

苘麻葉采收自吉林省通榆縣開通鎮(zhèn)，采收后清洗干凈，置陰涼處自然干燥，保存?zhèn)溆谩?/p>

沒食子酸標準品購自中國藥品生物制品檢定所(批號：110831—200302)。

鎢酸鈉購于天津市瑞金特化學品有限公司；鉬酸鈉、硫酸鋰購自天津市博迪化工股份有限公司；干酪素購自北京奧博星生物技術有限責任公司；其他分析試劑購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品溶液的制備

精確稱取藥材粉末0.5 g置于100 mL三角瓶中，加入溶劑，與樣本混合；不同條件下超聲提取；冷卻靜置(每個樣品提取2次)，過濾，合并2次濾液，離心，濃縮至近干，加水溶解并稀釋至10 mL。

1.2.2 單因素試驗

單因素試驗考察提取時間、液料比和丙酮濃度3個因素對苘麻葉總鞣質(zhì)提取效果的影響，以苘麻葉總鞣質(zhì)提取率為考察指標，分別考察3個因素的不同水平。各因素的考察水平如下：提取時間(10、15、20、25、30 min)、液料比(10.00、15.00、20.00、25.00、30.00 mL/g)、丙酮濃度(20%、40%、60%、80%、100%)[10]。考察任一因素對苘麻葉總鞣質(zhì)提取率的影響時，其他2個因素置于中間水平(提取時間20 min、液料比20.00 mL/g、丙酮濃度60%)，每個試驗平行3次。

1.2.3 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，采用Design expert 8.0統(tǒng)計軟件，進行響應面試驗設計及分析。根據(jù)響應面試驗設計原理，選取丙酮濃度(A)、液料比(B)和提取時間(C)3個因素為自變量，以苘麻葉總鞣質(zhì)提取率為考察指標。

1.2.4 苘麻葉總鞣質(zhì)的含量測定

1.2.4.1 沒食子酸標準曲線的制作

參考《中華人民共和國獸藥典》附錄135《鞣質(zhì)含量測定法》[11]，配制0.05 mg/mL的沒食子酸標準液，并繪制吸光度(A)與濃度(c)的標準曲線，得到以下回歸方程：

A=0.170 9c+0.001 1(r=0.999 9)。

結果表明，鞣質(zhì)在1～10 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

1.2.4.2 鞣質(zhì)的含量測定

參考《中華人民共和國獸藥典》附錄135《鞣質(zhì)含量測定法》[11]，按照以下公式計算苘麻葉總鞣質(zhì)含量：

苘麻葉總鞣質(zhì)含量=總酚量-不被吸附的多酚量。

1.2.5 苘麻葉總鞣質(zhì)體外抗氧化試驗

1.2.5.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力測定

參考Tian等[12]的方法，同時做適當?shù)男薷?，?17 nm處測定其吸光度值，同時取100 μL蒸餾水，加900 μL DPPH工作液，37 ℃混勻，避光反應30 min，517 nm處測定其吸光度值。同時以2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)作為陽性對照，按照以下公式計算自由基清除率：

清除率(%)=[1-(AS-A0)/AC]×100。

式中：AS為待測樣本吸光值，A0為空白樣本吸光值，AC為DPPH工作液吸光值，清除率越大表明抗氧化能力越強。

清除率達50%時的DPPH自由基濃度為DPPH自由基半數(shù)清除濃度(IC50DPPH)。

1.2.5.2 2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基清除能力測定

參考Tian等[12]的方法，在734 nm處測定其吸光度值；同時精確量取100 μL蒸餾水，加入900 μL ABTS工作液，室溫下避光反應30 min，734 nm處測定其吸光度值，同時以BHT作為陽性對照，自由基清除率計算方法及公式參考1.2.5.1。清除率達50%時的ABTS自由基濃度為ABTS自由基半數(shù)清除濃度(IC50ABTS)。

