屈 燕，劉潤燕，黃 帥，高 晶，張運(yùn)峰，胡 芬

（1. 華北理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山 063000；2. 唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山 063000）

miRNA在胚胎的發(fā)育、細(xì)胞的增殖和分化以及腫瘤的發(fā)生等許多生物學(xué)功能上都發(fā)揮著重要的作用[1-3]。目前，許多研究結(jié)果均已證實(shí)在腫瘤組織中miRNA的異常表達(dá)會導(dǎo)致其調(diào)節(jié)的靶基因表達(dá)異常，進(jìn)而使miRNA有促進(jìn)或抑制腫瘤發(fā)生的功能[3]。由于 miRNA是通過其靶基因來發(fā)揮功能的，所以找到miRNA調(diào)控的靶基因是對其生物學(xué)功能研究至關(guān)重要的一步。

hsa-miR-219-5p為內(nèi)含子型miRNA，最新研究證實(shí)，miR-219參與了細(xì)胞增殖、分化和凋亡調(diào)控，并在肝癌[4-6]、腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤[7]、胃癌[8]和卵巢癌[9]等多種癌癥中發(fā)揮著重要的生理功能。miR-219通過靶向 SALL4在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤生長和轉(zhuǎn)移中起抑制作用[7]。此外，miR-219-5p通過下調(diào) Twist/Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[9]。DNA異常甲基化是 microRNA異常表達(dá)的機(jī)制之一，在肝癌中miR-219上游1094bp區(qū)域CpG島存在異常甲基化，miR-219在肝癌細(xì)胞株的表達(dá)下調(diào)，證實(shí)miR-219是潛在的抑癌基因[4]。還有研究發(fā)現(xiàn)，長時間上夜班的女性，miR-219啟動子高甲基化，從而降低了miR-219的表達(dá)，導(dǎo)致免疫介導(dǎo)的抗腫瘤活性下調(diào)和乳腺癌風(fēng)險增加[10]。本研究利用生物信息學(xué)的工具進(jìn)行多重比較，尋找新的hsa-miR-219-5p調(diào)控靶基因，進(jìn)行功能分析。

1 方法

1.1 miR-219-5p的成熟序列的獲得及其物種進(jìn)化分析

從 miRBase數(shù)據(jù)庫①獲得 10個物種的miR-219-5p的成熟序列。采用MEGA5.0軟件分析miR-219-5p的物種間進(jìn)化的保守性。

1.2 has-miR-219-5p的靶基因預(yù)測

采用TargetScan7.1和miRDB兩大miRNA的靶基因預(yù)測中的生物軟件對 hsa-miR-219-5p的靶基因進(jìn)行了預(yù)測，獲取兩大軟件預(yù)測到的靶基因的交集，再與 miRTarbase中已經(jīng)證實(shí)的hsa-miR-219-5p的靶基因取并集，最終形成靶基因集合用于后續(xù)生物信息軟件分析。

1.3 靶基因集合的Gene Ontology（GO）富集分析

應(yīng)用GO生物數(shù)據(jù)庫對上述has-miR-219-5p的靶基因集合進(jìn)行了生物學(xué)過程以及分子功能注釋和富集分析，經(jīng)顯著性分析，p＜0.01為顯著性差異，得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因注釋和富集分析結(jié)果。

1.4 靶基因集合的 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）富集分析

利用 KEGG數(shù)據(jù)庫對 hsa-miR-219-5p的靶基因集合進(jìn)行了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析，通過Fisher Exact Test統(tǒng)計(jì)分析具有統(tǒng)計(jì)差異的p值，p＜0.01表示顯著性閾值，代表靶基因集合相對于背景具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的信號傳導(dǎo)通路。

2 結(jié)果

2.1 miR-219-5p成熟序列進(jìn)化分析

從 miRBase數(shù)據(jù)庫中獲取了多個物種的miR-219-5p成熟序列，其中人的hsa-miR-219-5p為內(nèi)含子型miRNA，hsa-miR-219的前體序列位于人的六號染色體33207835-33207944[+]，成熟序列是 5’-UGAUUGUCCAAACGCAAUUCU-3’。采用MEGA5.0對人、獼猴、小鼠、安大略鮭、大鼠、牛、大猩猩、非洲瓜蟾、馬、斑胸草雀10個物種的 miR-219-5p的成熟序列進(jìn)行了比對分析，結(jié)果顯示miR-219-5p在牛中是22個堿基，在安大略鮭和斑胸草雀中是 23個堿基，其余的都是 21個堿基，且堿基序列完全一致，如圖 1所示。該結(jié)果表明 miR-219-5p的成熟序列在脊椎動物進(jìn)化過程中具有高度的保守性。

圖1 10種不同物種中miR-219-5p成熟序列的比對分析

2.2 has-miR-219-5p的靶基因預(yù)測

TargetScan7.1預(yù)測hsa-miR-219-5p有445個靶基因，而 miRDB預(yù)測其靶基因數(shù)量為 174，對上述兩種軟件的預(yù)測結(jié)果取交集，最后共獲得123個靶基因。另外，miTarbase數(shù)據(jù)庫中顯示的經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測和/或 Northern blotting試驗(yàn)證實(shí)的 hsa-miR-219a靶基因共有 6個（CAMK2G、GPC3、MT1F、PSMD6、EGFR、TRIB3），其中 3個和預(yù)測的一致，占所有預(yù)測靶基因集合的 2.4%。合計(jì)預(yù)測靶基因和已經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的靶基因，共計(jì)獲得126個靶基因的數(shù)據(jù)集合用于后續(xù)的基因注釋和信號通路富集分析。

