郭沖，岳霄，賈大林

（1.山東省肥城礦業(yè)中心醫(yī)院 心內(nèi)科，山東 肥城 271600；2.山東省肥城礦業(yè)中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 肥城 271600；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110033）

近年來(lái)，我國(guó)心肌梗死發(fā)病率及病死率居高不下，且呈逐年上升趨勢(shì)，已成為威脅人們健康的重要因素[1]。再灌注作為減少心肌損傷、挽救患者生命的重要手段，已被廣泛應(yīng)用于臨床，但某些情況下，再灌注治療過(guò)程中也可能會(huì)導(dǎo)致心肌發(fā)生再灌注損傷而加劇心肌壞死[2]。研究表明[3]，缺血后處理可減少缺血再灌注損傷，保護(hù)心肌，減小梗死面積。舒芬太尼作為高選擇性阿片類(lèi)激動(dòng)劑，具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，且對(duì)血流動(dòng)力學(xué)影響較小，是心血管系統(tǒng)手術(shù)麻醉常用藥物[4]。研究表明[5]，舒芬太尼后處理能夠減輕心肌缺血再灌注損傷，具有心肌保護(hù)作用。但其具體作用機(jī)制尚未完全清楚。有研究指出[6]，氧化應(yīng)激是心肌缺血再灌注損傷的重要病理基礎(chǔ)。核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，與細(xì)胞自我保護(hù)作用密切相關(guān)，是調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵性因子，與抗氧化物反應(yīng)元件（antioxidant response elements,ARE）結(jié)合形成體內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激Nrf2/ARE通路而啟動(dòng)的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)[7]。本研究通過(guò)復(fù)制大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，探討舒芬太尼后處理對(duì)再灌注時(shí)Nrf2-ARE信號(hào)通路的影響，以期為心肌缺血再灌注損傷機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設(shè)備

舒芬太尼購(gòu)自宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司（批號(hào)：1140712，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字 H20054172），2、3、5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenylchloride tetrazole,TTC）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司，Trizol總RNA提取試劑盒購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司，Nrf2、血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1,HO-1）、醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase 1,NQO1）、超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1,SOD1）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶μ2（glutathione-S-transferase μ2,GSTμ2）及內(nèi)參引物均由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，兔抗Nrf2多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，兔抗鼠HO-1多克隆抗體和小鼠GSTμ2單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，NQO1和SOD1多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Crutz公司，Notocord多道生理記錄儀購(gòu)自北京拜安吉科技有限公司，動(dòng)物呼吸機(jī)購(gòu)自上海欣曼科教設(shè)備有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，凝膠電泳系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 30只健康雄性SD大鼠購(gòu)自河南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)：SCXK（豫）2010-0002]，4～5月齡，體重（250±20）g，自由飲水、進(jìn)食，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、缺血再灌注組和舒芬太尼后處理組，每組10只。

1.2.2 復(fù)制大鼠心肌缺血再灌注損傷模型 所有大鼠利用5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，劑量40 mg/kg，固定，右頸內(nèi)靜脈置管進(jìn)行給藥、補(bǔ)液，行頸動(dòng)脈穿刺置管，連接Notocord多道生理記錄儀對(duì)心電圖、心率、血壓、血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，行氣管切開(kāi)并置入導(dǎo)管，連接動(dòng)物呼吸機(jī)，進(jìn)行機(jī)械通氣，頻率70～80次/min，氧流量3 L/min，濃度21%，維持動(dòng)脈血二氧化碳分壓（PaCO2）在35～45 mmHg，pH在7.35～7.45。消毒后，于左側(cè)第3和第4肋間行開(kāi)胸術(shù)，逐層鈍性分離肌肉，將胸膜和心包膜剝離，使心臟充分暴露后，將6-0無(wú)損傷縫合線從左冠狀動(dòng)脈前降支下穿過(guò)，平衡30 min，將縫合線拉緊，使冠狀動(dòng)脈血流阻斷30 min，成功標(biāo)志是冠狀動(dòng)脈結(jié)扎處以下心外膜呈發(fā)紺蒼白，出現(xiàn)一過(guò)性心律失常，心電圖ST段抬高明顯；將縫合線松開(kāi)，使心肌恢復(fù)再灌注4 h，成功標(biāo)志是心外膜重新充血，呈紅潤(rùn)狀，心電圖ST段明顯下降。假手術(shù)組大鼠僅將6-0無(wú)損傷縫合線從左冠狀動(dòng)脈前降支下穿過(guò)而不拉緊，其余步驟同缺血再灌注組和舒芬太尼后處理組大鼠。舒芬太尼后處理組大鼠于再灌注前5 min按1μg/kg的劑量經(jīng)股靜脈注入舒芬太尼，假手術(shù)組和缺血再灌注組則注入等量的生理鹽水。3組大鼠均成功復(fù)制心肌缺血再灌注損傷模型，未出現(xiàn)死亡。

