邵駿驊，石 超，王亞倩，霍克克

(1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438； 2.復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438)

煙曲霉是一種條件致病的腐生真菌，在自然界中能夠產(chǎn)生大量的孢子存活于各種環(huán)境中[1]．近年來，隨著器官移植后免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用、艾滋病患者及HIV病毒攜帶者的增多、對血液病及惡性腫瘤等疾病的放化療使用等因素，使得免疫受損的人群逐年增長．在這些免疫力低下的人群中，煙曲霉的侵襲感染率高達(dá)50%，病死率約90%[2-3]．雖然煙曲霉導(dǎo)致的侵襲性肺曲霉病、重癥型哮喘、鼻竇炎等疾病的發(fā)病率逐年上升，但目前對其發(fā)病的分子機(jī)理尚未完全清楚，對其早期診斷方法和特效藥物研發(fā)方面也還沒能取得重大的突破，這也意味著煙曲霉將是人類戰(zhàn)勝真菌感染的征途上的一大難題[4]．

在真核生物中COFILIN基因編碼的絲切蛋白(COFILIN)和肌動(dòng)蛋白解聚因子(Actin Depolymerizing Factor, ADF)是肌動(dòng)蛋白的結(jié)合蛋白，它們可以用來切割或是解聚肌動(dòng)蛋白的細(xì)絲，并且能使細(xì)胞骨架產(chǎn)生活力．COFILIN基因序列和結(jié)構(gòu)具有高度的保守性，物種親緣關(guān)系越近則相似度越高[5]．它的活性是通過磷酸化、去磷酸化、磷酸肌醇、pH改變等因素進(jìn)行調(diào)節(jié)．COFILIN蛋白介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)的信號途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的多種生理活動(dòng)，如細(xì)胞凋亡、胞質(zhì)分裂、細(xì)胞遷移等[6]．在誘導(dǎo)物的刺激下，COFILIN能誘導(dǎo)形成片狀偽足并調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白骨架重組，從而引導(dǎo)癌細(xì)胞的侵襲[7]．

已知當(dāng)病原菌侵染人體時(shí)，首先接觸到宿主細(xì)胞表面，激活細(xì)胞內(nèi)的小G蛋白酶，通過LIMK(LIM kinase)、ROCK(Rho associated protein kinase)等信號分子調(diào)節(jié)COFILIN的磷酸化，從而在宿主細(xì)胞表面形成偽足或絲足，這類偽足或絲足易于病原菌的吸附．接著COFILIN會(huì)解開包裹在病原菌周圍囊泡后面的肌動(dòng)蛋白絲，讓病原菌順利侵入細(xì)胞[8-9]．在這個(gè)過程當(dāng)中，不僅宿主細(xì)胞的COFILIN在進(jìn)行調(diào)控，某些病原菌自身的COFILIN也會(huì)參與其中[10]．當(dāng)真菌作為病原體侵入人體時(shí)，COFILIN也同樣發(fā)揮著不可替代的作用．前人的研究[11]發(fā)現(xiàn)，煙曲霉孢子會(huì)引起上皮細(xì)胞出現(xiàn)褶皺，這種形態(tài)上的改變使得它更易于侵入A549細(xì)胞．在整個(gè)侵染的過程中，檢測到肌動(dòng)蛋白的骨架會(huì)重新排列，并伴隨有COFILIN磷酸化循環(huán)變化．也有研究報(bào)道煙曲霉孢子在侵染A549細(xì)胞時(shí)會(huì)膨脹并與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)脯氨酸肽酶(Prolidase, PLD)活性升高，從而提高侵染率[12]．而當(dāng)抑制PLD活性時(shí)，侵染率顯著降低．由于COFILIN與PLD有著密切的信號聯(lián)系，因此推測在煙曲霉入侵的過程中COFILIN也發(fā)揮著重要的作用[13-14]．

雖然相關(guān)的研究都表明COFILIN在煙曲霉侵染宿主細(xì)胞的過程中起到重要的作用，但其具體的作用機(jī)制仍未完全清楚．本文以煙曲霉COFILIN為誘餌從人巨噬細(xì)胞膜蛋白酵母雙雜交文庫篩選它的互作蛋白，從蛋白相互作用的角度探索煙曲霉COFILIN在宿主細(xì)胞中的作用機(jī)制及其生物學(xué)效應(yīng)．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

