郭沖，岳霄，賈大林

（1.山東省肥城礦業(yè)中心醫(yī)院 心內(nèi)科，山東 肥城 271600；2.山東省肥城礦業(yè)中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 肥城 271600；3.中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院，遼寧 沈陽 110033）

近年來，我國心肌梗死發(fā)病率及病死率居高不下，且呈逐年上升趨勢，已成為威脅人們健康的重要因素[1]。再灌注作為減少心肌損傷、挽救患者生命的重要手段，已被廣泛應(yīng)用于臨床，但某些情況下，再灌注治療過程中也可能會導致心肌發(fā)生再灌注損傷而加劇心肌壞死[2]。研究表明[3]，缺血后處理可減少缺血再灌注損傷，保護心肌，減小梗死面積。舒芬太尼作為高選擇性阿片類激動劑，具有較強的鎮(zhèn)痛作用，且對血流動力學影響較小，是心血管系統(tǒng)手術(shù)麻醉常用藥物[4]。研究表明[5]，舒芬太尼后處理能夠減輕心肌缺血再灌注損傷，具有心肌保護作用。但其具體作用機制尚未完全清楚。有研究指出[6]，氧化應(yīng)激是心肌缺血再灌注損傷的重要病理基礎(chǔ)。核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，與細胞自我保護作用密切相關(guān)，是調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵性因子，與抗氧化物反應(yīng)元件（antioxidant response elements,ARE）結(jié)合形成體內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激Nrf2/ARE通路而啟動的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)[7]。本研究通過復制大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，探討舒芬太尼后處理對再灌注時Nrf2-ARE信號通路的影響，以期為心肌缺血再灌注損傷機制研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設(shè)備

舒芬太尼購自宜昌人福藥業(yè)有限責任公司（批號：1140712，批準文號：國藥準字 H20054172），2、3、5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenylchloride tetrazole,TTC）購自美國Sigma公司，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Roche公司，Trizol總RNA提取試劑盒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司，Nrf2、血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1,HO-1）、醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase 1,NQO1）、超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1,SOD1）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶μ2（glutathione-S-transferase μ2,GSTμ2）及內(nèi)參引物均由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成，兔抗Nrf2多克隆抗體購自美國Abcam公司，兔抗鼠HO-1多克隆抗體和小鼠GSTμ2單克隆抗體均購自美國Cell Signaling公司，NQO1和SOD1多克隆抗體均購自美國Santa Crutz公司，Notocord多道生理記錄儀購自北京拜安吉科技有限公司，動物呼吸機購自上海欣曼科教設(shè)備有限公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）儀購自美國ABI公司，凝膠電泳系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組 30只健康雄性SD大鼠購自河南實驗動物中心[合格證號：SCXK（豫）2010-0002]，4～5月齡，體重（250±20）g，自由飲水、進食，飼養(yǎng)于標準環(huán)境中。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、缺血再灌注組和舒芬太尼后處理組，每組10只。

1.2.2 復制大鼠心肌缺血再灌注損傷模型 所有大鼠利用5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，劑量40 mg/kg，固定，右頸內(nèi)靜脈置管進行給藥、補液，行頸動脈穿刺置管，連接Notocord多道生理記錄儀對心電圖、心率、血壓、血流動力學指標進行檢測，行氣管切開并置入導管，連接動物呼吸機，進行機械通氣，頻率70～80次/min，氧流量3 L/min，濃度21%，維持動脈血二氧化碳分壓（PaCO2）在35～45 mmHg，pH在7.35～7.45。消毒后，于左側(cè)第3和第4肋間行開胸術(shù)，逐層鈍性分離肌肉，將胸膜和心包膜剝離，使心臟充分暴露后，將6-0無損傷縫合線從左冠狀動脈前降支下穿過，平衡30 min，將縫合線拉緊，使冠狀動脈血流阻斷30 min，成功標志是冠狀動脈結(jié)扎處以下心外膜呈發(fā)紺蒼白，出現(xiàn)一過性心律失常，心電圖ST段抬高明顯；將縫合線松開，使心肌恢復再灌注4 h，成功標志是心外膜重新充血，呈紅潤狀，心電圖ST段明顯下降。假手術(shù)組大鼠僅將6-0無損傷縫合線從左冠狀動脈前降支下穿過而不拉緊，其余步驟同缺血再灌注組和舒芬太尼后處理組大鼠。舒芬太尼后處理組大鼠于再灌注前5 min按1μg/kg的劑量經(jīng)股靜脈注入舒芬太尼，假手術(shù)組和缺血再灌注組則注入等量的生理鹽水。3組大鼠均成功復制心肌缺血再灌注損傷模型，未出現(xiàn)死亡。