1.2.3 3組大鼠心肌梗死面積檢測(cè) 3組大鼠于心肌恢復(fù)再灌注4 h時(shí)，每組隨機(jī)取5只大鼠，經(jīng)頸靜脈將2%伊文思藍(lán)2 ml快速推注，迅速將心臟摘除，將左心室沿垂直于心臟縱軸方向從心底向心尖部切片，厚度約2 mm。置于TTC液中，于37℃避光恒溫孵育15 min，取出后，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline solution,PBS）沖洗3次，用10%甲酸固定60 min，自然光下拍照，染色結(jié)果：缺血組織呈磚紅色，梗死組織呈灰白色。利用Image J圖像分析軟件對(duì)心肌梗死范圍進(jìn)行分析，心肌梗死面積=心肌梗死區(qū)面積/缺血區(qū)面積×100%。

1.2.4 3組大鼠心臟組織病理學(xué)檢查 3組大鼠于心肌恢復(fù)再灌注4 h時(shí)，每組隨機(jī)取5只大鼠，處死后，取各組大鼠心尖部心臟組織，甲醛固定24 h，脫水、透明、石蠟包埋、切片，HE染色后，于高倍鏡下對(duì)各組大鼠心肌組織進(jìn)行觀察。

1.2.5 3組大鼠心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè) 3組大鼠于心肌恢復(fù)再灌注4 h時(shí)，每組隨機(jī)取5只大鼠，處死后，取各組大鼠左心室前壁心肌組織，按照1.2.4中的方法制備石蠟標(biāo)本，按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)完成操作，于高倍鏡下進(jìn)行觀察：正常心肌細(xì)胞核呈深藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒且有凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。于高倍鏡下各取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)，凋亡指數(shù)（apoptosis index,AI）=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)3組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2基因表達(dá) 3組大鼠于心肌恢復(fù)再灌注4 h時(shí)，每組隨機(jī)取5只大鼠，處死后，取各組大鼠左心室心肌組織，研磨后，加入細(xì)胞裂解液，用Trizol總RNA提取試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行提取并檢測(cè)濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為模板單鏈cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR。引物序列見(jiàn)表1，PCR反應(yīng)條件：95℃ 1 min，92℃ 30 s，60℃ 30 s，75℃ 30 s，連續(xù)進(jìn)行40次循環(huán)，每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔。用2-△△Ct法對(duì)心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。

1.2.7 3組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2蛋白表達(dá) 3組大鼠于心肌恢復(fù)再灌注4 h時(shí)，每組隨機(jī)取5只大鼠，處死后，取各組大鼠左心室心肌組織，研磨后，加入細(xì)胞裂解液，用總蛋白提取試劑盒對(duì)總蛋白進(jìn)行提取，利用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白純度。取30μg總蛋白，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，用5%脫脂牛奶封閉60 min，TBST洗膜3次，分別將一抗兔抗Nrf2多克隆抗體、兔抗鼠 HO-1多克隆抗體、NQO1多克隆抗體、SOD1多克隆抗體和小鼠GSTM2單克隆抗體（稀釋比例為：1︰600、1︰800、1︰1 200、1︰1 500和1︰2 000）加入，4℃過(guò)夜孵育，TBST洗膜3次，加入二抗，37℃恒溫孵育120 min，TBST洗膜3次，加入ECL暗室下反應(yīng)20 min，拍照，利用Image J圖像分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，獲得大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2蛋白相對(duì)表達(dá)量。

表1 基因序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，資料符合正態(tài)分布，方差齊，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠心臟組織病理學(xué)比較

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊、規(guī)則；缺血再灌注組大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、破裂，出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；相比于缺血再灌注組，舒芬太尼后處理組大鼠心肌細(xì)胞排列較好，炎癥細(xì)胞減少。見(jiàn)圖1。

2.2 3組大鼠心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡比較

與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和舒芬太尼后處理組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)和梗死面積均增加，與缺血再灌注組比較，舒芬太尼后處理組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)和梗死面積均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2和圖 2。

2.3 3組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2基因表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和舒芬太尼后處理組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與缺血再灌注組比較，舒芬太尼后處理組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 3組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2蛋白表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和舒芬太尼后處理組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與缺血再灌注組比較，舒芬太尼后處理組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4和圖 3。