DNA限制性內(nèi)切酶SfiⅠ、dNTP Mix、10×DNA Loading Buffer購自TaKaRa公司．EasyTaq DNA Ploymerase、EasyPfu DNA Ploymerase、DNA Ladder購自北京全式金生物技術(shù)有限公司．Bacto-Agar、Yeast Nitrogen Base、Annexin V FITC/PE試劑盒購自BD公司．Tryptone和Yeast extract購自O(shè)xoid公司．氨基酸混合物Dropout、X-gal、Triton X-100、HEPES、Nodient P-40、IPTG、Tween-20均購自于Amresco公司．鮭魚精ssDNA、氨基-1,2,4-三唑(3-AT)、PEG3350、鼠抗Myc、Flag、GST、6×His的單克隆抗體和巰基乙醇以及FACS流式細(xì)胞術(shù)染色試劑碘化丙錠(PI)均購自Sigma & Aldrich公司．鼠抗GAPDH的單克隆抗體購自Abmart公司．HRP交聯(lián)的兔抗鼠二抗購自Proteintech公司．細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清和胰酶Trypsin-EDTA(0.25%)購自Gibco公司．Lipofectamine 2000脂質(zhì)體購自Invitrogen公司．蛋白酶抑制劑(protease inhibitor cocktail tables, complete EDTA-free)購自Roche公司．

膜蛋白酵母雙雜交試劑盒(DUALmembrane starter kit)購自Dualsystems Biotech公司質(zhì)粒抽提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司．酵母質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司．PVDF膜、化學(xué)發(fā)光底物檢測試劑(ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP Substrate, Cat. No. WBKLS0100)均購自Millipore公司．Protein G beads購自GE公司．Glutathione Sepharose 4B購自于Pharmacia Biotech公司．6、12、24和96孔板購自Corning公司．35mm玻底細(xì)胞培養(yǎng)皿購自NEST公司．厚濾紙購自上海天能公司．X光片為Kodak公司產(chǎn)品．蛋白預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)為Thermo Scientific公司產(chǎn)品，其它試劑均為國產(chǎn)分析純．

1.1.2 克隆、文庫、質(zhì)粒和菌株

煙曲霉COFILIN基因cDNA克隆(AFUA_5G10570)源自A.fumigatusAf293菌株，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制研究所韓黎教授惠贈(zèng)．煙曲霉Af293菌株的膜蛋白酵母雙雜交文庫由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建．膜蛋白酵母雙雜交菌株為S.cerevisiaeNMY32，酵母雙雜交誘餌載體質(zhì)粒為pBT3SUC，獵物載體質(zhì)粒為pPR3N．大腸桿菌菌株為E.coliBL21(DE3)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞株分別為HEK293T、HeLa和THP-1．

1.2 方法

1.2.1 膜蛋白酵母雙雜交文庫篩選及回轉(zhuǎn)驗(yàn)證

將煙曲霉COFILIN基因的cDNA克隆構(gòu)建到誘餌載體pBT3SUC上并轉(zhuǎn)化酵母NMY32菌株．用化學(xué)轉(zhuǎn)化方法將人巨噬細(xì)胞cDNA膜蛋白酵母雙雜交文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)入已含有誘餌質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞，涂布SD-Leu-Trp-His-Ade+60mmol/L 3-AT(SD-4)平板進(jìn)行培養(yǎng)．從文庫篩選板上挑取能激活HIS3、ADE2和LacZ3個(gè)報(bào)告基因的陽性菌落轉(zhuǎn)接到含有更高(120mmol/L)3-AT濃度的(SD-4)平板做進(jìn)一步鑒定確認(rèn)．抽提陽性酵母菌落質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌擴(kuò)增后進(jìn)行DNA測序和BLAST分析．對分離得到的陽性克隆質(zhì)粒再重新回轉(zhuǎn)僅含有誘餌克隆質(zhì)粒的酵母細(xì)胞，以驗(yàn)證相互作用的真實(shí)性．

