劉景陶，倪敬軒，王曉，畢毅（1.河套學院理學系，內(nèi)蒙古巴彥淖爾015000；.煙臺大學藥學院，山東煙臺 64005）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD），是一種常見的慢性神經(jīng)退行性疾病，主要特征為記憶喪失和認知衰退[1]。截至2013年，全球各地超過4400萬人患有AD，經(jīng)濟負擔約為每年604億美元，且預計在未來幾十年，AD患者的數(shù)量還將呈指數(shù)級增長[2]。目前雖已有多種AD治療藥物進入臨床，但仍未能獲得理想效果，因此亟需開發(fā)能有效治療AD的新藥。

AD的主要病理特征之一是由細胞外β-淀粉樣多肽（Aβ）的過度聚集而產(chǎn)生的老年斑（SPs），而Aβ能通過對腦神經(jīng)細胞產(chǎn)生毒性而引起腦功能障礙[3]。研究表明，Aβ的過度聚集與纏結是導致AD的主要因素[4]，因此降低大腦中Aβ的水平是治療AD的重要研究方向。β-淀粉樣前體蛋白水解酶1（又稱β-分泌酶1，BACE1），是水解淀粉樣前體蛋白生成Aβ的關鍵限速酶[5]，因此減少BACE1的分泌或降低BACE1的表達已成為AD藥物治療的重要策略之一。目前已有多種結構類型的小分子BACE1抑制劑處于研究中，如氨基乙內(nèi)酰脲類[6]、氨基噁唑啉類[7]、亞氨基嘧啶酮類[8]和氨基噻嗪類[9]等。2009年，美國禮來公司報道了一種聯(lián)芳基氨基噻嗪類BACE1抑制劑——化合物A（LY2811376），該化合物對BACE1表現(xiàn)出適度的抑制活性[半數(shù)抑制濃度（IC50）＝0.27 μmol/L]，口服給藥后能夠持續(xù)降低健康志愿者腦部的Aβ水平[9]。2016年，Wu YJ等[10]在化合物A的基礎上開發(fā)出化合物B，后者對BACE1的抑制活性更強（IC50＝0.7 nmol/L）?；衔顰、B的結構見圖1。由于聯(lián)芳基氨基噻嗪類BACE1抑制劑表現(xiàn)出較強的抑制活性，加之其具有分子骨架較小、代謝穩(wěn)定性強等特征[11]，故該類化合物的衍生物成為BACE1抑制劑的主要研究對象之一。

圖1 化合物A、B的結構Fig 1 Structures of compoundAand B

定量構效關系（Quantitative structure-activity relationship，QSAR）法是通過分析化合物結構特征與其活性之間的相關性，以預測新化合物活性的方法[12]。三維定量構效關系（3D-QSAR）是引入了分子三維結構信息進行QSAR研究的方法，能間接反映化合物與大分子相互作用過程中的非鍵相互作用特征，有助于節(jié)省科研資源、加快新化合物和新藥物的開發(fā)進程[13]。比較分子場分析法（CoMFA）[14]和比較分子相似性指數(shù)分析法（CoMSIA）[15]是3D-QSAR法中的常用方法，其中CoMFA用于分析化合物的結構特性如立體場、靜電場與其活性之間的相關性[16]，而CoMSIA用于分析化合物的疏水性、氫鍵供體/受體以及空間/靜電特性與其活性之間的相關性[17]。

為獲得具有高效BACE1抑制活性的新型聯(lián)芳基氨基噻嗪類衍生化合物，筆者運用SYBYL-X 2.0軟件包，采用CoMFA與CoMSIA方法對41個聯(lián)芳基氨基噻嗪類衍生化合物進行3D-QSAR分析，獲得該類化合物的3DQSAR模型，并運用Surflex-dock分子對接方法分析該類化合物與BACE1的結合模式，為新型高效BACE1抑制劑的研發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 軟件

采用Tripos公司SYBYL-X 2.0軟件包進行研究：采用“Minimize”功能模塊選擇力場、優(yōu)化方法對分子結構進行優(yōu)化，得到合理的構象；采用“CoMFA”與“CoMSIA”功能模塊建立3D-QSAR模型，然后以所建模型預測化合物的活性；采用“Surflex-dock”功能模塊進行配體小分子與受體大分子的對接，探索兩者間作用模式。

1.2 化合物及其活性數(shù)據(jù)

本研究選取的41個聯(lián)芳基氨基噻嗪類衍生化合物中，化合物1～19來自于文獻[10]，化合物20～31來自于文獻[18]，化合物32～37來自于文獻[19]，化合物38～41來自于文獻[20]。在建模過程中，根據(jù)活性梯度與取代基類型選取其中35個化合物（約占85%）作為訓練集用于建立3D-QSAR模型，其余6個化合物（約占15%）作為測試集用于檢測模型的預測能力。41個化合物的結構見圖2，活性測試結果見表1[注：本研究以IC50常用對數(shù)的負值（即-lgIC50，簡稱pIC50）作為活性數(shù)據(jù)[21]]。

