劉蘭，黃家宇，陳俊，母艷華，周賢霞，潘柳岑，郭雨柔，李莉（貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽550025）

赤脛散（Polygonum runcinatum）為蓼科蓼屬植物，廣泛分布于貴州、四川、湖南等多個省份，為民間常用藥；其以根及全草入藥，性寒，味苦、澀，具有清熱解毒、活血止血等功效，主治急性胃腸炎、月經(jīng)不調(diào)和跌打損傷等[1]。目前對赤脛散的研究報道主要集中在質(zhì)量研究方面[2-4]，雖也有文獻(xiàn)報道其具有體外菌活性[5-6]，但缺乏系統(tǒng)研究。為了進(jìn)一步明確赤脛散的體外抑菌作用，本研究根據(jù)赤脛散的民間用法并參考文獻(xiàn)5]選擇水和95%乙醇為提取溶劑，篩選得體外抑菌效果更好的95%乙醇提取物作為試驗對象；同時，考察95%乙醇提取物的乙酸乙酯及正丁醇萃取部位的抑菌活性，進(jìn)一步明確赤脛散的抑菌活性部位。本文旨在為赤脛散的抑菌活性研究和藥材資源的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

SW-CJ-1FD型凈化工作臺（廣州瑞智科學(xué)儀器公司）；AUY120型電子天平（日本島津公司）；GH-500隔水式培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）。

1.2 藥品、試劑與培養(yǎng)基

氯霉素原料藥（上海源葉生物科技有限公司，批號：Y27N6C6020，純度：98%）；氟康唑原料藥（北京索萊寶科技有限公司，批號：1127A031，純度：98%）；95%乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亞砜（DMSO）等均為分析純，水為蒸餾水。

水解酪蛋白（M-H）瓊脂培養(yǎng)基（批號：20160817）、M-H肉湯培養(yǎng)基（批號：20160817）均購自北京索萊寶科技有限公司；沙氏瓊脂培養(yǎng)基（青島尼賽欣合生物技術(shù)有限公司，批號：20151025）；無菌生理鹽水（貴州科倫藥業(yè)有限公司，批號：D17033101）。

1.3 藥材

赤脛散于2015年7月采收自貴州省息烽縣（批號：20150701），經(jīng)由貴州醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室龍慶德教授鑒定為蓼科蓼屬植物（P.runcinatumBuch.-Ham.Var.Sinene Hemsl.）。藥材自然晾干后粉碎為粗粉，室溫儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 標(biāo)準(zhǔn)菌株

傷寒桿菌（CMCC 50037）、金黃色葡萄球菌（ATCC 292131）、大腸埃希菌（ATCC 25922）、福氏志賀氏菌（CMCC 52337）、枯草芽孢桿菌（ATCC 9372）、綠膿桿菌（ATCC 27853）、乙型溶血性鏈球菌（ATCC 19615）、白色念珠菌（ATCC 10231）、新生隱球菌（D 247）均由貴州醫(yī)科大學(xué)感染與免疫學(xué)實驗室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌種的活化及菌懸液的制備

按無菌操作法[7-10]，將各標(biāo)準(zhǔn)菌株接種在相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基上復(fù)蘇（細(xì)菌用M-H瓊脂培養(yǎng)基在37℃條件下培養(yǎng)18～24 h；真菌用沙氏瓊脂培養(yǎng)基在37℃條件下培養(yǎng)24～48 h），轉(zhuǎn)接1次；用滅菌生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝唬藭r菌懸液菌濃度約為1.5×108CFU/mL；再取少量菌懸液，用滅菌生理鹽水稀釋至1.5×106CFU/mL，備用。