1.2.5.3 鐵離子還原/抗氧化能力(FRAP)的測定

參考Olszowy等[13]的方法，于593 nm 處測定吸光度值。FRAP以每1 μg/mL樣品達到同樣吸光度值所需的硫酸亞鐵(FeSO4)的物質(zhì)的量[mmol/(μg·mL)]表示，樣品的FRAP越大表示其抗氧化活性越高。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Design expert 8.0軟件分析響應面試驗數(shù)據(jù)；采用SPSS 17.0軟件中的方差分析(ANOVA)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 丙酮濃度對苘麻葉總鞣質(zhì)提取率的影響

由圖1可以看出，隨著丙酮濃度的提高，苘麻葉總鞣質(zhì)的提取率增加，當丙酮濃度為80%時，總鞣質(zhì)的提取率最高，繼續(xù)提高丙酮的濃度，提取率反而下降。故丙酮濃度選擇80%較為理想。

2.1.2 液料比對苘麻葉總鞣質(zhì)提取率的影響

由圖1可以看出，隨著液料比的增加，苘麻葉總鞣質(zhì)提取率隨之上升，當液料比為15.00 mL/g時總鞣質(zhì)提取率最高，液料比繼續(xù)增加時總鞣質(zhì)提取率轉(zhuǎn)而下降。因此，液料比選擇15.00 mL/g較為適宜。

2.1.3 提取時間對苘麻葉總鞣質(zhì)提取率的影響

由圖1可以看出，隨著超聲時間的增加，苘麻葉總鞣質(zhì)提取率逐漸上升，超聲時間為 15 min 時總鞣質(zhì)提取率最高，之后總鞣質(zhì)提取率隨超聲時間的增加反而下降。因此，超聲時間選擇15 min較合適。

丙酮濃度橫坐標1、2、3、4、5分別為20%、40%、60%、80%、100%；液料比橫坐標1、2、3、4、5分別為10.00、15.00、20.00、25.00、30.00 mL/g；提取時間橫坐標1、2、3、4、5分別為10、15、20、25、30 min。

Numbers 1, 2, 3, 4 and 5 in abscissa for concentration of acetone solution represented 20%, 40%, 60%, 80% and 100%， those for ratio of solvent to material represented 10.00, 15.00, 20.00, 25.00 and 30.00 mL/g, and those for extraction time represented 10， 15， 20， 25 and 30 min.

圖1丙酮濃度、液料比和提取時間對苘麻葉總鞣質(zhì)提取率的影響

Fig.1 Effects of concentration of acetone solution, ratio of solvent to material and extraction time on the yield of TTE fromAbutilontheophrastiMedic. leaves

2.2 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，采用Design expert 8.0統(tǒng)計軟件，根據(jù)響應面試驗設計原理，選取丙酮濃度、液料比和提取時間3個因素為自變量，丙酮

濃度分別為70%、80%、90%，料液比分別為10、15、20 mL/g，提取時間分別為10、15、20 min。以苘麻葉總鞣質(zhì)提取率為響應值，進行試驗設計及響應面分析。利用Design expert 8.0軟件得出的試驗設計及響應值見表1。

利用Design expert 8.0軟件對表1中試驗所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，各因素經(jīng)回歸擬合后，獲得以苘麻葉總鞣質(zhì)提取率為目標函數(shù)Y的二次多項回歸方程如下：

Y(%)=1.07-0.15A+0.022B+0.040C-0.005AB+ 0.015AC+0.01BC+0.29A2-0.38B2+0.18C2。

式中：A為丙酮濃度(%)；B為液料比(mL/g)；C為提取時間(min)。

表1 響應面試驗設計及響應值

續(xù)表1試驗號 Test No.自變量水平 Independent variable levelsABC響應值 Response118015151.08129015101.38137015201.75149010150.81159015201.43168020100.85178015151.07

A：丙酮濃度 concentration of acetone solution(%)；B：液料比 ratio of solvent to material(mL/g)；C：提取時間 extraction time(min)。表2同 The same as Table 2。

表2 響應面試驗結果方差分析

P<0.05表示作用顯著,P<0.01為作用極顯著。

P<0.05 indicates significant effect, andP<0.01 indicates extremely significant effect.

