李 強(qiáng)

（國(guó)營(yíng)寬甸滿(mǎn)族自治縣黎明林場(chǎng)，遼寧 寬甸 118200）

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）是遼寧山地地區(qū)著名的經(jīng)濟(jì)野果，其所含營(yíng)養(yǎng)成分具有良好的保健作用，研究表明，軟棗獼猴桃中的營(yíng)養(yǎng)成分具有提高機(jī)體的免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老等功效，果實(shí)所含營(yíng)養(yǎng)成分是中華獼猴桃的幾倍。因此，極具開(kāi)發(fā)潛力，并且具有巨大的應(yīng)用前景和推廣價(jià)值。近年來(lái)，軟棗獼猴桃主要采用嫩（硬）枝扦插和組織培養(yǎng)進(jìn)行苗木繁育。由于組織培養(yǎng)技術(shù)不受自然環(huán)境和季節(jié)條件的影響，可以在一定時(shí)期內(nèi)大量繁殖，因此能夠很好的解決人們對(duì)軟棗獼猴桃苗木的市場(chǎng)需求。在整個(gè)組培過(guò)程中，如何減少外植體的初培污染率和提高組培苗增殖系數(shù)是提高組培效率的兩個(gè)關(guān)鍵因素，本研究就軟棗獼猴桃外植體的滅菌消毒及繼代增殖進(jìn)行了研究，為今后軟棗獼猴桃的工廠化組培育苗提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

6月中旬，剪取寬甸地區(qū)軟棗獼猴桃基地2～3年生幼嫩枝條，帶回實(shí)驗(yàn)室水培催芽20天，剪取新萌發(fā)和幼嫩的長(zhǎng)勢(shì)良好的腋芽及莖段為外植體，進(jìn)行下一步的初代培養(yǎng)。

1.2 外植體的消毒滅菌

先剪取1.2～1.5厘米長(zhǎng)的腋芽，再將莖段剪至3.0～5.0厘米，用流水沖洗1～1.5小時(shí)，再用無(wú)菌水沖洗3次。在無(wú)菌室的超凈工作臺(tái)上，先用75%乙醇浸泡30秒，無(wú)菌水沖洗3遍后，用0.1%的氯化汞將腋芽分別浸泡2、3、4、5分鐘；莖段浸泡4、5、6、7分鐘，之后用無(wú)菌水沖洗5次左右，無(wú)菌濾紙吸干水分后，將腋芽3剪至1.0～1.2厘米，莖段剪成1.5～2.0厘米的單芽莖段，接種于培養(yǎng)基上，每瓶種接種1個(gè)外植體，每個(gè)處理接種20瓶，重復(fù)3次。培養(yǎng)10天后觀察兩種外植體的污染情況并統(tǒng)計(jì)污染率，30天觀察兩種外植體的成活情況并統(tǒng)計(jì)成活率。

1.3 培養(yǎng)基的制備及培養(yǎng)條件

初代培養(yǎng)基為MS+2.0毫克/升6-BA+0.1毫克/升NAA；本研究通過(guò)叢生芽增殖途徑和莖段扦插增殖途徑進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)。將初代培養(yǎng)后無(wú)菌苗1.5厘米左右的頂芽接種到以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的6-BA（1.0、2.0、3.0毫克/升）和NAA（0.1、0.2、0.3毫克/升）組合的繼代培養(yǎng)基中；將初代培養(yǎng)獲得的無(wú)菌苗剪取1.5厘米長(zhǎng)的莖段接種到以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的6-BA（0.5、1.0、2.0毫克/升）和NAA（0.1、0.2、0.3毫克/升）組合的繼代培養(yǎng)基中。以上每種處理均接種30瓶，每瓶接種1株，重復(fù)3次，所有培養(yǎng)條件均為：日光燈照明，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，空氣相對(duì)濕度50%～60%，光照時(shí)間13小時(shí)/天，光強(qiáng)為2000～3000Lx。培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌時(shí)間對(duì)外植體接種效果的影響

在組培過(guò)程中，外植體的消毒是控制組培苗污染率的首要步驟，選擇適宜的消毒劑，篩選最佳的消毒時(shí)間，才能獲得生長(zhǎng)良好的初代組培苗。本研究采用0.1%氯化汞溶液對(duì)軟棗獼猴桃的腋芽和莖段兩種外植體分別進(jìn)行滅菌消毒處理，結(jié)果表明：隨著滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)，幾種處理的外植體的污染率均呈下降趨勢(shì)。從表1可以看出，以腋芽為外植體的植株在滅菌時(shí)間為4分鐘時(shí)成活率達(dá)到最高（84%），當(dāng)滅菌時(shí)間為5分鐘時(shí)，雖然污染率差異不明顯，但成活率顯著下降。因此，腋芽的滅菌時(shí)間在4分鐘時(shí)為最佳，既可以很好的控制污染率，又具有很高的成活率。