1.2.3 3組大鼠心肌梗死面積檢測 3組大鼠于心肌恢復再灌注4 h時，每組隨機取5只大鼠，經(jīng)頸靜脈將2%伊文思藍2 ml快速推注，迅速將心臟摘除，將左心室沿垂直于心臟縱軸方向從心底向心尖部切片，厚度約2 mm。置于TTC液中，于37℃避光恒溫孵育15 min，取出后，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline solution,PBS）沖洗3次，用10%甲酸固定60 min，自然光下拍照，染色結(jié)果：缺血組織呈磚紅色，梗死組織呈灰白色。利用Image J圖像分析軟件對心肌梗死范圍進行分析，心肌梗死面積=心肌梗死區(qū)面積/缺血區(qū)面積×100%。

1.2.4 3組大鼠心臟組織病理學檢查 3組大鼠于心肌恢復再灌注4 h時，每組隨機取5只大鼠，處死后，取各組大鼠心尖部心臟組織，甲醛固定24 h，脫水、透明、石蠟包埋、切片，HE染色后，于高倍鏡下對各組大鼠心肌組織進行觀察。

1.2.5 3組大鼠心肌細胞凋亡檢測 3組大鼠于心肌恢復再灌注4 h時，每組隨機取5只大鼠，處死后，取各組大鼠左心室前壁心肌組織，按照1.2.4中的方法制備石蠟標本，按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書完成操作，于高倍鏡下進行觀察：正常心肌細胞核呈深藍色，凋亡細胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒且有凋亡細胞形態(tài)學改變。于高倍鏡下各取10個視野，計數(shù)凋亡細胞數(shù)，凋亡指數(shù)（apoptosis index,AI）=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2.6 qRT-PCR技術(shù)檢測3組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2基因表達 3組大鼠于心肌恢復再灌注4 h時，每組隨機取5只大鼠，處死后，取各組大鼠左心室心肌組織，研磨后，加入細胞裂解液，用Trizol總RNA提取試劑盒對總RNA進行提取并檢測濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為模板單鏈cDNA，以cDNA為模板進行PCR。引物序列見表1，PCR反應(yīng)條件：95℃ 1 min，92℃ 30 s，60℃ 30 s，75℃ 30 s，連續(xù)進行40次循環(huán)，每個樣品均設(shè)3個平行反應(yīng)復孔。用2-△△Ct法對心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2基因相對表達量進行計算。

1.2.7 3組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2蛋白表達 3組大鼠于心肌恢復再灌注4 h時，每組隨機取5只大鼠，處死后，取各組大鼠左心室心肌組織，研磨后，加入細胞裂解液，用總蛋白提取試劑盒對總蛋白進行提取，利用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白純度。取30μg總蛋白，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，用5%脫脂牛奶封閉60 min，TBST洗膜3次，分別將一抗兔抗Nrf2多克隆抗體、兔抗鼠 HO-1多克隆抗體、NQO1多克隆抗體、SOD1多克隆抗體和小鼠GSTM2單克隆抗體（稀釋比例為：1︰600、1︰800、1︰1 200、1︰1 500和1︰2 000）加入，4℃過夜孵育，TBST洗膜3次，加入二抗，37℃恒溫孵育120 min，TBST洗膜3次，加入ECL暗室下反應(yīng)20 min，拍照，利用Image J圖像分析軟件對條帶進行分析，獲得大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2蛋白相對表達量。

表1 基因序列

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，經(jīng)正態(tài)性檢驗，資料符合正態(tài)分布，方差齊，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠心臟組織病理學比較

免疫組織化學結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌細胞排列整齊、規(guī)則；缺血再灌注組大鼠心肌細胞出現(xiàn)腫脹、破裂，出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤；相比于缺血再灌注組，舒芬太尼后處理組大鼠心肌細胞排列較好，炎癥細胞減少。見圖1。

2.2 3組大鼠心肌梗死面積和心肌細胞凋亡比較

與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和舒芬太尼后處理組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)和梗死面積均增加，與缺血再灌注組比較，舒芬太尼后處理組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)和梗死面積均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2和圖 2。