1.2.2 GST pull-down

構(gòu)建pGEX-5x-1-GOSR1和pET28a-COFILIN兩個(gè)原核表達(dá)質(zhì)粒，分別表達(dá)GST-GOSR1和6×His-COFILIN融合蛋白．將這兩個(gè)重組質(zhì)粒和pGEX-5x-1空載體分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)菌株，活化后以終濃度0.2mmol/L的IPTG在16℃誘導(dǎo)16h．誘導(dǎo)完成后冰浴0.5h，用超聲破壁儀裂解菌體得到上清，破壁參數(shù)： 220W，破壁2s，暫停3s，60次．將GST-GOSR1和GST蛋白用Glutathione Sepharose 4B珠子純化，將6×His-COFILIN蛋白用Ni-NTA親和樹脂珠子純化．將結(jié)合有GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B懸浮于500μL NETN buffer(100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl pH 7.0，0.5% Nonidet P-40，1mmol/L PMSF)，加入50μL純化的6×His-COFILIN融合蛋白，4℃結(jié)合過夜．沉淀用適量buffer H(20mmol/L Tris-HCl pH 7.7，50mmol/L KCl，20% Glycerol，0.1% Nonidet P-40，0.007% β-巰基乙醇)洗滌3次．沉淀用anti-His單克隆抗體進(jìn)行Western blot檢測．

1.2.3 免疫共沉淀(Co-IP)

構(gòu)建pEGFP-GOSR1和pEF-Flag-COFILIN這兩個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒，分別表達(dá)GFP-GOSR1和Flag-COFILIN融合蛋白．先將這兩個(gè)重組質(zhì)粒連同pEGFP空載體和pEF-Flag-COFILIN作為陰性對照共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，培養(yǎng)48h后收獲細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液(150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCL，1% NP-40，1mmol/L DTT，5mmol/L EDTA，使用前加入蛋白酶抑制劑)裂解后，取上清加入少量Protein G Agarose親和凝膠珠子震蕩1h進(jìn)行預(yù)沉淀，再加入anti-GFP和Protein G Agarose親和凝膠珠子震蕩過夜進(jìn)行免疫共沉淀，沉淀用anti-Flag的單克隆抗體進(jìn)行Western blot檢測．

1.2.4 亞細(xì)胞共定位

分別構(gòu)建兩組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-GOSR1和pDsRED-COFILIN；pEGFP-COFILIN和pDsRED-GOSR1．將轉(zhuǎn)染試劑(LipofectamineTM2000 Transfection Reagent)稀釋于Opti-MEM中，輕輕混勻，避免劇烈吹打，3000r/min，3s，室溫靜置5min；將這兩組質(zhì)粒按照1∶1混合后稀釋于Opti-MEM中，輕輕混勻，避免劇烈吹打，3000r/min，3s，室溫靜置5min．將轉(zhuǎn)染試劑溶液緩慢地滴加到質(zhì)?；旌先芤褐校p輕混勻，3000r/min，3s，室溫靜置20min．吸去原來的培養(yǎng)液，更換適量Opti-MEM(約為正常培養(yǎng)液用量的一半)，將混合液慢慢加入培養(yǎng)皿中，輕輕晃勻．繼續(xù)培養(yǎng)24h，用4%多聚甲醛固定，DAPI染細(xì)胞核，采用共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果．

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)檢測

用不同劑量的pEF-Flag-COFILIN分別轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞并轉(zhuǎn)染pEF-Flag空載體和shRNA作為對照．培養(yǎng)48h后收獲細(xì)胞，加入TRIzol，提取總RNA．選用逆轉(zhuǎn)錄引物建立反轉(zhuǎn)錄體系，用待檢測基因的RT-PCR專用引物，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)平行反應(yīng)，相對定量的檢測GOSR1基因的表達(dá)情況．

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后(對數(shù)生長期)，倒去培養(yǎng)液，胰酶適度消化制成單細(xì)胞懸液，用PBS(137mmol/L NaCl, 2.7mmol/L KCl, 10mmol/L Na2HPO4, 2mmol/L KH2PO4)洗兩次．打孔： 0.3% Triton X-100至終濃度為0.03%．染色： 加入PI至終濃度為50μg/mL，室溫避光染色10min．48μm(300目)濾網(wǎng)過濾，用流式細(xì)胞儀(BD FACS)檢測細(xì)胞周期變化．

