朱根鳳，余同露,2，蔡棟梁,2，葉曉娟,2，閔太善,2，陳浩明,2，盧大儒,2

(1.復旦大學 生命科學學院，上海 200438； 2.復旦大學 現代人類學教育部重點實驗室，上海 200438)

乳腺癌嚴重威脅著女性健康，全世界每年新發(fā)病例高達150萬人，近年來，其發(fā)病率逐年上升[1]，在我國大城市已居女性惡性腫瘤發(fā)病率之首．乳腺癌細胞的惡性增殖和轉移是患者死亡的主要原因[2]，揭示其分子機制迫在眉睫．

1996年Claret等報導Jab1可與c-Jun的N端結合，將其名為Jab1(Jun activation domain-binding protein 1)，隨后發(fā)現其是COP9信號體(COP9 Signalosome Complexes, CSN)的第5個亞單位，因而Jab1又被稱為CSN5[3-4]．Jab1在動物、植物和真菌中序列高度保守，表明Jab1具有重要的功能[5-6]．

Jab1基因定位于人類8號染色體上，Jab1蛋白由334個氨基酸分子組成．它不僅存在于COP9信號體中，而且作為單體也與很多重要功能的蛋白相互作用，如介導P53從細胞核中轉運到細胞質中并降解，在多種腫瘤組織中檢測到Jab1過量表達，促進細胞增殖[7-9]．此外，Jab1能激活Jun家族中c-Jun和JunD，增強AP-1活性，與細胞癌變相關[10-12]．研究表明Jab1在乳腺癌、肝癌、肺癌和胰腺癌等多種腫瘤組織中特異性高表達，且這種高表達與腫瘤的發(fā)生相關[13-15]，但目前對Jab1調控的分子機制有待進一步揭示．

研究表明，THBS1(Thrombospondins1)蛋白是細胞膜表面鈣結合糖蛋白，屬于血小板反應蛋白家族[16-17]．它參與腫瘤新血管生成、腫瘤轉移，以及細胞粘附、遷移、增殖、凋亡等重要過程[18-19]，其編碼基因THBS1是潛在的抑癌基因，在胃癌、大腸腺癌等多種腫瘤中發(fā)生基因啟動子CpG島的異常甲基化而失活，并且THBS1基因甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密相關．

MCF7是常見的低浸潤性乳腺癌細胞代表，探索Jab1干擾對其生物學特性的影響，揭示相關的分子機制，對于深入了解低浸潤性乳腺癌的發(fā)生機制有重要意義．因此本研究在乳腺癌細胞MCF-7中建立Jab1的干擾表達系統，研究Jab1基因對乳腺癌細胞增殖、細胞遷移和細胞周期的影響，初步揭示Jab1可通過甲基化介導調控THBS1的表達，為進一步的分子機制研究打下基礎．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人乳腺癌細胞MCF-7、293T細胞為本室保存；TRIzol、Lipofectamine 2000試劑購自Invitrogen公司；實時定量PCR試劑購自Toyobo公司；HRP標記的Western blot二抗購自碧云天公司；體外侵襲實驗試劑盒購自Cell Biolabs公司；Jab1抗體購自于Thermo公司，THBS1和β-actin抗體購自Cell signaling公司；細胞培養(yǎng)試劑均購自Gibco公司．

1.2 細胞培養(yǎng)

293T、MCF-7培養(yǎng)使用高糖DMEM培養(yǎng)基，添加10% FBS以及1%的青霉素-鏈霉素雙抗，37℃培養(yǎng)于CO2培養(yǎng)箱．

1.3 慢病毒包裝

干擾Jab1表達的慢病毒shRNA，Jab1sh2： 5’-GCACTGAAACCCGAGTAAATG-3’，Jab1sh5： 5’-GCTTGAGCTGTTGTGGAATAA-3’；干擾Luciferase基因的對照組慢病毒shRNA序列，shLuc： 5’-CGTACGCGGAATACTTCGA-3’．

慢病毒包裝時，取生長狀態(tài)好的293T細胞，在10cm細胞培養(yǎng)皿中，以40μL的Lipofectamine 2000介導，轉入表達shRNA的慢病毒載體質粒7.5μg，以及3種輔助質粒PLP1、PLP2和VSVG各2.5μg，12h后換液，60h后收集病毒上清，2000r/min離心10min，上清用0.45μm濾器過濾并分裝后凍存于-80℃冰箱；感染時，取適量慢病毒，與懸浮的乳腺癌細胞混勻，添加4μg/mL的polybrene溶液．

