楊園園，許乾麗，黎殊

貴州省食品檢驗(yàn)檢測(cè)所，貴陽(yáng) 550001)

辣椒面作為貴州具有特色的辣椒制品，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。近年來(lái)，因違法添加染料等非食用物質(zhì)而導(dǎo)致的食品安全事故時(shí)有報(bào)道。衛(wèi)生部在2008年以來(lái)就陸續(xù)發(fā)布了5批《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單和易濫用的食品添加劑名單》,其中就包括堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22和酸性橙II等非食用物質(zhì)，這4種屬于染料，由于其著色穩(wěn)定、價(jià)格低廉，被一些商家非法添加到辣椒面中以改善色澤。但長(zhǎng)期接觸這些染料可能會(huì)致癌，因此嚴(yán)禁將此使用于食品中。為此，建立簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法變得尤其重要。通過(guò)文獻(xiàn)報(bào)道，染料類物質(zhì)的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[1-5]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[6]等，目前關(guān)于同時(shí)測(cè)定辣椒面中堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22和酸性橙II的國(guó)標(biāo)方法未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)提取、離心、測(cè)試，建立了辣椒面中堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22和酸性橙II的HPLC測(cè)定方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

戴安Ultimate 3000高效液相色譜儀；Chromeleon 7.0工作站 美國(guó)Thermo Fisher公司；電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；離心機(jī) 長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；XW-80A渦旋振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 材料

堿性橙2對(duì)照品(批號(hào)：6A15G020， 98%)；堿性橙21對(duì)照品(批號(hào)：4A14K050，100%)；堿性橙22對(duì)照品(批號(hào)：6A16G050，100%)；酸性橙II對(duì)照品(批號(hào)：C1573500，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer，96.3%)；乙腈(色譜純，默克公司)；乙酸銨、乙酸(分析純，成都市科龍化工試劑廠)；辣椒面樣品(貴州省食品藥品監(jiān)督管理局稽查部門抽樣提供)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的配制

分別精密稱取堿性橙2 對(duì)照品0.01096 g、堿性橙21對(duì)照品0.01071 g、堿性橙22對(duì)照品0.01036 g、酸性橙II對(duì)照品0.01012 g，置于100 mL量瓶中，加少量水溶解，再加50%甲醇至刻度，得到4種對(duì)照品儲(chǔ)備液，濃度分別為107.41，107.1，103.6，97.456 μg/mL。

吸取酸性橙II儲(chǔ)備液10 mL于100 mL量瓶中，加水至刻度搖勻，制得溶液濃度為9.7456 μg/mL。

加標(biāo)實(shí)驗(yàn)所需的標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別吸取堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22儲(chǔ)備液各1.00 mL，酸性橙II儲(chǔ)備液0.5 mL于25 mL容量瓶中，加水至刻度搖勻，制得堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22和酸性橙II溶液濃度分別為4.296，4.284，4.144，1.949 μg/mL。

2.2 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取5 g樣品于50 mL塑料離心管中，加入10 mL 70%乙腈水溶液，超聲提取20 min后，以4000 r/min離心10 min，取20 μL液相色譜測(cè)定。

2.3 色譜條件

2.3.1 色譜柱

Capcell PAK C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)。

2.3.2 流動(dòng)相

A:乙腈；B：10 mmol/L 乙酸銨水溶液(乙酸0.12%)0 min→14 min(A：30%→82%)；14 min→15 min(A：82%→82%)；15 min→16 min(A：82%→30%)。

2.3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)

酸性橙II和堿性橙2為450 nm；堿性橙21和堿性橙22為485 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品加標(biāo)溶液注入色譜儀，其色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 A：混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖；B:加標(biāo)樣品溶液色譜圖Fig.1 A:The chromatogram of mixed standard solution; B:The chromatogram of spiked sample solution

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、酸性橙II的線性關(guān)系考察

分別精密吸取堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、酸性橙II每種各1，3，5，7，9 mL于100 mL容量瓶中，制備成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。注入液相色譜儀，進(jìn)樣體積為20 μL，記錄峰面積A，以峰面積A對(duì)濃度C(μg/mL)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、酸性橙II的回歸方程、線性方程和線性范圍Table 1 The regression equation, linear equation and linear range of basic orange 2, basic orange 21, basic orange 22 and acid orange II

2.4.2 精密度測(cè)試

取標(biāo)準(zhǔn)曲線第二點(diǎn)，即堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為3 μg/mL，酸性橙II為0.3 μg/mL，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20 μL，測(cè)得堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、酸性橙II峰面積的RSD分別為0.5%，1.0%，0.8%，1.6%。結(jié)果表明：本實(shí)驗(yàn)所用儀器精密度良好。

2.4.3 回收率測(cè)試

準(zhǔn)確稱取5 g樣品(精確至0.01 g)，共9份，置于50 mL塑料離心管中，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液(堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22濃度分別為4.296，4.284，4.144 μg/mL)各0.25，0.5，0.75 mL，1.949 μg/mL酸性橙II各加入 0.3，1.0，1.5 mL，按2.2項(xiàng)下制備加標(biāo)樣品溶液，取20 μL樣品溶液注入液相色譜儀測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率和RSD結(jié)果表Table 2 The results of recoveries and RSDs

由表2可知，加標(biāo)含量在0.1～0.6 mg/kg之間，回收率在91%～107%之間，RSD在1.1%～7.8%之間，符合食品理化檢測(cè)(GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》的要求。

2.4.4 檢出限測(cè)試

準(zhǔn)確稱取5.00 g樣品(精確至0.01 g)，置于50 mL塑料離心管中，加入經(jīng)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)溶液(堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、酸性橙II的濃度分別為0.2148，0.2142，0.2072，0.1949 μg/mL)0.5，1.0，1.5 mL，按2.2項(xiàng)下制備樣品溶液。取20 μL樣品溶液注入液相色譜儀測(cè)定。記錄保留時(shí)間和峰面積，當(dāng)峰面積與基線噪聲比值(S/N)為3時(shí)，以此時(shí)所加標(biāo)的量來(lái)計(jì)算實(shí)際檢出限。測(cè)得當(dāng)堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、酸性橙II的加標(biāo)濃度分別為0.1074，0.1071，0.1036，0.09745 μg/mL時(shí)，S/N為3，當(dāng)稱樣量為5 g時(shí)，堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、酸性橙II的實(shí)際檢出限為0.2 mg/kg。

3 討論

最近2年，在進(jìn)行國(guó)家監(jiān)督抽檢和省級(jí)監(jiān)督抽檢的辣椒面樣品中，偶有發(fā)現(xiàn)添加非食用物質(zhì)的情況，尤其是違法添加工業(yè)染料酸性橙、堿性橙等，本實(shí)驗(yàn)室以辣椒面為基質(zhì)，探索同時(shí)檢測(cè)堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、酸性橙II的高效液相色譜法。該方法處理簡(jiǎn)單、快速，重復(fù)性和準(zhǔn)確度可靠，可用于辣椒面中堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、酸性橙II的含量測(cè)定，為監(jiān)控辣椒面的質(zhì)量提供可靠、快速的依據(jù)。

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