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后(對數(shù)生長期)，加入100mmol/L H2O2至終濃度為2mmol/L處理細(xì)胞以誘導(dǎo)凋亡．在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h．經(jīng)胰酶適度消化后，用PBS洗兩次，用BD FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I檢測細(xì)胞凋亡．用1×Binding Buffer重懸細(xì)胞使細(xì)胞濃度約為1.0×106/mL并取100μL轉(zhuǎn)移至5mL離心管．加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI，混合均勻，25℃避光反應(yīng)15min．每個(gè)離心管再加入400μL的1×Binding Buffer，上機(jī)做檢測細(xì)胞凋亡情況，1h內(nèi)完成檢測．

2 結(jié) 果

圖1 陽性克隆與COFILIN的回轉(zhuǎn)驗(yàn)證結(jié)果Fig.1 Rotary verification of the 62 positive clones with COFILIN將62種陽性克隆質(zhì)粒(其中7號為GOSR1)分別與COFILIN誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母菌株后接種在SD-TLHA平板培養(yǎng)3d后的結(jié)果．不生長或生長極弱者(如： 25、33、78、89號)為沒有通過驗(yàn)證．+： 陽性對照(pNubG-Fe65+pTSU2-APP)，—： 陰性對照(pPR3N+pTSU2-APP)．

2.1 煙曲霉COFILIN能與人GOSR1發(fā)生蛋白相互作用

為了尋找煙曲霉菌COFILIN在宿主細(xì)胞中的相互作用蛋白，本文采用基于分裂的泛素(split ubiquitin)重構(gòu)原理建立的膜蛋白酵母雙雜交技術(shù)篩選人巨噬細(xì)胞cDNA文庫．首先將構(gòu)建好的誘餌克隆質(zhì)粒pBT3SUC-COFILIN轉(zhuǎn)化酵母受體菌株NMY32進(jìn)行自激活檢測，結(jié)果顯示pBT3SUC-COFILIN存在一定程度的自激活作用，但能被濃度≥60mmol/L的3-AT所抑制．因此，將人巨噬細(xì)胞文庫質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化含有誘餌克隆pBT3SUC-COFILIN的酵母菌株后，先涂布在含有60mmol/L 3-AT的SD-TL平板上進(jìn)行培養(yǎng)，共得到102個(gè)初始陽性菌落．對這些陽性菌落中的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序，并對序列進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果表明它們分別屬于62種蛋白的編碼基因克隆．為進(jìn)一步檢驗(yàn)這些陽性克隆序列所表達(dá)的蛋白與COFILIN之間的相互作用，將它們再次分別轉(zhuǎn)化含有誘餌克隆pBT3SUC-COFILIN的酵母菌株并涂布含有120mmol/L 3-AT的SD-TLHA平板進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗(yàn)證．結(jié)果顯示GOSR1等58個(gè)陽性克隆通過了回轉(zhuǎn)驗(yàn)證(圖1)．

2.2 COFILIN與GOSR1的相互作用

為了排除酵母細(xì)胞內(nèi)其他因素介導(dǎo)而產(chǎn)生的假陽性相互作用，我們構(gòu)建了pGEX-5x-1-GOSR1和pET28a-COFILIN兩個(gè)原核表達(dá)質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)菌株進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)過分離純化后將這兩種融合蛋白進(jìn)行GST pull-down實(shí)驗(yàn)，同時(shí)以pGEX-5x-1空載體表達(dá)產(chǎn)物為陰性對照．結(jié)果顯示6×His-COFILIN蛋白能被結(jié)合有GST-GOSR1蛋白的親和樹脂珠子吸附，而不能被僅結(jié)合GST蛋白的珠子吸附．這表明在體外沒有任何其他蛋白介導(dǎo)的情況下，COFILIN可以與GOSR1發(fā)生直接的蛋白相互作用(圖2)．

圖2 COFILIN與GOSR1在體外的蛋白相互作用驗(yàn)證Fig.2 Verification of the interaction between COFILIN and GOSR1 in vitro1. pET28a-COFILIN表達(dá)產(chǎn)物；2. pGEX-5x-1空質(zhì)粒和pET28a-COFILIN表達(dá)產(chǎn)物；3. pGEX-5x-1-GOSR1和pET28a-COFILIN表達(dá)產(chǎn)物.