2.2 赤脛散提取物及不同極性部位萃取物的體外抑菌作用考察

2.2.1 藥液的制備 （1）水提物藥液：取赤脛散粗粉50 g，以10倍量水充分浸泡過夜后，煎煮3次，每次3 h；減壓抽濾，合并3次濾液，水浴蒸干，得水提物14.85 g。將水提物以無菌生理鹽水溶解，制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL的藥液（按生藥計算相當(dāng)于337 mg/mL），備用。（2）95%乙醇提取物藥液：取赤脛散粗粉50 g，以10倍量95%乙醇回流提取3次，每次3 h；減壓抽濾，合并3次濾液，旋蒸減壓回收乙醇，水浴蒸干，得95%乙醇提取物19.24 g。將該提取物用含10%DMSO的無菌生理鹽水溶解，制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL的藥液（按生藥計算相當(dāng)于260 mg/mL），備用。（3）95%乙醇提取物不同極性萃取部位藥液：取赤脛散95%乙醇提取物適量，用水混懸后，先用乙酸乙酯萃取，剩余藥液用正丁醇萃取。旋蒸減壓回收不同極性溶劑，真空干燥，分別得乙酸乙酯、正丁醇萃取部位8.81、6.59 g。將不同極性萃取部位分別用含10%DMSO的無菌生理鹽水溶解，制備成質(zhì)量濃度均為50 mg/mL的藥液（按生藥計算相當(dāng)于284、379 mg/mL），備用。（4）對照藥液：將氯霉素和氟康唑用無菌生理鹽水溶解，制成質(zhì)量濃度均為300 μg/mL的藥液，備用。試驗前所有藥液均用0.22 μm濾膜過濾除菌。

2.2.2 體外抑菌作用考察 采用管碟法[11-13]進(jìn)行測定。按無菌操作法[7-10]，分別吸取“2.1”項下菌懸液（1.5×108CFU/mL）100 μL至相應(yīng)培養(yǎng)基表面（細(xì)菌用M-H瓊脂培養(yǎng)基，真菌用沙氏瓊脂培養(yǎng)基），用無菌棉簽涂布均勻，室溫下放置2～3 min，等距分散放置滅菌牛津杯（外徑為8 mm，內(nèi)徑為6 mm，高度為10 mm），靜置10～15 min使其固定，向每個牛津杯中加入“2.2.1”項下各藥液100 μL，室溫下放置2 h使藥液擴(kuò)散。每個平板均設(shè)置3個藥液平行組、1個藥物對照組（細(xì)菌用氯霉素、真菌用氟康唑為對照）和1個溶劑對照組（含10%DMSO的無菌生理鹽水）。將各培養(yǎng)皿于37℃培養(yǎng)（細(xì)菌培養(yǎng)18～24 h，真菌培養(yǎng)24～48 h），然后取出觀察抑菌圈并測量直徑。每種菌株平行操作3次。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑＜10 mm為抗藥（可認(rèn)為無抑菌活性），10 mm為輕度敏感，11～15 mm為中度敏感，16～20 mm為高度敏感；抑菌圈直徑越大，則表明待測藥物抑菌作用越強(qiáng)[9]。抑菌圈直徑測定結(jié)果見表1。

由表1可見，赤脛散水提物抑菌圈大多在10 mm臨界值或以下，表明其幾乎無抑菌活性；95%乙醇提取物對除乙型溶血性鏈球菌以外的6種細(xì)菌的抑菌圈均大于10 mm，表明其有抑菌活性，其中對福氏志賀氏菌的抑制作用最強(qiáng)，且對福氏志賀氏菌和傷寒桿菌的抑制作用與對照藥物氯霉素相當(dāng)，但是對2種真菌抑制效果不佳；乙酸乙酯部位對7種細(xì)菌的抑菌圈均大于10 mm，表明其均有不同程度的抑菌作用，且對傷寒桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用最強(qiáng)，但對真菌無抑制作用；正丁醇部位對傷寒桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈均大于10 mm，表明其對這2種細(xì)菌有抑菌作用，但對其他菌株抑制效果不佳。綜合比較，赤脛散不同提取物的抑菌作用強(qiáng)度排序為：乙酸乙酯部位＞95%乙醇提取物＞正丁醇部位＞水提物。本研究進(jìn)一步就赤脛散95%乙醇提取物及其乙酸乙酯、正丁醇部位對6種細(xì)菌的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）進(jìn)行考察。

