李 巖，韓 超，毛宏梅，石麗麗，陳 晨，趙金鵬，卓 勤

(中國疾病預防控制中心營養(yǎng)與健康所，北京 100050)

隨著基因工程技術的發(fā)展，通過向小麥中轉入抗逆基因，為減少干旱對作物造成的影響開創(chuàng)了新的途徑。導入在植物干旱脅迫中起重要作用的轉錄因子脫水應答元件結合(DREB)基因，是近幾年植物耐旱基因工程研究的重要方向[1]。到目前為止，通過基因工程技術轉入DREB基因，已明顯提高了擬南芥A、大麥、水稻、煙草、大豆等多種作物的耐旱性[2-3]。本課題的研究對象為轉GmDREB3基因抗旱小麥，該小麥由中國農科院作物研究所從有持久耐鹽性的大豆品種鐵豐8號中克隆了DREB類轉錄因子基因GmDREB3，通過基因槍轉化導入我國小麥主產區(qū)推廣小麥品種—濟麥22而獲得。

在按照NY/T1102-2006“轉基因植物及其產品食用安全檢測大鼠90d喂養(yǎng)試驗”進行常規(guī)毒性評價的基礎上[4-5]，本課題組對轉基因小麥和親本小麥谷劑量組大鼠及AIN93對照組大鼠的外周血全血淋巴細胞分型及血清細胞因子表達及肝腎組織免疫復合物沉積情況進行了檢測，以了解轉GmDREB3基因小麥對大鼠免疫系統(tǒng)相關指標的影響，為轉GmDREB3基因抗旱小麥的安全性評價提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品

轉GmDREB3基因抗旱小麥MG11-1(16聯(lián)鑒10)及親本小麥(濟麥-22)由中國農業(yè)科學院提供。

1.2 實驗動物

SD大鼠(SPF級)，140只，雌雄各半，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，生產許可證號：SCXK(京)2016—0002。飼養(yǎng)地點：中國醫(yī)學科學院實驗動物所動物房，級別：屏障環(huán)境，許可證號：SYXK(京)2013-0019。

1.3 主要儀器

電子天平、全自動血細胞分析儀(XT-1800i)、日立7600全自動生化分析儀、流式細胞儀(apogee universal 50)(美國Luminex公司)、MAGPIX型多功能液態(tài)懸浮芯片系統(tǒng)。

1.4 主要試劑

大鼠流式抗體：Rat CD3 APC(557030)、Ms IgM Kpa ItCl APC(550883)、Rat CD4 FITC(561833)、Ms IgG2a Kpa ItCl FITC(554647)、Rat CD8a PerCP(558824)、Hu IL-4 PE-Cy7(560672)、Rat CD45RA APC-Cy7(561624)、Ms IgG1 Kpa ItCl APC-Cy7(557873)、Rat CD161a NKP-P1A PE(555009)、Ms IgG1 Kpa ItCl PE(550617)，BD公司；免疫組化試劑：兔抗大鼠IgG H&L、Abcam山羊抗大鼠IgM- Mu chain，Abcam 公司；Milliplex大鼠細胞因子/趨化因子液相芯片磁珠試劑盒，美國Merk Millipore公司。

1.5 樣品配制

根據(jù)轉基因小麥和親本小麥營養(yǎng)成分檢測結果，以AIN93繁殖飼料配方為基礎，在營養(yǎng)平衡的基礎上，以飼料中最大摻入量作為高劑量組(76.6%)，依次向下設立中劑量組(38.3%)、低劑量組(19.2%)。

1.6 分組

選取實驗動物140只，隨機分為7組，每組20只，雌、雄各半，試驗開始時各動物體重之間的差異不超過平均體重的±20%。各組具體如下：CN組(AIN93對照組)、GL組(轉基因小麥低劑量組)、GM組(轉基因小麥中劑量組)、GH組(轉基因小麥高劑量組)、nGL組(親本小麥低劑量組)、nGM組(親本小麥中劑量組)、nGH組(親本小麥高劑量組)。