為了進(jìn)一步了解這兩個(gè)蛋白在細(xì)胞環(huán)境內(nèi)是否真實(shí)存在相互作用，我們構(gòu)建了pEGFP-GOSR1和pEF-Flag-COFILIN這兩個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒，并將pEGFP-GOSR1分別與pEF-Flag-COFILIN及與pEGFP空載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，將培養(yǎng)收獲的細(xì)胞裂解液進(jìn)行Co-IP檢測．結(jié)果如圖3所示，F(xiàn)lag-COFILIN及GFP-GOSR1兩種融合蛋白都能順利表達(dá)(泳道3、泳道4)，其中結(jié)合有GFP-GOSR1融合蛋白的凝膠珠子可以把Flag-COFILIN融合蛋白免疫共沉淀下來(泳道2)，而只結(jié)合GFP蛋白的珠子則不能共沉淀Flag-COFILIN融合蛋白(泳道1)．這表明COFILIN和GOSR1可以在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生特異性的蛋白直接相互作用．

圖3 COFILIN與GOSR1在體內(nèi)的相互作用驗(yàn)證Fig.3 Verification of the interaction between COFILIN interacts and GOSR1 in vivo1和4： pEF-Flag-COFILIN與pEGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染；2和3： pEF-Flag-COFILIN與pEGFP-GOSR1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染．

2.3 COFILIN與GOSR1相互作用區(qū)段的確定

由于全長GOSR1蛋白共有250個(gè)氨基酸殘基，為了分析GOSR1中與COFILIN蛋白相互作用的結(jié)合部位，我們構(gòu)建了GOSR1的兩個(gè)截短體： pEGFP-GOSR1△A(1～105 aa)和pEGFP-GOSR1△B(96～250 aa)，如圖4(a)所示．將pEGFP-GOSR1、pEGFP-GOSR1△A、pEGFP-GOSR1△B和pEGFP空載體分別與pEF-Flag-COFILIN共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)48h后收獲細(xì)胞做Co-IP實(shí)驗(yàn)，用anti-FLAG單克隆抗體檢測不同的GOSR1截短體與COFILIN的蛋白相互作用．結(jié)果如圖4(b)所示，轉(zhuǎn)染有pEGFP-GOSR1和pEGFP-GOSR1△A的細(xì)胞可以將Flag-COFILIN共沉淀下來，而pEGFP-GOSR1△B和pEGFP空載體則不能與Flag-COFILIN共沉淀．這表明GOSR1△A和全長GOSR1一樣可以與COFILIN在體內(nèi)發(fā)生蛋白相互作用，而GOSR1△B則喪失了與COFILIN發(fā)生蛋白相互作用的能力．這提示GOSR1中含有兩個(gè)Coiled coil結(jié)構(gòu)域的1～105 aa區(qū)段是其與COFILIN發(fā)生蛋白結(jié)合的重要部位．

圖4 COFILIN和GOSR1相互作用區(qū)域確定Fig.4 COFILIN and GOSR1 Interaction region determination(a) GOSR1的缺失體構(gòu)建示意圖，其中9～30位和68～95位aa內(nèi)各有一個(gè)Coiled coil結(jié)構(gòu)域，230～250位aa為跨膜結(jié)構(gòu);(b) 1. pEGFP-GOSR1和pEF-Flag-COFILIN共轉(zhuǎn)染為陽性對照；2. 截短體pEGFP-GOSR1△A與pEF-Flag-COFILIN共轉(zhuǎn)染；3. 截短體pEGFP-GOSR1△B與pEFlag-COFILIN共轉(zhuǎn)染；4. pEGFP和pEF-Flag-COFILIN共轉(zhuǎn)染為陰性對照．箭頭標(biāo)示Flag-COFILIN．

2.4 COFILIN與GOSR1在細(xì)胞中的共定位

兩個(gè)蛋白在細(xì)胞中具有共同的空間定位是它們之間能發(fā)生相互作用的前提條件．為了檢驗(yàn)COFILIN與GOSR1在細(xì)胞內(nèi)是否有相互接觸并且發(fā)生相互作用的基礎(chǔ)，我們進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)熒光共定位檢測實(shí)驗(yàn)．結(jié)果如圖5所示，GFP-GOSR1和RED-COFILIN在HeLa細(xì)胞內(nèi)的熒光共定位檢測結(jié)果顯示，GFP-GOSR1僅在細(xì)胞質(zhì)中定位；而RED-COFILIN在整個(gè)細(xì)胞中都有分布，且在細(xì)胞質(zhì)中的分布量高于細(xì)胞核內(nèi)．GFP-COFILIN和RED-GOSR1在細(xì)胞內(nèi)的熒光共定位檢測結(jié)果顯示，GFP-COFILIN在整個(gè)細(xì)胞中都有分布，而RED-GOSR1只在細(xì)胞質(zhì)中定位．此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雖然GOSR1只定位在細(xì)胞質(zhì)，但由于COFILIN蛋白在整個(gè)細(xì)胞都有分布，且在細(xì)胞質(zhì)中的含量高于細(xì)胞核，因此這兩個(gè)蛋白具有在細(xì)胞質(zhì)中相遇并發(fā)生相互作用的空間基礎(chǔ)．