2.3 3組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2基因表達比較

與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和舒芬太尼后處理組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2 mRNA相對表達量降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與缺血再灌注組比較，舒芬太尼后處理組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2 mRNA相對表達量升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

2.4 3組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2蛋白表達比較

與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和舒芬太尼后處理組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2蛋白相對表達量均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與缺血再灌注組比較，舒芬太尼后處理組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2蛋白相對表達量升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4和圖 3。

圖1 3組大鼠心臟組織病理檢查結(jié)果 （×400）

表2 3組大鼠心肌梗死面積和心肌細胞凋亡比較（n=5，%，±s）

表2 3組大鼠心肌梗死面積和心肌細胞凋亡比較（n=5，%，±s）

注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與缺血再灌注組比較，P＜0.05

組別 細胞凋亡指數(shù) 心肌梗死面積假手術(shù)組 9.1±2.0 1.6±0.6缺血再灌注組 49.3±6.41) 63.4±5.91)舒芬太尼后處理組 24.6±5.11)2) 27.6±4.71)2)F值 37.182 291.799 P值 0.000 0.000

圖2 3組大鼠心肌梗死面積

表3 3組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2基因表達比較 （n=5，±s）

表3 3組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2基因表達比較 （n=5，±s）

注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與缺血再灌注組比較，P＜0.05

組別 Nrf2 mRNA HO-1 mRNA NQO1 mRNA SOD1 mRNA GSTM2 mRNA假手術(shù)組 1.95±0.18 2.37±0.13 2.19±0.21 2.07±0.25 1.85±0.16缺血再灌注組 0.83±0.121） 0.91±0.111） 0.62±0.151） 0.74±0.091） 0.53±0.101）舒芬太尼后處理組 1.43±0.161）2） 1.68±0.151）2） 1.52±0.181）2） 1.39±0.211）2） 1.28±0.141）2）F值 28.717 38.249 24.173 33.291 19.832 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表4 3組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2蛋白表達比較 （n=5，±s）

表4 3組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2蛋白表達比較 （n=5，±s）

注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與缺血再灌注組比較，P＜0.05

組別 Nrf2 HO-1 NQO1 SOD1 GSTM2假手術(shù)組 0.84±0.09 0.92±0.10 0.87±0.08 0.85±0.11 0.79±0.12缺血再灌注組 0.39±0.061） 0.46±0.081） 0.33±0.071） 0.41±0.091） 0.28±0.061）舒芬太尼后處理組 0.63±0.081）2） 0.70±0.111）2） 0.58±0.091）2） 0.61±0.121）2） 0.57±0.101）2）F值 39.829 32.192 51.482 28.173 45.384 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖3 3組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2蛋白表達

3 討論

心肌缺血再灌注損傷作為心肌梗死重要的致死原因，目前越來越受到臨床的重視。研究表明[8]，某些藥物后處理可通過激發(fā)或模擬自身內(nèi)源性保護物質(zhì)或激活某些信號通路而保護心肌。舒芬太尼作為心血管手術(shù)常用的麻醉藥物，具有良好的鎮(zhèn)痛效果，且對血流動力學影響較小，動物實驗表明[9]，舒芬太尼可有效減輕心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌損傷。本研究復制了大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組大鼠心肌細胞出現(xiàn)腫脹、破裂，出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤，心肌細胞凋亡指數(shù)和梗死面積均顯著增加，提示大鼠缺血再灌注模型復制成功。本研究參考有關(guān)文獻[10]，于心肌再灌注前5 min按1μg/kg的劑量將舒芬太尼經(jīng)股靜脈注入，結(jié)果顯示，相比于缺血再灌注組，舒芬太尼后處理組大鼠心肌細胞排列較好，炎癥細胞減少，心肌細胞凋亡指數(shù)和梗死面積均降低，說明舒芬太尼后處理可有效保護大鼠心肌細胞，減輕缺血再灌注損傷。