1.7 試驗方法及指標檢測

試驗期間，動物自由進食、飲水。試驗末期(第90d)，動物空腹過夜，稱解剖前體重，腹主動脈采集自凝血和抗凝血進行指標檢測。

1.7.1 全血淋巴細胞分型 抗凝血用流式細胞儀檢測T淋巴細胞(CD3+CD45RA-)、T淋巴細胞亞群(CD4+、CD8+)、B淋巴細胞(CD3-CD45RA+)、NK細胞(CD3-CD161a+)指標，按照抗體說明書操作：100 μL抗凝全血中同時加入5μL CD45RA-APC/Cy7、2μL CD4-FITC、5μL CD3-APC、5μL CD161a-PE、5μL CD8-PerCP 5種抗體，同時設置陰性空白、同型對照、單標記對照。輕輕混勻，室溫避光保存30min。每管加入細胞裂解液1mL，輕輕混勻，避光約15min。待管內液體透亮，1 000 r/min離心5min，棄上清。每管加入1mL pH 7.2 PBS，輕輕混勻，1 000 r/min離心5min，棄去上清液。重新洗滌1次，用400μL PBS混勻后進行流式分析。

1.7.2 免疫球蛋白和補體檢測 自凝血分離血清，按試劑盒說明，用全自動生化分析儀檢測免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、補體C3、補體C4。

1.7.3 血清細胞因子檢測 用Magpix多功能液相芯片檢測系統(tǒng)對8種細胞因子MIP-1a、IL-4、IL-1b、IL-2、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1進行檢測。按照Milliplex大鼠細胞因子/趨化因子磁珠法檢測試劑盒說明書操作：樣品使用前10 000g 4 ℃離心10min，取上清進行檢測。96 孔板每孔加200μL Assay Buffer，室溫條件下密封、振蕩10 min；去除Assay Buffer，加25μL標準品或對照品；背景孔和樣品孔中加25μL Assay Buffer；加25μL血清基質到背景、標準品和對照孔中；每樣品孔加25μL1∶2稀釋的樣品；振蕩混勻，每孔加25μL微球后密封，室溫避光震蕩孵育2h；洗板2 次；加25μL 檢測抗體，震蕩孵育1h；加25μL鏈霉素標記的藻紅蛋白，震蕩孵育30min；洗板2 次；加125μL 鞘液，振蕩重懸5min，采用多功能液態(tài)懸浮芯片系統(tǒng)檢測；用Milliplex Analyte軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

1.7.4 免疫器官臟器重量和臟器系數(shù) 取動物的脾臟、胸腺組織并稱重，計算臟體比=器官重量/動物體重×100%。

1.7.5 肝腎組織免疫復合物 對轉基因小麥高劑量組、親本小麥高劑量組和對照組肝、腎組織進行免疫復合物檢查。二甲苯脫蠟、酒精梯度復水后，將玻片放入枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6)，微波爐修復；PBS清洗3次；用5% BSA封閉30min，甩干液體，滴加稀釋的抗體IgM或IgG，37℃孵育2h。；取出，室溫30min后PBS清洗3次；DAB顯色；蘇木素復染3～5min，自來水沖洗，鹽酸酒精分化6～7s，自來水沖洗；分化、脫水、透明后封片。

1.8 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用 SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析法進行總體比較，以α=0.05作為顯著性水平，發(fā)現(xiàn)差異采用Dunnett法對各劑量組與對照組比較，如發(fā)現(xiàn)差異則進一步對轉基因組與相應親本組進行比較。

2 結果與分析

2.1 免疫球蛋白和補體指標

由表1可見，雌雄大鼠IgG、IgM、C3、C4 指標7組之間比較均無顯著性差異(P>0.05)。

表1 轉基因小麥對雌性大鼠免疫球蛋白和補體的影響

注：與CN組比較，P> 0.05

2.2 細胞表型指標

由表2可見，雌性大鼠：nGM組CD4細胞百分比與CN組和GM組相比明顯減少(P<0.01)，其他各劑量組與CN組相比均無顯著性差異(P>0.05)。雄性大鼠：GM組和nGM組T淋巴細胞與CN組相比明顯降低(P<0.05或P<0.01)；GH、nGL、nGM、nGH組B淋巴細胞與CN組相比明顯降低(P<0.05或P<0.01)；nGL組NK細胞與CN組相比明顯升高(P<0.05)，但上述差異指標在轉基因小麥與親本小麥相應劑量組之間無顯著性差異(P>0.05)。