1.4 實時定量PCR

慢病毒感染的細胞棄去培養(yǎng)基后使用PBS(137mmol/L NaCl,2.7mmol/L KCl,10mmol/L Na2HPO4,2mmol/L KH2PO4)將培養(yǎng)基洗干凈，加入TRIzol裂解，將細胞冰上放置10min，加入三氯甲烷震蕩15s，冷凍離心取上層，加入等量異丙醇充分混勻后離心，沉淀用75%乙醇洗滌，離心，棄上清，晾干，加入適量DEPC處理的水溶解，保存于-80℃冰箱．

定量PCR在ABI公司7900HT定量PCR儀上進行，結果由配套的SDS 2.4軟件進行分析，GAPDH基因作為內參，實驗進行3組重復；THBS1上游引物： CGGCCTCCCCTATGCTATCA；THBS1下游引物： GGTAACTGAGTTCTGACAGTGAC．

1.5 Western blot

經過慢病毒感染的細胞棄去培養(yǎng)基后用PBS將培養(yǎng)基洗干凈后，RIPA裂解液將細胞至于冰上裂解1h，冷凍離心取上清，Bradford法定量后將各蛋白裂解液用RIPA裂解液調整至統一濃度，加入適量蛋白上樣緩沖液，煮沸10min，取20μL進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后300mA恒流轉膜2h至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1h，TBST洗3次，加入一抗(按1∶1000稀釋)孵育2h，TBST洗3次，再加相應二抗(1∶1000稀釋)室溫孵育1h，加入顯色底物，顯影儀拍照．

1.6 CCK-8細胞增殖實驗

用Dojindo公司的CCK-8試劑盒，按照操作說明進行細胞增殖實驗的測定．將乳腺癌細胞消化后制成單細胞懸液，計數后，配成每毫升2×104個細胞后，每孔鋪100μL細胞，細胞培養(yǎng)一定時間后，加入CCK-8試劑顯色，溫育后酶標儀450nm測OD值．

1.7 劃痕實驗

接種乳腺癌細胞MCF-7于六孔板培養(yǎng)板中，形成致密單層后，用Tip頭貼著直尺在六孔板中輕輕劃痕，PBS洗去細胞碎片，再加入無血清培養(yǎng)基．選擇不同時間點，顯微鏡觀測細胞遷移情況，照相．

1.8 流式細胞儀檢測細胞周期

消化細胞，1000r/min 5min離心收集細胞，PBS洗2次．加適量PBS重懸(小于500μL)，加5mL -20℃預冷的70%乙醇，固定30min．離心，棄上清，PBS懸浮，再離心，棄上清．加400μL含25μg/mL碘化丙啶和1μg/mL RNase A的染色液室溫避光染色30min后，上機檢測細胞周期，用ModFit軟件分析結果．

1.9 統計分析

本研究中數值用“均值+標準差”表示，所有實驗重復3次以上，組間通過SPSS軟件的t-檢驗進行統計學分析．

2 結 果

2.1 慢病毒介導的Jab1基因的shRNA干擾

用制備的Jab1基因的shRNA干擾慢病毒(Jab1sh2和Jab1sh5)和對照慢病毒(shLuc)分別感染MCF-7細胞，192h后熒光顯微鏡觀察慢病毒介導的shRNA干擾表達情況，并抽提相應細胞總蛋白質，進行Western blot分析，檢測細胞內Jab1基因的表達水平，結果如圖1所示，可見光視野和熒光視野的對比結果表明(圖1(a))，高于90%的MCF-7細胞表達GFP熒光基因，說明shLuc、Jab1sh2和Jab1sh5慢病毒對MCF-7細胞的感染率高．

圖1(b)的Western blot檢測結果表明，在蛋白質水平上Jab1基因的shRNA慢病毒干擾細胞組中的Jab1蛋白的表達量顯著低于對照組．綜合圖1的結果表明，慢病毒介導的shRNA干擾使得MCF-7細胞中Jab1基因的表達顯著下調，乳腺癌細胞MCF-7中Jab1表達干擾系統構建成功．