Nrf2作為一種轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，在細胞自我保護中發(fā)揮重要的作用，是機體氧化應(yīng)激反應(yīng)中關(guān)鍵性調(diào)控因子[11]。研究表明[12]，當細胞受外界不良刺激時，胞外的Nrf2可轉(zhuǎn)移至胞核，與ARE形成Nrf2/ARE通路而啟動下游一系列蛋白表達，包括Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶的表達。HO-1、NQO1和GSTM2是受Nrf2/ARE通路調(diào)控的重要的Ⅱ相解毒酶，是重要的內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)[13]，SOD1作為重要的抗氧化酶，在清除細胞毒性的超氧化物自由基、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[14]。本研究顯示，與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和舒芬太尼后處理組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2基因和蛋白相對表達量均降低，說明Nrf2/ARE信號通路異常，導致其下游抗氧化應(yīng)激反應(yīng)基因表達異常可能是發(fā)生缺血再灌注損傷的重要原因。本研究顯示，與缺血再灌注組比較，舒芬太尼后處理組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2基因和蛋白相對表達量均升高，說明舒芬太尼后處理可促使Nrf2以及其下游Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶的表達，從而發(fā)揮內(nèi)源性的抗氧化應(yīng)激作用。

綜上所述，舒芬太尼后處理可有效減輕缺血再灌注損傷大鼠心肌梗死面積及細胞凋亡，其機制可能通過激活Nrf2/ARE信號通路促使其下游Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶的表達，從而有效對抗氧化應(yīng)激損傷。

[1]司向,翟屹,施小明.中國慢性非傳染性疾病預防控制能力評估[J].中華流行病學雜志,2014,35(6): 675-679.

[2]MESSNER F,GRAHAMMER J,HAUTZ T,et al.Ischemia/reperfusion injury in vascularized tissue allotransplantation: tissue damage and clinical relevance[J].Curr Opin Organ Transplant,2016,21(5): 503-509.

[3]KHAN A R,BINABDULHAK A A,ALASTAL Y,et al.Cardioprotective role of ischemic postconditioning in acute myocardial infarction: a systematic review and meta-analysis[J].Am Heart J,2014,168(4): 512-521.

[4]MINKOWITZ H S.A review of sufentanil and the sufentanil sublingual tablet system for acute moderate to severe pain[J].Pain Manag,2015,5(4): 237-250.

[5]趙仙雅,顧爾偉,魯顯福,等.舒芬太尼后處理對大鼠心肌缺血再灌注時Ac-H3表達的影響[J].中華麻醉學雜志,2016,36(2):246-249.

[6]SUN N,WANG H,WANG L.Protective effects of ghrelin against oxidative stress,inducible nitric oxide synthase and inf l ammation in a mouse model of myocardial ischemia/reperfusion injury via the HMGB1 and TLR4/NF-κB pathway[J].Mol Med Rep,2016,14(3): 2764-2770.

[7]KUMAR H,KIM I S,MORE S V,et al.Natural product-derived pharmacological modulators of Nrf2/ARE pathway for chronic diseases[J].Nat Prod Rep,2014,31(1): 109-139.

[8]丁福祥,阿佳宜,劉同庫.缺血后處理-心肌缺血再灌注損傷的另一種保護策略[J].中國老年學雜志,2013,33(18): 4649-4652.

[9]WANG X H,ZENG J F,LIN C,et al.Effects of morphine and sufentanil preconditioning against myocardial ischemic-reperfusion injury in rabbits[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(9): 15692-15699.

[10]CHEN Q L,GU E W,ZHANG L,et al.Diabetes mellitus abrogates the cardioprotection of sufentanil against ischaemia/reperfusion injury by altering glycogen synthase kinase-3β[J].Acta Anaesthesiol Scand,2013,57(2): 236-242.

[11]OWUSU-ANSAH A,CHOI S H,PETROSIUTE A,et al.Triterpenoid inducers of Nrf2 signaling as potential therapeutic agents in sickle cell disease: a review[J].Front Med,2015,9(1):46-56.

[12]AHMED S M,LUO L,NAMANI A,et al.Nrf2 signaling pathway: Pivotal roles in inf l ammation[J].Biochim Biophys Acta,2016,1863(2): 585-597.

[13]SAW C L,CINTRóN M,WU T Y,et al.Pharmacodynamics of dietary phytochemical indoles I3C and DIM: Induction of Nrf2-mediated phase II drug metabolizing and antioxidant genes and synergism with isothiocyanates[J].Biopharm Drug Dispos,2011,32(5): 289-300.

[14]BAE J R,KIM S H.Impairment of SOD1-G93A motility is linked to mitochondrial movement in axons of hippocampal neurons[J].Arch Pharm Res,2016,39(8): 1144-1150.