2.5 COFLIN的過表達(dá)會(huì)抑制GOSR1

為了研究煙曲霉COFILIN蛋白與宿主內(nèi)源GOSR1蛋白的相互作用會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生什么生理效應(yīng)，我們首先通過調(diào)節(jié)煙曲霉COFILIN表達(dá)質(zhì)粒對HEK293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染量，檢測COFILIN的過表達(dá)對細(xì)胞內(nèi)源GOSR1蛋白表達(dá)量的影響．結(jié)果如圖6所示，隨著pEF-Flag-COFILIN轉(zhuǎn)染量的增加，F(xiàn)lag-COFILIN融合蛋白的表達(dá)水平也相應(yīng)提高，但細(xì)胞內(nèi)源GOSR1蛋白的表達(dá)量均顯著低于僅轉(zhuǎn)染pEF-Flag空載體的陰性對照．提示煙曲霉COFILIN的過表達(dá)會(huì)使細(xì)胞內(nèi)源GOSR1的蛋白表達(dá)受到抑制．

圖6 過表達(dá)COFILIN在蛋白水平上抑制GOSR1Fig.6 COFILIN decreases the protein expression of endogenous GOSR1泳道從1到4依次是轉(zhuǎn)染pEF-Flag-COFILIN 1μg、2μg、3μg和pEF-Flag空載體2μg到HEK293T細(xì)胞．

因GOSR1是具有重要功能的蛋白質(zhì)，如果COFILIN抑制了它的表達(dá)，勢必會(huì)引起一系列生物學(xué)效應(yīng)．為了確認(rèn)這些效應(yīng)是由于這兩個(gè)蛋白相互作用引起的，我們通過RNA干擾改變細(xì)胞內(nèi)GOSR1蛋白的表達(dá)水平，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的對照．小分子的RNA能夠在轉(zhuǎn)錄水平與目的基因的mRNA結(jié)合，從而抑制該基因的表達(dá)．本實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)了3條針對GOSR1的shRNA(shRNA768、shRNA769、shRNA770)用于在HEK293T細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)，以削減內(nèi)源GOSR1的表達(dá)．

為了進(jìn)一步分析COFILIN對GOSR1表達(dá)的抑制是發(fā)生在蛋白水平還是轉(zhuǎn)錄水平，我們又進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)．將不同量的pEF-Flag-COFILIN、pEF-Flag空載體以及shRNA768分別轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，并在12孔板培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48h后，通過抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行RT-PCR檢測，對每個(gè)樣品中的每個(gè)基因都做3個(gè)平行重復(fù)．

實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，作為陽性對照的shRNA可以顯著降低內(nèi)源GOSR1的mRNA水平，在用不同劑量轉(zhuǎn)染pEF-Flag-COFILIN質(zhì)粒的3組細(xì)胞內(nèi)，GOSR1的mRNA水平都不同程度地低于陰性對照組，但降低幅度與pEF-Flag-COFILIN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量并不呈現(xiàn)正相關(guān)性．表1、圖7(看第160頁)表明煙曲霉的COFILIN對GOSR1在轉(zhuǎn)錄和翻譯的水平都有抑制，但主要表現(xiàn)在翻譯水平．

表1 RT-PCR檢測GOSR1相對hACTB的mRNA水平

注： 樣品1、2、3分別轉(zhuǎn)入了pEF-Flag-COFILIN重組質(zhì)粒0.5μg、1μg、2μg；樣品4轉(zhuǎn)入了shRNA768作為陽性對照；樣品5轉(zhuǎn)入了pEF-Flag空載體2μg作為陰性對照．以轉(zhuǎn)入pEF-Flag空載體的細(xì)胞內(nèi)GOSR1的mRNA水平為參照，熒光定量PCR檢測不同轉(zhuǎn)染條件下細(xì)胞內(nèi)GOSR1與內(nèi)參ACTB(Actin-β)的相對mRNA水平．

圖7 GOSR1相對hACTB的mRNA水平Fig.7 mRNA levels of endogenous GOSR1 relative to hACTB樣品1、2、3依次轉(zhuǎn)入了pEF-Flag-COFILIN重組質(zhì)粒0.5μg、1μg、2μg；樣品4轉(zhuǎn)入了shRNA768作為陽性對照；樣品5轉(zhuǎn)入了pEF-Flag空載體2μg作為陰性對照.