表1 赤脛散提取物的抑菌圈直徑測定結(jié)果（±s，n＝3，mm）Tab 1 Diameters results of antibacterial circle for the extract from P.runcinatum（±s，n＝3，mm）

表1 赤脛散提取物的抑菌圈直徑測定結(jié)果（±s，n＝3，mm）Tab 1 Diameters results of antibacterial circle for the extract from P.runcinatum（±s，n＝3，mm）

注：“/”為未進(jìn)行試驗；“N”為無抑菌圈Note：“/”means not tested；“N”means no antibacterial circle

樣品水提物95%乙醇提取物乙酸乙酯部位正丁醇部位氯霉素氟康唑細(xì)菌真菌白色念珠菌/N傷寒桿菌10.00±1.41 14.33±1.18 15.87±0.88 12.37±1.59 14.17±1.13/枯草芽孢桿菌10.87±2.65 12.17±0.76 15.87±1.59 10.87±0.88 16.50±1.32/綠膿桿菌N 11.83±1.26 14.00±1.41 8.75±1.06 16.00±0.87/福氏志賀氏菌N 14.50±1.00 15.62±2.65 10.25±0.35 14.00±0.66/金黃色葡萄球菌N 11.25±1.98 12.00±0.35 8.75±2.47 16.75±0.90/大腸埃希菌10.50±0.35 11.83±1.42 11.37±0.18 8.37±1.94 12.67±0.52/乙型溶血性鏈球菌N 9.92±0.95 10.12±0.53 N 13.17±0.76/10.37±1.59 9.00±1.41/13.92±0.63新生隱球菌/9.67±1.26 10.25±0.00 N/14.55±0.64

2.3 赤脛散95%%乙醇提取物及其乙酸乙酯、正丁醇部位對6種細(xì)菌的MIC和MBC測定

2.3.1 MIC 采用微量肉湯稀釋法[9-13]進(jìn)行測定。按無菌操作法[7]，取一次性無菌96孔板（每排12孔），各加入M-H肉湯培養(yǎng)基100 μL，再分別吸取赤脛散95%乙醇提取物及其乙酸乙酯、正丁醇部位藥液100 μL加入第1孔，混勻后吸取100 μL加入第2孔，如此連續(xù)倍比稀釋至第10孔，第10孔中吸取100 μL棄去，此10個孔作為試驗組；第11孔只加培養(yǎng)基和菌液，用以觀察培養(yǎng)基是否適合菌株生長，作為生長對照組；第12孔只加培養(yǎng)基，用以觀察培養(yǎng)基是否被污染，作為培養(yǎng)基對照組。吸取濃度為1.5×106CFU/mL的菌懸液100 μL，依次加入到上述1～11孔中，充分混勻，此時各孔菌濃度均為7.5×105CFU/mL；吸取M-H肉湯培養(yǎng)基100 μL加入到第12孔中，充分混勻。將96孔板加蓋置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后，取出觀察菌株生長情況。在黑色背景光源下，若與生長對照孔中生長特性相同（如肉湯渾濁或孔底出現(xiàn)渾濁），則判斷為有菌生長[9-10]。以無菌生長試驗孔所對應(yīng)的最低藥物質(zhì)量濃度記為該藥物的MIC。每種菌株平行操作3次，結(jié)果詳見表2～表4。

表2 赤脛散95%%乙醇提取物對6種菌株的MIC測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 MIC results of 95%%ethanol extract from P.runcinatum to 6 kinds of bacteria（n＝3）

表3 赤脛散95%%乙醇提取物的乙酸乙酯部位對6種菌株的MIC測定結(jié)果（n＝3）Tab 3 MIC results of ethyl acetate fraction of 95%%ethanol extract from P.runcinatum to 6 kinds of bacteria（n＝3）

表4 赤脛散95%%乙醇提取物的正丁醇部位對6種菌株的MIC測定結(jié)果（n＝3）Tab 4 MIC results of n-butyl alcohol fraction of 95%%ethanol extract from P.runcinatum to 6 kinds of bacteria（n＝3）