采用Design expert 8.0軟件繪制所得響應面和等高線圖。由圖2-Ⅰ可以看出，在提取時間一定的條件下，當丙酮濃度保持不變時，提取率隨著液料比的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在液料比15.50 mL/g時達到最大值；當液料比不變時，提取率隨丙酮濃度增加先降低后升高，在丙酮濃度70%時達到最大值。但丙酮濃度與液料比的交互作用對提取率影響不顯著(P>0.05)。由圖2-Ⅱ可以看出，在液料比一定的條件下，當丙酮濃度保持不變時，提取率隨著提取時間的增長先下降后升高，在提取時間20 min時達到最大值；提取時間不變時，提取率隨丙酮濃度增加先降低后上升，在丙酮濃度72%時達到最大值。不過由于等高線比較平緩，丙酮濃度與提取時間的交互作用對提取率影響顯著性較低(P<0.05)。由圖2-Ⅲ可以看出，當丙酮濃度保持不變時，若液料比一定，提取率隨著提取時間的增長呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，在提取時間20 min時達到最大值；若提取時間一定，提取率隨丙酮濃度增加先上升后降低，在液料比15.00 mL/g時達到最大值。但液料比與提取時間的交互作用對提取率影響不顯著(P>0.05)。

A：丙酮濃度concentration of acetone solution(%) ；B：液料比 ratio of solvent to material(mL/g) ；C：提取時間 extractiontime(min) 。

圖2丙酮濃度與液料比(Ⅰ)、丙酮濃度與提取時間(Ⅱ)及液料比與提取時間(Ⅲ)對苘麻葉總鞣質(zhì)提取率的交互作用

Fig.2 Interation of ratio of concentration of acetone solution and ratio of solvent to material (Ⅰ), concentration of acetone solution and extraction time (Ⅱ), and solvent to material and extraction time (Ⅲ) on the yield of TTE fromAbutilontheophrastiMedic. leaves

2.3 最佳工藝條件的確定與驗證

由Design expert 8.0軟件確定的苘麻葉總鞣質(zhì)最優(yōu)提取工藝為：丙酮濃度70%，液料比15.25 mL/g，提取時間20 min，模型預測的提取率為1.76‰。為了驗證上述模擬最佳試驗方案的準確性和提高試驗結果的穩(wěn)定性，將上述得到的最佳處理組合進行了驗證試驗，平行3次，平均提取率為1.77‰，實際值與預測值的偏差為0.568%，表明其相關性良好，說明對苘麻葉總鞣質(zhì)的提取進行響應面法優(yōu)化合理可行。在最佳工藝條件下，同年8月份、9月份和10月份采收的苘麻葉總鞣質(zhì)的含量分別為(1.41±0.05)‰、(1.77±0.03)‰和(1.49±0.03)‰。

2.4 抗氧化試驗

苘麻葉總多酚、不被吸附的多酚、總鞣質(zhì)含量及其抗氧化試驗結果分別見表3。由表可知，8月份、9月份、10月份采收的苘麻葉總鞣質(zhì)IC50ABTS分別為0.84、0.51、0.35 μg/mL，均低于BHT陽性對照的2.25 μg/mL；同時，DPPH清除試驗和FRAP試驗結果表明，3個月份采收的苘麻葉總鞣質(zhì)的IC50DPPH均低于BHT陽性對照，F(xiàn)RAP均高于BHT陽性對照。此外，苘麻葉總多酚和不被吸附的多酚的抗氧化活性也較為理想。結果提示，苘麻葉總多酚、不被吸附的多酚和總鞣質(zhì)均具有較好的抗氧化活性，并且在不同時間采收其抗氧化活性不同，可能與其化學成分種類和含量有關，需待今后的試驗進一步驗證。