圖1 MCF-7細胞中慢病毒介導的Jab1 RNAi的檢測Fig.1 Detection of Jab1 RNAi by Lentivirus-mediated shRNA in MCF-7 cells(a) 對照慢病毒和Jab1基因的shRNA干擾慢病毒感染后，顯微鏡拍攝的可見光和熒光照片，左邊為可見光照片，右邊為熒光照片；(b) Western blot檢測對照慢病毒和Jab1基因的shRNA干擾慢病毒感染后細胞中Jab1蛋白的表達水平，β-Actin基因為內參．

2.2 Jab1 RNAi對MCF-7細胞增殖的影響

用Jab1基因的shRNA干擾慢病毒(Jab1sh2和Jab1sh5)和對照慢病毒(shLuc)分別感染MCF-7細胞，CCK8細胞增殖檢測試劑盒檢測在Jab1基因的表達受到干擾后細胞增殖能力的變化，結果如圖2所示．可見Jab1sh2以及Jab1sh5慢病毒感染的兩組MCF-7實驗組細胞中的Jab1表達被干擾之后，細胞在450nm處的平均吸光值顯著低于對照慢病毒shLuc感染細胞的平均吸光值，由對照組的0.659分別下降至兩組實驗組的0.444以及0.401，統計分析表明，兩組實驗組和對照組相比差異極顯著(P<0.01)．這表明MCF-7細胞中Jab1基因的表達干擾使得細胞的增殖能力顯著下降，即Jab1對于MCF-7的細胞增殖能力具有重要作用．

圖2 Jab1 RNAi對MCF-7細胞增殖的影響Fig.2 Effect of Jab1 RNAi on the proliferation of MCF-7 cells450nm處的平均吸光值(n=5)代表細胞相對的增殖能力，**： P<0.01.

圖3 Jab1 RNAi對MCF-7細胞周期的影響Fig.3 Effect of Jab1 RNAi on the MCF-7 cell cycle將Jab1干擾表達實驗組和shLuc對照組MCF-7細胞PI避光染色后，用流式細胞儀測定細胞周期和sub G1期比例．

2.3 Jab1 RNAi對MCF-7細胞凋亡的影響

圖4 Jab1 RNAi對MCF-7細胞遷移能力的影響Fig.4 Effects of Jab1 RNAi on migration ability of MCF-7 cells對照慢病毒和Jab1基因的shRNA干擾慢病毒感染的細胞在劃痕0h、24h和48h觀察劃痕愈合情況．

流式細胞儀測定Jab1干擾表達實驗組和shLuc對照組MCF-7細胞的細胞周期和sub G1期比例，結果如圖3所示，測定的Jab1干擾表達實驗組Jab1sh2組和Jab1sh5組的sub G1期比例相較于shLuc對照組分別增加13.0%和15.2%，統計分析表明，兩者差異極顯著(P<0.01)．這表明乳腺癌中干擾Jab1的表達會增加細胞凋亡的比例．

2.4 Jab1 RNAi對MCF-7細胞遷移能力的影響

本研究用細胞劃痕愈合情況測定細胞的遷移能力，在劃痕后0h、24h和48h 3個時間點進行觀察拍照，結果如圖4所示，shLuc對照組細胞劃痕48h后已基本愈合，而Jab1干擾表達實驗組(Jab1sh2和Jab1sh5)則還留有明顯的劃痕口未能合攏，表明干擾Jab1的表達降低了MCF-7細胞的遷移速率，Jab1基因決定了細胞的遷移能力．

2.5 Jab1 RNAi對MCF-7細胞中THBS1蛋白表達的影響

本室前期的基因芯片研究表明，在MDA231細胞中干擾Jab1的表達，導致細胞中THBS1 mRNA水平下調．在MCF-7細胞中是否有類似情況，本研究做進一步揭示．

提取對照慢病毒和Jab1基因的shRNA干擾慢病毒感染后MCF-7細胞的總RNA，RT-PCR檢測表明，與對照組相比，Jab1表達干擾組中THBS1 mRNA的表達水平大大降低，如圖5(a)所示，統計分析表明，Jab1表達干擾組和對照組的表達水平差異極顯著(P<0.01)．

提取對照慢病毒和Jab1基因的shRNA干擾慢病毒感染后MCF-7細胞的總蛋白，Western blot檢測Jab1和THBS1的表達，結果如圖5(b)所示，隨著細胞內Jab1蛋白表達的下降，THBS1蛋白表達的水平明顯下調．