由表2、表3、表4可知，赤脛散95%乙醇提取物對傷寒桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的MIC為12.5 mg/mL，對綠膿桿菌、福氏志賀氏菌的MIC均為6.25 mg/mL；其乙酸乙酯部位對傷寒桿菌、綠膿桿菌、福氏志賀氏菌的MIC均為3.13 mg/mL，對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的MIC均為6.25 mg/mL；其正丁醇部位對傷寒桿菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、福氏志賀氏菌的MIC為6.25 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC為25 mg/mL，對大腸埃希菌的MIC為12.5 mg/mL。

2.3.2 MBC 采用瓊脂培養(yǎng)基平板法[10]進(jìn)行測定。分別從“2.3.1”項下未見細(xì)菌生長的孔中吸取100 μL培養(yǎng)液，分別接種至M-H瓊脂培養(yǎng)基平皿中，用無菌棉簽均勻涂布，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。用活菌計數(shù)法檢查平板上菌落，以平均菌落數(shù)＜5個對應(yīng)的最小稀釋度的提取物質(zhì)量濃度記為MBC[9-10]。每種菌株平行操作3次，結(jié)果詳見表5。

表5 赤脛散95%%乙醇提取物及其乙酸乙酯、正丁醇部位的MBC測定結(jié)果（n＝3）Tab 5 MBC results of 95%%ethanol extract，its ethyl acetate and n-butanol fractions from P.runcinatum（n＝3）

由表5可知，赤脛散95%乙醇提取物對枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌的MBC為12.5 mg/mL，對其余4種細(xì)菌的MBC均為25 mg/mL；其乙酸乙酯部位對傷寒桿菌、枯草芽孢桿菌、福氏志賀氏菌的MBC為6.25 mg/mL，對其余3種細(xì)菌的MBC為12.5 mg/mL；其正丁醇部位對傷寒桿菌、綠膿桿菌、福氏志賀氏菌的MBC均為12.5 mg/mL，對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的MBC均為25 mg/mL。

3 討論

本研究選擇氯霉素和氟康唑作為陽性對照藥物。其中，氯霉素為廣譜抗生素，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有良好的抑菌效果；氟康唑為抗真菌藥物，對真菌的抑制作用良好。試驗中所有藥物的質(zhì)量濃度均由本課題組根據(jù)文獻(xiàn)[14-15]及前期預(yù)試驗結(jié)果設(shè)定。

體外抑菌作用測定結(jié)果顯示，赤脛散水提物幾乎未見抑菌作用；95%乙醇提取物對各菌株的抑菌作用顯著強(qiáng)于水提物，且對6種細(xì)菌的抑制效果優(yōu)于對2種真菌及乙型溶血性鏈球菌，在6種細(xì)菌中又以對福氏志賀氏菌的抑制效果最強(qiáng)；95%乙醇提取物的乙酸乙酯及正丁醇部位均表現(xiàn)出良好抑菌效果，但對真菌均無抑制作用。以上結(jié)果提示，赤脛散95%乙醇提取物及其乙酸乙酯、正丁醇萃取部位為抑菌有效部位，均對細(xì)菌有較好的抑制效果，但對真菌抑制效果不佳。

進(jìn)一步對6種細(xì)菌的MIC考察結(jié)果顯示，赤脛散95%乙醇提取物的乙酸乙酯部位抑菌作用最強(qiáng)，其次為正丁醇部位，95%乙醇提取物的抑菌效果最弱；MBC的測定結(jié)果進(jìn)一步證明乙酸乙酯部位抑菌效果最強(qiáng)。以上結(jié)果提示，赤脛散95%乙醇提取物的乙酸乙酯部位可作為抑菌活性部位應(yīng)用，從中尋找赤脛散的有效抑菌活性成分是今后研究的方向。

綜上所述，赤脛散95%乙醇提取物及其乙酸乙酯、正丁醇萃取部位具有明顯的體外抑菌作用，尤其以乙酸乙酯部位最優(yōu)。該結(jié)論為赤脛散這一民間常用藥的開發(fā)利用提供了一定的實驗依據(jù)，但其中具有抑菌作用的具體有效活性成分及其抑菌機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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