從表2可以看出，隨著滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)，以莖段為外植體的初代培養(yǎng)污染率隨滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)成上升趨勢(shì)，而成活率呈先上升，后下降趨勢(shì)，在滅菌時(shí)間為5分鐘時(shí)成活率達(dá)到最高（92.4%），污染率達(dá)到比較好的效果（6.1）。因此，以軟棗獼猴桃莖段外植體在濃度為0.1%的氯化汞中滅菌5分鐘為最宜。

2.2 不同激素濃度對(duì)軟棗獼猴桃叢生芽增殖的影響

表1 滅菌時(shí)間對(duì)腋芽外植體培養(yǎng)的影響

表2 滅菌時(shí)間對(duì)莖段外植體培養(yǎng)的影響

芽的增殖和生長(zhǎng)受細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素濃度比例的影響，細(xì)胞分裂素能刺激芽的分化，生長(zhǎng)素控制芽的增長(zhǎng)。由表3可以看出，不同濃度配比的6-BA和 NAA對(duì)芽增殖效果也不相同。6-BA濃度一定時(shí)，隨著NAA濃度的增高，平均株高也隨之增高；6-BA對(duì)芽的增殖系數(shù)影響較大，當(dāng)6-BA為3.0毫克/升時(shí)，增殖系數(shù)達(dá)到最大（4.89），但在此濃度下，苗基部會(huì)偶有遇上組織產(chǎn)生，且玻璃化苗開(kāi)始增多，故綜合考慮，選擇MS+2.0毫克/升6-BA+0.2毫克/升NAA為最佳叢生芽增殖培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中的苗生長(zhǎng)健壯，葉平展?jié)饩G。

表3 不同濃度的6-BA和NAA對(duì)叢生芽增殖的影響

2.3 不同激素濃度對(duì)軟棗獼猴桃莖段繼代增殖的影響

由表4可以看出，6-BA和NAA對(duì)莖段繼代增殖的影響與芽增殖表現(xiàn)比較一致，即6-BA濃度增加有利于芽的增殖，NAA濃度與芽增殖無(wú)線(xiàn)性關(guān)系，但可促進(jìn)莖段的生長(zhǎng)。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為2.0毫克/升，NAA質(zhì)量濃度為0.3毫克/升時(shí)，增殖系數(shù)達(dá)到最大為5.13，并且植株長(zhǎng)勢(shì)健壯，葉色濃綠，莖粗。因此，在莖段增殖培養(yǎng)中最佳的培養(yǎng)基為MS+2.0毫克/升6-BA+0.3毫克/升NAA。

3 結(jié)論與討論

本研究使用軟棗獼猴桃的腋芽和莖段為外植體材料，篩選了兩種外植體的最佳消毒滅菌時(shí)間和適宜的繼代增殖培養(yǎng)基，結(jié)果表明，腋芽最佳滅菌時(shí)間為4分鐘，成活率達(dá)84%；莖段為5分鐘成活率達(dá)到最高為92.4%，污染率均相對(duì)較低。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，成活率降低，這是由于消毒劑的處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，雖可降低污染率，但同時(shí)也會(huì)對(duì)植株造成一定的傷害，植株受損害后會(huì)變褐死亡。不同的外植體的消毒滅菌時(shí)間也有所不同，因此在接種前要進(jìn)行必要的篩選。

表4 不同激素濃度配比對(duì)莖段繼代增殖的影響

通過(guò)篩選，軟棗獼猴桃的叢生芽最佳增殖培養(yǎng)基為MS+2.0毫克/升6-BA+0.2毫克/升NAA，叢生芽的增殖系數(shù)為4.86，植株長(zhǎng)勢(shì)健壯，葉色濃綠，這與已有相關(guān)研究結(jié)果較為一致。6-BA和NAA的濃度較低時(shí)，無(wú)法滿(mǎn)足植株對(duì)生長(zhǎng)激素的需求。因此，會(huì)影響芽的增殖系數(shù)和長(zhǎng)勢(shì)，當(dāng)6-BA和NAA的濃度過(guò)高時(shí)，莖段基部會(huì)出現(xiàn)愈傷組織，并有一定玻璃化苗產(chǎn)生，嚴(yán)重影響叢生芽的生長(zhǎng)。因此，植物激素的使用濃度不宜過(guò)高。在莖段增殖途徑中，雖然在2.0毫克/升6-BA+0.2毫克/升NAA的質(zhì)量配比組合中在株高最高，但增殖系數(shù)較低，故綜合考慮以M S+2.0毫克/升6-BA+0.3毫克/升 NAA為最佳增殖培養(yǎng)基。