GXYLT1, EYA1, FAM91A1, ELMOD2, GBA2, LEF1,SLC16A7, SDK1, CD164, INPP5J, DAZAP1, UBASH3B,PPARGC1A, ANKRD44, THRB, CHD7, TRHDE, RECK, PIGR,PDGFRA, ABCB10, AFF4, MEF2D, DCAF10, KCNA4, DDAH1,SOX6, CAPS, RORB, PIP5K1C, FBXO30, CBX2, RASSF3,PCDH17, PRDM16, ETV5, SMC4, ATG14, SEMA4G, FOXJ3,CGNL1, TSC22D2, FZD4, CRLF3, PHF19, TMEM98, FMNL2,SNTB2, CLOCK, ZBTB18, FAM199X, DIAPH3, GBP5,LAPTM4A, FURIN, ISL1, GLTSCR1L, COL9A1, ASH1L,SLC41A1, ZCCHC14, KMT2D, DNAL1, SP4, ELOVL7,CCDC28A, ROR1, NR2C2, SLC35F5, MECOM, SCARB2,SLC39A10, SLC31A1, FBXO3, TGFBR2, KIAA1549, RIMS1,SLC16A6, ADD2, PKNOX1, MIER3, RNF6, SNRK, MMS19,NDRG4, CC2D1A, RPRD2, SOX14, TMX4, UBE3A, ABHD13,THSD7B, PKDCC, TPCN1, DOK6, AFAP1L2, KBTBD8, HAS3,CBFA2T3, ZNF609, CACUL1, ACOX1, SLC30A4, LGALSL,PIGG, DNAJC6, AKAP13, LPP, TRIB3, EGFR, PSMD6, GPC3,UBE2Z, KLF16, KCNH8, NEK6, T, MT1F, STRBP, CAMK2G,UBR1, PDE4D, MFNG, INSIG1, SYT5, RBMS3

2.3 hsa-miR-219-5p靶基因的GO富集分析

為進(jìn)一步分析hsa-miR-219-5p的生物功能，應(yīng)用GO數(shù)據(jù)庫對上述靶基因集合進(jìn)行了GO注釋、生物學(xué)過程和分子功能分類富集分析，結(jié)果126個靶基因中，共獲得122個基因的GO注釋描述和生物功能注釋信息。通過分析發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-219-5p靶基因的功能主要集中基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)合成與代謝等，如表1所示。

表1 hsa-miR-219-5p靶基因集合的GO生物學(xué)過程和分子功能分類結(jié)果

表2 hsa-miR-219-5p靶基因集合的KEGG通路富集分析結(jié)果

2.4 hsa-miR-219-5p靶基因集合的 KEGG富集分析

miRNAs的眾多靶基因通常協(xié)同參加同一細(xì)胞信號通路，本研究采用KEGG經(jīng)典通路數(shù)據(jù)庫對 hsa-miR-219-5p的靶基因集合進(jìn)行了信號通路富集分析。hsa-miR-219-5p的靶基因顯著富集于癌信號通路、肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控、MAPK等相關(guān)信號通路以及前列腺癌、胃癌、肝癌等疾病信號通路，如表2所示。

3 討論

miR-219-5p在多個物種中的成熟序列高度一致，進(jìn)化過程中相對保守，表明該基因參與了重要的生命基本活動，GO富集分析也表明miR-219-5p的靶基因參與基因轉(zhuǎn)錄翻譯多個過程。

采用生物信息學(xué)方法進(jìn)行miRNA靶基因預(yù)測方法很多，但應(yīng)用最為廣泛的是 miRDB、TargetScan7.1和PicTar三大預(yù)測軟件[11-12]。這三種軟件算法不同、各有優(yōu)缺點(diǎn)，采用TargetScan7.1和miRDB兩種軟件聯(lián)合應(yīng)用的方法對hsa-miR-219-5p的靶基因進(jìn)行預(yù)測，并取兩種軟件均預(yù)測的交集，聯(lián)合 miTarbase數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的靶基因，共同作為hsa-miR-219-5p的靶基因集合，用于后續(xù)分析，大大提高了預(yù)測的準(zhǔn)確性、減少了假陽性。

通過對hsa-miR-219-5p的靶基因進(jìn)行KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-219-5p的靶基因參與了 MAPK等信號通路，并且顯著地富集于肝癌、胃癌、前列腺癌等多種疾病，因此has-miR-219-5p的表達(dá)異?？赡軈⑴c了一些疾病的發(fā)生。這一結(jié)果與已有文獻(xiàn)報(bào)道[4-8,13]相一致。

[注釋]

① 從 http：//www.mirbase.org/中下載 Homo sapiens（人）、Macaca mulatta（獼猴）Mus musculus（小鼠）、Salmo salar（安大略鮭）、Rattus norvegicus（大鼠）、Bos taurus（牛）、Gorilla gorilla（大猩猩）、Xenopus tropicalis（非洲瓜蟾）、Equus caballus（馬）、Taeniopygia guttata（斑胸草雀）共10個物種的成熟序列。

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