唐世云 武玉香 莊金秋 郭廣君 王玉茂

兔病毒性出血癥又名兔瘟，是兔的一種急性、致死性的病癥，具有高度接觸性，以實(shí)質(zhì)器官水腫、淤血和出血性變化為特征。針對(duì)本病危害嚴(yán)重，都用兔病毒性出血癥組織滅活苗，對(duì)家兔進(jìn)行免疫接種，但是，疫苗免疫后還有大量養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生兔瘟，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。為此我們?cè)O(shè)想，有沒有一種簡(jiǎn)便的檢測(cè)兔瘟抗體的方法，一般實(shí)驗(yàn)室血凝檢測(cè)方法在養(yǎng)殖戶條件下操作性低，難以保證兔子兔瘟抗體的水平和防疫的有效性。筆者開展了兔瘟抗體試紙卡的研究，只需要幾滴血就能測(cè)出抗體。根據(jù)檢測(cè)情況，制定兔瘟的免疫時(shí)間、劑量等，制定兔瘟的免疫程序。

1試驗(yàn)材料

1.1材料與試劑

牛血清白蛋白（BSA），美國Sigma公司分裝；氯金酸，Sigma；羊抗鼠lgG抗體，上海捷寧生物技術(shù)有限公司；硝酸纖維素膜，Sartorius公司；兔瘟單克隆抗體，山東綠都生物科技有限公司；PVC底板，上海金標(biāo)生物科技公司；吸水紙，上海良信生物科技公司；

1.2儀器

QL-861渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；JE1002型電子天平（上海方瑞儀器有限公司）。UV1100紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用）；JK-ESS-500B恒溫磁力加熱攪拌器（上海麥尚科學(xué)儀器有限公司）；ZX1OOO bio-dot劃膜平臺(tái)（美國bio-dot公司），CT14RD高速冷凍離心機(jī)（德國BECK.MAN公司）；HGS201切條機(jī)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1制備膠體金溶液

膠體金免疫層析技術(shù)是以膠體金作為標(biāo)記物，其質(zhì)量對(duì)檢測(cè)體系起著至關(guān)重要的作用。最常用的制備膠體金的方法是化學(xué)還原法，不同種類的還原劑在相同攪拌速度下制備出的膠體金的粒徑范圍不同，通常情況下白磷法制備的膠體金粒徑為5～12 nm，鞣酸為5.7 nm左右，抗壞血酸為8～13 nm，硼氫化鈉僅為2 -5 nm，檸檬酸三鈉為16～147nm。經(jīng)過對(duì)比可以看到檸檬酸三鈉制備的膠體金溶液，粒徑范圍比較廣，其膠體金顆粒大小均勻，根據(jù)檸檬酸三鈉加入的量不同可以制備出粒徑不同的膠體金。在實(shí)驗(yàn)中，從最終制作出的檢測(cè)卡顯色條帶的顏色效果、成本、穩(wěn)定性以及產(chǎn)品的保質(zhì)期方面考慮，一般認(rèn)為粒徑為20～40 nm的膠體金顆粒是最適合做快速測(cè)試使用，而膠體金粒徑與質(zhì)量與還原劑檸檬酸三鈉的添加量、氯金酸與檸檬酸三鈉反應(yīng)的時(shí)間以及攪拌速度等多方面因素有關(guān)，然后再通過紫外可見掃描、透射電鏡對(duì)金液中金顆粒進(jìn)行驗(yàn)證評(píng)價(jià)，確定最佳的制備條件。本實(shí)驗(yàn)是采用檸檬酸三鈉做還原劑制備膠體金，具體方法為量取99 mL的超純水裝入250 mL的圓底燒瓶，放入攪拌子，置于恒溫磁力加熱攪拌器上，加入1 mL 1%氯金酸溶液，打開加熱開關(guān)，待溶液沸騰后迅速一次性加入檸檬酸三鈉溶液，氯金酸溶液逐步變?yōu)榛疑?，后由灰色變紅，最終變?yōu)榫萍t色，待顏色穩(wěn)定后再繼續(xù)加熱10 min，待溶液冷卻后，4℃保存?zhèn)溆?。本?shí)驗(yàn)采用檸檬酸三鈉三種不同加入量（分別為1.5 mL、1 mL、0.5mL），制備三種不同粒徑的膠體金溶液。通過電鏡觀察，當(dāng)檸檬酸三鈉的添加量為1ml，以200r/min速度攪拌時(shí)，其金顆粒大小均勻，外型為圓形，其直徑大小為22nm左右，符合膠體金制備的要求。（如圖1）

2.2抗體最佳標(biāo)記濃度確定

取5支1.5mL離心管，每支管中加入1mL膠體金溶液，再在一支試管中加入100μL 0.01 mol/LPBS溶液做為空白對(duì)照，在其它幾支離心管中各加入100μL用0.01mol/L PBS稀釋不同濃度（分別為15、30、45、60 μg/mL）抗體蛋白后搖勻，然后再每隔5 min搖1min，半小時(shí)后觀察顏色剛好穩(wěn)定趨于不變的紅色的那支離心管，其對(duì)應(yīng)的蛋白添加量為最少蛋白穩(wěn)定量，然后再在這個(gè)劑量的基礎(chǔ)上加20%確定為最適蛋白標(biāo)記量。如圖2和表1所示，當(dāng)加入抗體蛋白的量為0 mg/L時(shí)，試管中的顏色為紫色，表明加入的抗體蛋白量不足；當(dāng)加入15 mg/L抗體蛋白時(shí)，試管中的顏色為紫紅色，表明加入的抗體蛋白量還是不足；當(dāng)加入抗體蛋白量為30 mg/L的時(shí)候，試管中的顏色剛好趨于穩(wěn)定的紅色，表明此刻加入的抗體蛋白量正好可以與膠體金結(jié)合，一般在最低添加量的基礎(chǔ)上再加上20%作為實(shí)際工作用量，即36 mg/L為合適的抗體蛋白添加量。