圖5 Jab1 RNAi對MCF-7細胞中THBS1蛋白表達的影響Fig.5 Effect of Jab1 RNAi on the expression of THBS1 protein in MCF-7 cells(a) RT-PCR檢測對照慢病毒和Jab1基因的shRNA干擾慢病毒感染后細胞中THBS1 mRNA的表達水平；(b) Western blot檢測對照慢病毒和Jab1基因的shRNA干擾慢病毒感染后細胞中Jab1和THBS1蛋白的表達水平(DMSO為空白組，5-Aza-dC為添加甲基化轉移酶抑制劑組)，β-Actin為內參．

為進一步研究Jab1是否會影響THBS1基因的DNA甲基化，本研究使用甲基化轉移酶抑制劑5-Aza-dC分別處理Jab1干擾表達實驗組和shLuc對照組，提取總蛋白Western blot檢測．如圖5(b)所示，5-Aza-dC處理Jab1干擾表達實驗組和shLuc對照組后，THBS1的表達水平相對于未加5-Aza-dC(DMSO組)發(fā)生了上調，甲基化轉移酶抑制劑5-Aza-dC能增加Jab1干擾組的THBS1表達水平，幾乎與對照組持平．說明Jab1基因調控THBS1的表達受甲基化水平的影響．

3 討 論

目前的研究表明，Jab1不僅作為COP9信號復合體的成員扮演著重要角色，而且作為單體，它調控了細胞內多種關鍵蛋白，在細胞周期調控、細胞信號傳遞等過程中發(fā)揮了重要功能，它在乳腺癌、肝癌和胃癌等多種腫瘤中表達上調，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有緊密相關[1,20]，但是，Jab1在乳腺癌細胞中的分子機制還有待深入的揭示．

本室前期的研究表明，在乳腺癌MDA-231細胞中，Jab1基因調控Nov基因和FraI基因的表達[21-22]，為Jab1分子機制研究打下了基礎．因MDA231為高侵染的乳腺癌細胞，因此本研究選擇低侵染的乳腺癌細胞MCF-7，試圖從另外一個角度闡明Jab1的調控機制．本研究首先建立了MCF-7細胞中Jab1的干擾表達系統，實現了對細胞中Jab1基因表達的高效干擾．CCK8細胞增殖實驗發(fā)現Jab1的表達干擾使得MCF-7細胞的增殖能力發(fā)生了顯著的下降，劃痕實驗證實Jab1的表達干擾能顯著抑制細胞的遷移，流式細胞儀分析表明干擾Jab1的表達能極大地誘導細胞進入凋亡．

研究表明干擾Jab1的表達能極大的增加sub G1期細胞的比例，sub G1代表細胞中亞二倍體的含量，這是細胞凋亡的重要指標，說明干擾Jab1的表達能造成部分細胞中DNA的斷裂和降解，誘導其凋亡，使得Jab1成為低浸潤乳腺癌細胞中一個重要的治療靶點，對將來的治療研究有積極意義．

越來越多的研究表明，THBS1在腫瘤的發(fā)生中具有多種功能，在胃癌、大腸癌、白血病等中是抑癌基因，而在乳腺癌演進的不同過程中功能迥異，乳腺原位癌中THBS1表達于基底膜，抑制腫瘤發(fā)生，在高組織學分級及伴有廣泛壞死的原位癌中表達缺失[23-26]．而Horiguchle等研究表明在淋巴結轉移陽性的乳腺癌中，THBS1的腫瘤細胞陽性表達率很高，提示它與腫瘤侵襲轉移相關[27]．本研究表明，在MCF-7細胞中其表達高，Jab1基因表達被干擾后，其表達也下降，說明THBS1的表達受Jab1調控．

前人有報導在腫瘤細胞中，THBS1的啟動子被甲基化而被抑制表達，Jab1是通過何種途徑調控THBS1的呢？本研究表明，用甲基轉移酶抑制劑5-Aza-dC處理，Western blot檢測表明Jab1基因表達干擾實驗組中THBS1的表達下降被極大的抑制，暗示Jab1可能是抑制表觀遺傳學中的甲基化修飾方式來調控THBS1基因的表達，Jab1干擾表達后其對THBS1啟動子區(qū)甲基化的抑制作用可能大大降低，增加了THBS1啟動子區(qū)的甲基化水平，抑制了THBS1的表達，在5-Aza-dC的作用下，THBS1啟動子區(qū)的甲基化被抑制，THBS1的表達增加．

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