2.5 總鞣質(zhì)含量與氧化活性的相關性分析

由表4可以看出，苘麻葉中總多酚的含量與DPPH法測定其抗氧化活性的相關性顯著(P<0.05)。由表5可以看出，苘麻葉中不被吸附的多酚含量與FRAP法檢測其抗氧化活性的相關性極顯著(P<0.01)。由表6可以看出，苘麻葉中總鞣質(zhì)的粗提物含量與不同方法測定的抗氧化活性的相關性大小為FRAP>ABTS>DPPH，總鞣質(zhì)含量與不同方法測定的抗氧化活性的相關性大小為DPPH>ABTS>FRAP。結果提示，不同種類化合物的抗氧化活性不同，對不同自由基的清除能力或還原能力所有差別。因此，為了客觀正確的評價抗氧化活性，要同時選擇多種抗氧化活性測定方法。

表3 苘麻葉總多酚、不被吸附的多酚和總鞣質(zhì)含量及其抗氧化試驗結果

表4 苘麻葉中總多酚含量與不同方法測定的抗氧化活性的相關性

ABTS:2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽；DPPH:1,1-二苯基-2-三硝基苯肼；FRAP:鐵離子還原/抗氧化能力。*表示顯著相關(P<0.05)，**表示極顯著相關(P<0.01)。下表同。

ABTS:2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)； DPPH: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl； FRAP: ferric ion reducing antioxidant power. * means significant correlation (P<0.05), and ** means extremely significant correlation (P<0.01). The same as below.

3 討 論

3.1 苘麻葉總鞣質(zhì)提取工藝的優(yōu)化

鞣質(zhì)類化合物結構中具有較多的羥基，穩(wěn)定性較差，且其分子質(zhì)量較大，給提取分離工作帶來了一定的難度。因此，優(yōu)化鞣質(zhì)的提取工藝對實際生產(chǎn)應用具有重要指導意義[14]。本研究采取單因素試驗和響應面試驗結合超聲提取的方法優(yōu)化了苘麻葉總鞣質(zhì)的提取工藝，并獲得了最佳提取工藝。

表5 苘麻葉中不被吸附多酚含量和不同方法測定的抗氧化活性的相關性

表6 苘麻葉中總鞣質(zhì)含量與不同方法測定的抗氧化活性的相關性

3.2 苘麻葉總鞣質(zhì)體外抗氧化活性研究

鞣質(zhì)由于具有較多的酚羥基，故具有較好的清除自由基功能[15]。本試驗采用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法、FRAP測定法檢測苘麻葉總多酚、不被吸附的多酚和總鞣質(zhì)體外抗氧化水平，結果顯示三者均具有較強的抗氧化活性。

3.3 苘麻葉總鞣質(zhì)的含量和抗氧化活性與采收時間的關系

研究表明，中藥在不同時間采收直接影響其中的活性物質(zhì)的產(chǎn)量、品質(zhì)和提取率[16]。本試驗對相同年份不同月份的苘麻葉總鞣質(zhì)進行了提取，并考察了其體外抗氧化水平，結果顯示，同年不同月份采收的苘麻葉總鞣質(zhì)含量高低次序是9月份>10月份>8月份。ABTS自由基清除法和FRAP測定法測定結果揭示8月份、9月份、10月份的苘麻葉總鞣質(zhì)抗氧化活性逐漸增強，DPPH自由基清除試驗結果則顯示不同月份苘麻葉總鞣質(zhì)的抗氧化活性次序是9月份>10月份>8月份。故應根據(jù)具體用途，選擇苘麻葉的最佳采收時間。

4 結 論

① 本試驗建立的苘麻葉總鞣質(zhì)最佳提取工藝條件為：丙酮濃度70%、液料比15.25 mL/g、提取時間20 min。在此條件下，8月份、9月份和10月份采收的苘麻葉總鞣質(zhì)的含量分別為(1.41±0.05)‰、(1.77±0.03)‰和(1.49±0.03)‰。

② DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法、FRAP測定法等體外抗氧化試驗結果表明，苘麻葉總鞣質(zhì)具有良好的抗氧化活性。

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