2.6 COFILIN的過表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞增殖

為研究COFILIN與GOSR1相互作用對細(xì)胞的生理效應(yīng)，我們又檢測了這對蛋白互作對HEK293T細(xì)胞增殖的影響．本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置了3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，第一組轉(zhuǎn)染pEF-Flag空載體和pEF-Flag-COFILIN，第二組轉(zhuǎn)染pEGFP空載體和pEGFP-GOSR1，第三組分別轉(zhuǎn)染CON55(陰性對照)、shRNA768、shRNA769和shRNA770．培養(yǎng)24h后，采用MTT細(xì)胞活性法(OD490)對細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行檢測．結(jié)果如圖8所示，煙曲霉COFILIN的過表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞增殖(圖8(a))，內(nèi)源GOSR1的過表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞增殖(圖8(b))，但敲減內(nèi)源GOSR1的表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞增殖(圖8(c))．提示煙曲霉COFILIN通過與內(nèi)源GOSR1相互作用降低后者表達(dá)而使細(xì)胞增殖受到抑制．

圖8 MTT細(xì)胞活性檢測Fig.8 MTT cell activity assay(a) pEF-Flag空載體和pEF-Flag-COFILIN共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞；(b) pEGFP空載體和pEGFP-GOSR1共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞；(c) CON55對照質(zhì)粒分別與shRNA768、shRNA769、shRNA770共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞．

2.7 COFILIN與GOSR1的相互作用影響細(xì)胞周期

為進(jìn)一步了解煙曲霉COFILIN過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增殖減緩所產(chǎn)生的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)，我們又檢測了它對細(xì)胞周期的影響，檢測結(jié)果如圖9所示．

圖9 細(xì)胞周期的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果Fig.9 Cell cycle results detected by flow cytometry(a) 實(shí)驗(yàn)組1，分別轉(zhuǎn)染pEGFP空載體、pEGFP-COFILIN、pEGFP-GOSR1的HEK293T細(xì)胞24h后流式細(xì)胞檢測細(xì)胞周期的分析圖表．實(shí)驗(yàn)組2，分別轉(zhuǎn)染CON55、shRNA768、shRNA769、shRNA770細(xì)胞24h后流式細(xì)胞檢測細(xì)胞周期的分析圖表．結(jié)果用ModFit LT V3.311(Mac)進(jìn)行分析．(b) 細(xì)胞周期百分比圖．

在實(shí)驗(yàn)組1中，過表達(dá)GFP-COFILIN融合蛋白的細(xì)胞G2期較陰性對照(轉(zhuǎn)染pEGFP空載體)相比有所增多，但過表達(dá)GFP-GOSR1的細(xì)胞G2期細(xì)胞與陰性對照無明顯差別；在實(shí)驗(yàn)組2中，RNA干擾內(nèi)源GOSR1后的細(xì)胞與陰性對照(轉(zhuǎn)染CON055)相比，G2期細(xì)胞也有所增多．提示過表達(dá)的煙曲霉COFILIN蛋白可通過與GOSR1相互作用并降低GOSR1蛋白的表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生G2期阻滯．