圖1 3組大鼠心臟組織病理檢查結(jié)果 （×400）

表2 3組大鼠心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡比較（n=5，%，±s）

表2 3組大鼠心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡比較（n=5，%，±s）

注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與缺血再灌注組比較，P＜0.05

組別 細(xì)胞凋亡指數(shù) 心肌梗死面積假手術(shù)組 9.1±2.0 1.6±0.6缺血再灌注組 49.3±6.41) 63.4±5.91)舒芬太尼后處理組 24.6±5.11)2) 27.6±4.71)2)F值 37.182 291.799 P值 0.000 0.000

圖2 3組大鼠心肌梗死面積

表3 3組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2基因表達(dá)比較 （n=5，±s）

表3 3組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2基因表達(dá)比較 （n=5，±s）

注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與缺血再灌注組比較，P＜0.05

組別 Nrf2 mRNA HO-1 mRNA NQO1 mRNA SOD1 mRNA GSTM2 mRNA假手術(shù)組 1.95±0.18 2.37±0.13 2.19±0.21 2.07±0.25 1.85±0.16缺血再灌注組 0.83±0.121） 0.91±0.111） 0.62±0.151） 0.74±0.091） 0.53±0.101）舒芬太尼后處理組 1.43±0.161）2） 1.68±0.151）2） 1.52±0.181）2） 1.39±0.211）2） 1.28±0.141）2）F值 28.717 38.249 24.173 33.291 19.832 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表4 3組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2蛋白表達(dá)比較 （n=5，±s）

表4 3組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2蛋白表達(dá)比較 （n=5，±s）

注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與缺血再灌注組比較，P＜0.05

組別 Nrf2 HO-1 NQO1 SOD1 GSTM2假手術(shù)組 0.84±0.09 0.92±0.10 0.87±0.08 0.85±0.11 0.79±0.12缺血再灌注組 0.39±0.061） 0.46±0.081） 0.33±0.071） 0.41±0.091） 0.28±0.061）舒芬太尼后處理組 0.63±0.081）2） 0.70±0.111）2） 0.58±0.091）2） 0.61±0.121）2） 0.57±0.101）2）F值 39.829 32.192 51.482 28.173 45.384 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖3 3組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2蛋白表達(dá)

3 討論

心肌缺血再灌注損傷作為心肌梗死重要的致死原因，目前越來(lái)越受到臨床的重視。研究表明[8]，某些藥物后處理可通過(guò)激發(fā)或模擬自身內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)或激活某些信號(hào)通路而保護(hù)心肌。舒芬太尼作為心血管手術(shù)常用的麻醉藥物，具有良好的鎮(zhèn)痛效果，且對(duì)血流動(dòng)力學(xué)影響較小，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明[9]，舒芬太尼可有效減輕心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌損傷。本研究復(fù)制了大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、破裂，出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)和梗死面積均顯著增加，提示大鼠缺血再灌注模型復(fù)制成功。本研究參考有關(guān)文獻(xiàn)[10]，于心肌再灌注前5 min按1μg/kg的劑量將舒芬太尼經(jīng)股靜脈注入，結(jié)果顯示，相比于缺血再灌注組，舒芬太尼后處理組大鼠心肌細(xì)胞排列較好，炎癥細(xì)胞減少，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)和梗死面積均降低，說(shuō)明舒芬太尼后處理可有效保護(hù)大鼠心肌細(xì)胞，減輕缺血再灌注損傷。

Nrf2作為一種轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，在細(xì)胞自我保護(hù)中發(fā)揮重要的作用，是機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)中關(guān)鍵性調(diào)控因子[11]。研究表明[12]，當(dāng)細(xì)胞受外界不良刺激時(shí)，胞外的Nrf2可轉(zhuǎn)移至胞核，與ARE形成Nrf2/ARE通路而啟動(dòng)下游一系列蛋白表達(dá)，包括Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶的表達(dá)。HO-1、NQO1和GSTM2是受Nrf2/ARE通路調(diào)控的重要的Ⅱ相解毒酶，是重要的內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)[13]，SOD1作為重要的抗氧化酶，在清除細(xì)胞毒性的超氧化物自由基、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[14]。本研究顯示，與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和舒芬太尼后處理組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，說(shuō)明Nrf2/ARE信號(hào)通路異常，導(dǎo)致其下游抗氧化應(yīng)激反應(yīng)基因表達(dá)異?？赡苁前l(fā)生缺血再灌注損傷的重要原因。本研究顯示，與缺血再灌注組比較，舒芬太尼后處理組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1和GSTM2基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，說(shuō)明舒芬太尼后處理可促使Nrf2以及其下游Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶的表達(dá)，從而發(fā)揮內(nèi)源性的抗氧化應(yīng)激作用。

綜上所述，舒芬太尼后處理可有效減輕缺血再灌注損傷大鼠心肌梗死面積及細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能通過(guò)激活Nrf2/ARE信號(hào)通路促使其下游Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶的表達(dá)，從而有效對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷。

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