2.3抗體標(biāo)記復(fù)溶液的確定

用低溫高速離心的方法純化金標(biāo)抗體，除去膠體金標(biāo)記抗體溶液中的聚集物以及其它雜質(zhì)，步驟如下：

①以12000 r/min，4℃離心30 min離心后去掉上清；

②用0.01 M pH7.4的PBS配制復(fù)溶液，將沉淀用各復(fù)溶液溶解至原體積，重復(fù)一次，最后離心沉淀用復(fù)溶液重懸至原體積的1/10，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4金標(biāo)結(jié)合墊的篩選

金標(biāo)結(jié)合墊種類一般有玻璃纖維膜、聚酯膜、纖維紙等，合格的金標(biāo)結(jié)合墊不但要求材質(zhì)穩(wěn)定，易于操作，而且最重要一點(diǎn)是其對(duì)金標(biāo)溶液有較低的非特異性吸附。本實(shí)驗(yàn)將SB06、GL048、Whatman33glass、Ahlstrom6613、Ahlstrom8964五種膜進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，最終選擇金標(biāo)抗體釋放完全，且背景顏色好的Ahlstrom8964作為金標(biāo)結(jié)合墊。

2.5硝酸纖維素膜上檢測(cè)線和質(zhì)控線的確定

用VP60蛋白標(biāo)記的膠體金作為探針，用純化的兔瘟病毒VP60蛋白按1：2，1：4，1：8，1：16濃度作為檢測(cè)線和質(zhì)控線試劑，在NC膜上劃線，加阻性血清檢測(cè)，血清中的抗兔瘟病毒抗體與SPA標(biāo)記的膠體金形成復(fù)合物，由于層析作用復(fù)合物沿膜帶移動(dòng)，與包被在檢測(cè)線上的兔瘟病毒vp60蛋白抗原形免疫膠體金復(fù)合物，富集檢測(cè)線上，顯示紅色，最終確定按1：8稀釋劃線在節(jié)約材料、使用效果方面比較好，所以最終確定其檢測(cè)線和質(zhì)控線。

2.6檢測(cè)卡的組裝

將DL42玻璃纖維膜裁剪成16mm× 300mm的長條， 作為樣品墊；將BL-1吸水紙裁剪成160mm×300mm的長條，作為吸水墊。首先將NC膜粘貼到PVC底板中間對(duì)應(yīng)的位置上，然后將金標(biāo)墊、樣品墊、吸水紙等按一定的順序、層次粘貼到PVC底板上，這樣就組裝成了大板，最后用切條機(jī)切割成4mm寬的細(xì)條，放進(jìn)金標(biāo)卡殼中，蓋上蓋壓緊、放上干燥劑密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.7檢測(cè)卡的靈敏性和特異性

按實(shí)驗(yàn)操作，將陽性兔瘟血清按1：8稀釋后，同時(shí)與其它陰性血清如腸炎和PBS溶液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果都無色帶出現(xiàn)，說明制作的膠體金檢測(cè)卡具有良好的特異性。

3檢測(cè)卡的使用

3.1用法

用吸管滴三滴全血（約100μL）或二滴血清（約60μL）進(jìn)入稀釋液中混勻，吸取4-5滴加入試紙卡加樣孔中，1分鐘后開始觀察結(jié)果，1 0分鐘后當(dāng)紅細(xì)胞在窗口中可見時(shí)終止觀察，根據(jù)示意圖判定結(jié)果。

3.2判定

如圖3所示，在試紙卡“C”（對(duì)照線）和“T”（檢測(cè)線）處均顯紅色，判為陽性（見圖A）；只在試紙卡“C”處或“T”（檢測(cè)線）顯紅色，均判為陰性（見圖B，C）。為了對(duì)本檢測(cè)卡進(jìn)行驗(yàn)證，分別對(duì)高青、濱州等地的幾個(gè)兔場(chǎng)進(jìn)行抽樣驗(yàn)證，一共抽取了120份血樣，在現(xiàn)場(chǎng)用研制的兔瘟膠體金檢測(cè)卡進(jìn)行全血檢測(cè)，剩余的血樣返回實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行血凝檢測(cè)，結(jié)果如下表2所示。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果表2來看，不但是血樣的陽性和陰性數(shù)能符合起來，就是的每一個(gè)血樣用兩種檢測(cè)方法所檢測(cè)出來的結(jié)果也是一一對(duì)應(yīng)的，完全吻合。而從表3可以看出，用檢測(cè)卡和血凝檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了兔場(chǎng)的免疫結(jié)果，從而對(duì)兔場(chǎng)的免疫做指導(dǎo)參考。

4結(jié)論

本研究的兔瘟抗體試紙條（卡），對(duì)兔瘟血清和全血的檢測(cè)效果明顯，靈敏度也比較高，其檢測(cè)稀釋1：8時(shí)陽性效果也非常清晰，與其它類型的血清和全血無明顯的陽性反應(yīng)，密封好的檢測(cè)卡在常溫保存下，其保藏期限可達(dá)18個(gè)月，具有操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，更適用于臨床的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、現(xiàn)場(chǎng)篩查等，從而根據(jù)檢測(cè)情況，可以基本判斷出整個(gè)兔場(chǎng)的兔瘟免疫水平，從而制定兔瘟的免疫時(shí)間、劑量，免疫程序，保證兔場(chǎng)的正常生產(chǎn)進(jìn)行。