圖2 41個BACE1抑制劑化合物的結構Fig 2 Structures of 41 BACE1 inhibitor compounds

1.3 化合物分子結構優(yōu)化

采用“Minimize”功能模塊對全部化合物的結構進行分子力學能量優(yōu)化。優(yōu)化過程選用Powell能量梯度法，Tripos力場，加載Gasteiger-Hückel電荷，最大迭代1 000次，能量收斂條件為能級差0.005 kcal/mol（1 kcal＝4.19 kJ），其他參數(shù)采用軟件默認值。

1.4 3D-QSAR模型構建及驗證

筆者分別采用CoMFA和CoMSIA兩種方法建立3D-QSAR模型。首先使用一個以sp3雜化的C+作為探針，計算分子格點空間距離為2 ?（1 ?＝0.1 nm）的分子場，然后進行回歸分析，運用偏最小二乘法（PLS）以及留一法（LOO）進行相互驗證得到模型的主成分數(shù)（n）和交叉驗證系數(shù)（q2）[22-23]；之后采用非交叉驗證方法得到相關系數(shù)（r2）與標準偏差（SEE）；最后按文獻[24]標準獲得最優(yōu)模型并對測試集進行化合物的活性預測。CoMFA和CoMSIA的建模方法相同，其中CoMFA采用立體場和靜電場描述，而CoMSIA采用立體場、靜電場、疏水性場、氫鍵供體場、氫鍵受體場描述[25-26]，均以三維等勢圖表示。

表1 41個BACE1抑制劑化合物活性測試結果Tab 1 Biological activity results of 41 BACE1 inhibitor compounds

1.5 分子對接

采用“Surflex-dock”功能模塊進行聯(lián)芳基氨基噻嗪類化合物與BACE1的分子對接。對接時所用的BACE1三維晶體復合物結構來源于Protein Data Bank（PDB，http：//www.rcsb.org）數(shù)據(jù)庫中編號為5ENK的化合物。在蛋白質(zhì)修飾過程中，抽離出原配體5QV（即表1中的化合物2），將已抽離配體的蛋白質(zhì)進行加氫、加載Gasteiger-Hückel電荷、修正錯誤或不完整殘基等操作。以5QV的結構作為參照，進行聯(lián)芳基氨基噻嗪類化合物與BACE1的對接，結合部位為5ENK中BACE1與5QV的結合部位，以評分值較高者作為較優(yōu)分子構象。

2 結果與討論

2.1 CoMFA與CoMSIA模型的驗證結果

采用CoMFA方法得到的最佳CoMFA模型線性方程為y＝1.017 2x-0.046 1（x為實測活性值，y為預測活性值，下同），q2＝0.760，r2＝0.972，n＝3，SEE＝0.168 072；采用CoMSIA方法得到的最佳CoMSIA模型線性方程為y＝0.912x-0.206 8，q2＝0.704，r2＝0.981，n＝4，SEE＝0.140 596。通常q2＞0.5時，可認為模型具有較好的預測能力[27]。結果表明，所得CoMFA模型與CoMSIA模型具有可靠的預測能力，可較為準確地預測測試集化合物的活性。化合物活性預測值及其與實測值的相關性見表1、圖3。

圖3 CoMFA模型和CoMSIA模型實測值與預測值的相關性Fig 3 Correlation of experimental value and predicted value of CoMFAand CoMSIAmodel

2.2 3D-QSAR的CoMFA建模結果

以化合物4為例，其采用CoMFA法所建模型的三維等勢圖（立體場與靜電場）見圖4。圖4A為立體場的三維等勢圖，綠色表示增大基團會增強化合物活性，黃色表示增大基團會降低化合物活性；4位與6位的綠色等勢區(qū)域說明在這兩處引入體積大的基團有利于增強化合物活性。例如與化合物4比較，化合物2的4位苯環(huán)上有嘧啶環(huán)取代，故化合物2的活性更強；與化合物8比較，化合物5的6位有甲基異噁唑環(huán)取代，故化合物5的活性更強。圖4B為靜電場的三維等勢圖，藍色表示在該區(qū)域引入帶正電荷的取代基有利于增強化合物活性，紅色表示引入帶負電荷的取代基會增強化合物活性；4位苯環(huán)處與6位的紅色等勢區(qū)域說明在這兩處引入負電性基團可增加化合物的活性。例如與化合物20比較，化合物21的4位苯環(huán)處有氟原子取代，故化合物21的活性更強；與化合物17比較，化合物36的6位有羥基取代，故化合物36的活性更強。