表2 轉基因小麥對大鼠血液細胞表型的影響

注：與對照組比較，*P<0.05、**P<0.01；相應親本組比較，△△P<0.01

2.3 細胞因子指標

對轉基因小麥高劑量組、親本小麥高劑量組及對照組大鼠血清的MIP-1a、IL-4、IL-1b、IL-2、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1細胞因子進行檢測(表3)。其中IL-4、IL-2、IL-6 檢測結果明顯低于試劑盒相應細胞因子的最低檢測濃度，IL-1β、IL-10的檢測結果大部分在檢出限附近，因此對上述細胞因子的檢測結果不進行統(tǒng)計分析。對MIP-1a、IL-18、MCP-1的檢測結果可見，MIP-1a、IL-18、MCP-1等3個指標各組之間無顯著性差別(表4)。

表3各細胞因子的最低檢測濃度匯總表單位單位：pg/mL

細胞因子MIP-1aIL-4IL-1βIL-2IL-6IL-10IL-18MCP-1最低檢測濃度2.44.92.412.273.27.312.229.3

表4 轉基因小麥對大鼠細胞因子MIP-1a、IL-18、MCP-1含量的影響

注：與對照組比較，P>0.05

2.4 鼠臟器重量及臟體比

由表5可見，以不同摻入量的轉基因小麥和親本小麥摻料給予大鼠90d，轉基因小麥和親本小麥各劑量組雄性大鼠胸腺重量與對照組相比明顯降低(P<0.01)，各劑量組轉基因小麥雄性大鼠胸腺重量和親本小麥相比無顯著性差異。其余雌雄各劑量組大鼠臟器重量及臟體比與對照組相比均無顯著性差異。

表5 轉基因小麥對大鼠臟器重量及臟體比的影響

注：與對照組比較，**P<0.01。與相應親本小麥組比較，P>0.05

2.5 肝、腎組織IgG、IgM免疫復合物檢查

各組肝、腎組織均未見免疫復合物沉積見圖1～4。

圖1 肝組織IgG

圖2 肝組織IgM

圖3 腎組織IgG

圖4 腎組織IgM

3 結論與討論

免疫毒性評價是轉基因食品安全性評價的敏感指標，如Prescott V等[6]報道用含60%轉Bt基因大米與含0.1%純化Bt蛋白的飼料喂養(yǎng)大鼠28d，能誘導明顯的抗Bt-IgG1反應，而大鼠90d喂養(yǎng)實驗未觀察到Bt蛋白對大鼠有毒性作用[7]。Finamore等[8]的研究也顯示，轉MON810基因玉米喂養(yǎng)斷乳或老年小鼠30d或90d，對小鼠的腸道、脾臟、外周血淋巴細胞的細胞表型和血清細胞因子產生了不同的影響，但用轉MON810基因玉米喂養(yǎng)大鼠的常規(guī)毒理學指標未檢測到與轉MON810相關的毒性反應。以上研究顯示，轉基因食品對機體免疫系統(tǒng)指標的改變明顯早于常規(guī)毒理學指標的改變，因此，免疫毒性評價是評價轉基因食品安全性的敏感指標，是轉基因食品安全性評價必不可少的組成部分[9]。但是由于免疫系統(tǒng)的復雜性，目前沒有一種實驗方法能完全檢測免疫毒性化合物所引起的免疫損傷，因此要確定外來物質是否對免疫系統(tǒng)結構或功能產生了影響，通常需要進行一系列試驗。美國國家毒理學規(guī)劃委員會(NTP)1988年推薦了嚙齒類動物免疫毒性二級檢測方案，由歐盟、美國、日本三方成員國組成的人用藥品注冊技術規(guī)范國際協(xié)調會(ICH)于2005對藥品的免疫毒性評價達成共識，發(fā)布了人用藥品免疫毒性研究指導原則[10]。