2.8 COFILIN與GOSR1的相互作用影響細(xì)胞凋亡

經(jīng)過前面的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，煙曲霉COFILIN在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)會(huì)在一定程度上抑制細(xì)胞增殖并導(dǎo)致細(xì)胞G2期阻滯．那么它是否會(huì)引起細(xì)胞凋亡？我們用BD ANNEXIN-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測了細(xì)胞的凋亡情況．結(jié)果如圖10(看第162頁)所示，在實(shí)驗(yàn)組1中，細(xì)胞凋亡率(早期凋亡和晚期凋亡)分別為25.49%、37.10%和22.61%，其中轉(zhuǎn)染pEF-Flag-COFILIN的細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡均比空載體上升，而轉(zhuǎn)染pEF-Flag-GOSR1則有所下降．在實(shí)驗(yàn)組2中，細(xì)胞凋亡率為26.01%、34.71%、42.74%和51.46%，轉(zhuǎn)染shRNA的細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡均高于對照組．表明煙曲霉COFILIN過表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而內(nèi)源的GOSR1的表達(dá)減少也會(huì)加速細(xì)胞的凋亡．提示細(xì)胞內(nèi)源GOSR1對于H2O2毒性而導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡具有一定的保護(hù)作用，煙曲霉COFILIN可通過與內(nèi)源GOSR1蛋白的相互作用抑制其功能促進(jìn)細(xì)胞凋亡．

圖10 細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果Fig.10 Cell apoptosis results detected by flow cytometry實(shí)驗(yàn)組1： 分別轉(zhuǎn)染pEF-Flag、pEF-Flag-COFILIN、pEF-Flag-GOSR1到HEK293T細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組2： 分別轉(zhuǎn)染CON055、shRNA768、shRNA769、shRNA770到HEK293T細(xì)胞．

3 討 論

本文首次以煙曲霉COFILIN基因?yàn)檎T餌從人巨噬細(xì)胞膜蛋白酵母雙雜交文庫中篩選發(fā)現(xiàn)了一批新的相互作用蛋白，并重點(diǎn)對COFILIN與GOSR1之間的蛋白相互作用及其細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行了探索研究．

GOSR1屬于SNARE(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)大家族，即可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子連接復(fù)合體[15]．它在高爾基體內(nèi)部囊泡的運(yùn)輸及高爾基體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間囊泡的運(yùn)輸中發(fā)揮著重要的作用[16]．GOSR1的主要功能是參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體運(yùn)輸?shù)膶雍腿诤?，它在高爾基體超低密度脂蛋白運(yùn)輸囊泡的融合中具有重要的功能[17]，但它的其他細(xì)胞生物學(xué)功能還沒有被清楚地報(bào)道過．

在真核生物中，細(xì)胞器與細(xì)胞器之間，細(xì)胞與細(xì)胞間的物質(zhì)與信息交流是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本保證，而囊泡的運(yùn)輸是細(xì)胞器之間和細(xì)胞之間物質(zhì)交流和信息傳遞的主要方式[18]．大多數(shù)的囊泡融合過程由SNARE介導(dǎo)，因此不同物種間的SNARE具有高度的保守性．SNARE蛋白家族成員組成的膜融合系統(tǒng)調(diào)控著細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的主要運(yùn)輸[19-21]．

致病力蛋白是致病真菌入侵機(jī)體的關(guān)鍵因素，也是其逃逸宿主免疫系統(tǒng)防御的主要手段．煙曲霉侵入宿主黏膜上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，是其躲避宿主免疫攻擊、穿越組織屏障的重要機(jī)制．其間發(fā)生細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架重排，而COFILIN是此過程的重要調(diào)控核心，因此也被認(rèn)為是其主要的致病力蛋白之一，但目前人們對其過程了解仍非常有限[22-24]．

我們通過在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)煙曲霉COFILIN，發(fā)現(xiàn)其會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源性的GOSR1表達(dá)量下調(diào)，熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也顯示COFILIN抑制了GOSR1 mRNA的轉(zhuǎn)錄，提示COFILIN與GOSR1在體內(nèi)的相互作用降低了內(nèi)源GOSR1的表達(dá)量．進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)煙曲霉的COFILIN進(jìn)入宿主細(xì)胞表達(dá)后，細(xì)胞的增殖會(huì)受到抑制并發(fā)生G2期阻滯，同時(shí)促進(jìn)在H2O2誘導(dǎo)下的細(xì)胞凋亡．這與采用RNA干擾將GOSR1的蛋白表達(dá)水平敲低出現(xiàn)的結(jié)果相同．反之，若通過轉(zhuǎn)染外源GOSR1過表達(dá)增加其蛋白水平，就能使細(xì)胞增殖速度加快并抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，且G2期細(xì)胞與空載體陰性對照沒有明顯差異．這表明煙曲霉COFILIN與宿主內(nèi)源GOSR1蛋白的相互作用對細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等生理過程的調(diào)控有重要影響．

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