2.3 3D-QSAR的CoMSIA建模結果

以化合物4為例，由于CoMSIA法所建模型的立體場與靜電場等勢圖與CoMFA模型基本一致，故略去，其氫鍵受體場、氫鍵供體場和疏水場的三維等勢圖見圖5。圖5A、B為氫鍵受體場與供體場的三維等勢圖，紫紅色表示增加氫鍵受體有利于增強化合物活性，紅色則與之相反；藍綠色代表增加氫鍵供體有利于增強化合物活性，紫色則與之相反；4位取代基處的紫紅色與藍綠色等勢區(qū)域說明此處引入氫鍵受體或供體都可增加活性。例如與化合物4比較，化合物31的4位取代基既有氮原子又有氧原子，故化合物31的活性更強。6位取代基上方的藍綠色等勢區(qū)域表明此處引入氫鍵供體有利于增強化合物活性。例如與化合物6比較，化合物18的6位取代基上方有氮原子，故化合物18的活性更強。圖5C為疏水場等勢圖，黃色區(qū)域表示引入疏水性基團（如苯環(huán)、甲基、乙基、甲氧基等）有利于增強化合物活性，灰色區(qū)域表示引入親水性基團（如羥基、氟原子等）有利于增強化合物活性；4位引入親水性基團可增強化合物活性。例如與化合物4比較，化合物37的4位取代基引入了氰基，故化合物37的活性更強。6位引入疏水性基團可增強化合物的活性。例如與化合物17比較，化合物13的6位取代基引入了苯基，故化合物13的活性更強。

圖4 CoMFA模型的三維等勢圖Fig 4 Three dimensional contour plots of CoMFA model

圖5 CoMSIA模型的三維等勢圖Fig 5 Three dimensional contour plots of CoMSIA model

2.4 分子對接結果

分子對接評分最高者為化合物34，其與BACE1受體的對接模式見圖6A，與BACE1受體的疏水相互作用見圖6B。由圖6A可見，化合物34位于BACE1受體的活性口袋內(nèi)，并與口袋內(nèi)的分子產(chǎn)生相互作用：氨基噻嗪環(huán)中氨基上的一個氫原子與受體蛋白中氨基酸殘基ASP276上的兩個氧原子分別形成兩個氫鍵，氨基上的另一個氫原子與氨基酸殘基ASP80上的一個氧原子和ASP276上的一個氧原子分別形成兩個氫鍵，4位取代基中酰胺鍵上的氧原子和吡啶環(huán)上的氮原子與氨基酸殘基TYR246分別形成兩個氫鍵。圖6B中間的深色球棒代表化合物34，兩側(cè)的淺色球棒表示與配體分子發(fā)生氫鍵作用的氨基酸殘基，半月形虛線表示配體分子與氨基酸殘基的疏水相互作用。疏水相互作用是發(fā)生在疏水物的疏水基之間的一種重要的弱相互作用，分子間的非極性部分由于疏水性而相互靠攏，疏水作用越強，結合就越牢固。由圖6B可見，疏水氨基酸殘基ASP80、ASP276在氨基噻嗪母核附近有強的疏水相互作用，TYR246與4位取代基的酰胺吡啶環(huán)有疏水相互作用。

圖6 分子對接模式與疏水相互作用圖Fig 6 Diagram of molecular docking mode and hydrophobic interaction

由于化合物34分別與氨基酸殘基ASP80、ASP276、TYR246形成氫鍵，而ASP80和ASP276是PDB數(shù)據(jù)庫中5ENK化合物已經(jīng)確認的活性功能殘基，故推測TYR246可能是聯(lián)芳基氨基噻嗪類化合物與BACE1結合的潛在活性功能殘基。將化合物11、12、15、35與BACE1受體（5ENK）結合，結果上述4個化合物均與氨基酸殘基ASP80、ASP276、TYR246形成氫鍵作用。

3 結語

本課題組通過對41個聯(lián)芳基氨基噻嗪類BACE1抑制劑化合物進行3D-QSAR研究，建立了預測能力較好的CoMFA模型（q2＝0.760，r2＝0.972）與CoMSIA模型（q2＝0.704，r2＝0.981），根據(jù)CoMFA（立體場與靜電場）與CoMSIA（立體場、靜電場、氫鍵供體/受體場、疏水性場）的等勢圖分析，可指導此類化合物的結構優(yōu)化。通過該類化合物與BACE1受體的分子對接研究發(fā)現(xiàn)，其可與ASP80、ASP276和TYR246等氨基酸殘基形成氫鍵作用，其中TYR246可能是聯(lián)芳基氨基噻嗪類抑制劑化合物分子與BACE1結合的另一潛在活性功能殘基。據(jù)此，可對該類化合物的取代基進行合理優(yōu)化，獲得對BACE1抑制活性增強的新型聯(lián)芳基氨基噻嗪類抑制劑。通過3D-QSAR分析結合分子對接，可進行新型高效聯(lián)芳基氨基噻嗪類BACE1抑制劑的設計合成，進而用于研發(fā)新型AD治療藥物。

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