參考上述指導原則/檢測方案，本課題選取大鼠的部分免疫指標進行檢測，以了解轉GmOREB3基因小麥90d喂養(yǎng)對大鼠免疫系統(tǒng)的影響。細胞表型結果顯示，轉基因小麥中劑量組雄性大鼠T淋巴細胞與對照組相比明顯降低，轉基因小麥高劑量組雄性大鼠B淋巴細胞與對照組相比明顯降低，但上述指標轉基因小麥組與親本小麥相應劑量組比較無顯著性差異，說明該差異并非由轉入的基因引起。免疫反應涉及很多細胞因子，大多數(shù)細胞因子在正常大鼠體內含量較低，受限于大鼠multi-plex試劑盒限制，本課題選取與免疫毒性相關的MIP-1a、IL-4、IL-1b、IL-2、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1共8個指標對轉GmOREB3基因小麥高劑量組、親本小麥高劑量組和對照組大鼠血清進行檢測。其中IL-4、IL-2、IL-6 檢測結果明顯低于試劑盒相應細胞因子的最低檢測濃度，IL-1β、IL-10指標每組均有部分樣本檢測結果低于檢測線，且高于檢出限的樣本例數(shù)各組間無明顯差別。MIP-1a、IL-18、MCP-1的檢測結果可見，各組間無顯著性差異。綜上可見，給予轉GmOREB3基因小麥未引起大鼠血清細胞因子產生明顯變化。臟器系數(shù)結果可見，各劑量組轉基因小麥喂養(yǎng)大鼠的胸腺重量與對照組相比明顯降低，但與相應的親本小麥劑量組相比，未見顯著性差異，說明該差異與轉入的基因無明顯相關性。其余各項指標各組之間均無顯著性差異。

綜上，轉GmDREB3基因抗旱小麥喂養(yǎng)大鼠90d未見對大鼠免疫系統(tǒng)相關指標產生影響。當然，依據(jù)上述檢測指標無法對轉GmDREB3基因抗旱小麥的免疫毒性進行全面的評價，有必要從非特異性免疫功能分析、特異性體液和細胞免疫分析、腸道粘膜免疫分析等方面進行進一步深入研究，以全面了解轉基因小麥對動物免疫系統(tǒng)的影響，為轉基因食品的安全性評價提供更為可靠的數(shù)據(jù)，保障轉基因食品的安全。◇

[1]Mallikarjuna G，Mallikarjuna K，Reddy MK，et al.Expression of OsDREB2A transcription factor confers enhanced dehydration and salt stress tolerance in rice(Oryza sativa L)[J]. Biotechnol Lett，2011，33(8)：1689-1697.

[2]Li XP，Tian AG，Luo GZ，et al.Soybean DRE-binding transcription factors that are responsive to abiotic stresses [J]. Theoretical and Applied Genetics，2005，110(8)：1355-1362.

[3]Ban QY，Liu GF，Wang YC.A dreb gene from Limonium bicolor mediates moledular and physiological responses to copper stress in transgenic tobacco [J]. J Plant Physiol，2011，168(5)：449-458.

[4]European Food Safety Authority.Explanatory statement for the applicability of the Guidance of the EFSA Scientific Committee on conducting repeated-dose 90-day oral toxicity study in rodents on whole food/feed for GMO risk assessment [J]. EFSA Journal，2014，12(10)：3871.

[5]中華人民共和國農業(yè)部.中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準.NY/T1102-2006 轉基因植物及其產品食用安全檢測 大鼠90d喂養(yǎng)試驗[S].

[6]Stine Kroghsbo，Charlotte Madsen，Morten Poulsen，et al.Immunotoxicological studies of genetically modified rice expressing PHA-E lectin or Bt toxin in Wistar rats [J]. Toxicology，2008,245(1)：24-34.

[7]Hammond BG，Dudek R，Lemen JK，et al.Results of a 90-day safety assurance study with rats fed grain from corn borer-protected corn [J]. Food Chem Toxicol，2006，44(7)：1092-1099.

[8]Alberto Finamore，Marianna Roselli，Serena Britti，et al.Intestinal and peripheral immune response to MON810 maize ingestion in weaning and old mice [J]. J Agric Food Chem，2008，56(23)：11533-11539.

[9]Momma K，Hashimoto W，Yoon H J，et al.Safety assessment of rice genetically modified with soybean glycinin by feeding studies on rats[J]. Biosci Biotechnol Biochem，2000，64(9)：881-886.

[10]ICH：S8 (Step 4)Immunotoxicity Studies For Human Pharmaceuticals[S].