楊卓，王艷輝*，尹寶穎，石海燕

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河北省植物生理和分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河北 保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河北 保定 071001)

香菇多糖是從香菇中提取的一種十分重要的活性成分，研究表明，其具有提高機(jī)體的免疫功能、抑制腫瘤、抗感染、抗病毒的作用。此外，還具有抑制血小板凝集、降血脂、降血糖、抗衰老、護(hù)肝、促進(jìn)骨骼生長等多方面的藥理活性，無任何毒副作用，是一種很好的免疫調(diào)節(jié)劑[1-5]。香菇由香菇蓋和香菇柄組成，香菇蓋因?yàn)槲鄂r、肉質(zhì)肥厚和營養(yǎng)價(jià)值高，被用于銷售食材。而香菇柄因其口感粗糙常被作為下腳料而遭到丟棄，從而造成了資源的極大浪費(fèi)和環(huán)境污染。據(jù)報(bào)道，每年全國廢棄的香菇柄達(dá)到了數(shù)萬噸[6-8]。因此，將香菇柄用于工業(yè)生產(chǎn)有很大的潛在研究價(jià)值,本實(shí)驗(yàn)選用的材料是這些香菇的下腳料。

香菇的很多功效與香菇具有很好的抗氧化活性之間有很重要的關(guān)系，香菇多糖的體外抗氧化研究的文獻(xiàn)有很多，可是香菇柄多糖的體外抗氧化的文章未見報(bào)道。采用合理的干燥方法可以使物料原有的營養(yǎng)成分盡可能多地保留[9]。劉麗娜等研究發(fā)現(xiàn)熱風(fēng)溫度為50 ℃時(shí)，香菇柄能更有效的保留原有的營養(yǎng)成分，并且沒有人比較不同的干燥方式對(duì)于香菇柄多糖的抗氧化的影響以及多糖提取是否需要醇沉和時(shí)間對(duì)于抗氧化的影響[10]。鄭義等研究表明高良姜多糖對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除能力與多糖濃度呈正相關(guān)[11]。在文章中研究了香菇柄多糖的DPPH自由基、ABTS自由基和還原力，并同時(shí)與具有顯著抗氧化效果的VC進(jìn)行比較，目的在于為人們提供一種具有較好抗氧化能力的保健食品，為以后研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干香菇(市售)、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、鐵氰化鉀、氯化鐵、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、 磷酸氫二鈉、酒石酸鉀鈉、二硝基水楊酸、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、無水乙醇、ABTS、DPPH、VC、 過硫酸鉀等均為分析純。

鼎藏多功能粉碎機(jī) 浙江武義鼎藏日用金屬制品廠；電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司；超級(jí)恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司；df-101s 集熱式恒溫磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限公司；德國EPPENORF 5810R 臺(tái)式高速離心機(jī) 上海肯強(qiáng)儀器有限公司；UV1800紫外分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 香菇多糖的提取

香菇柄經(jīng)烘干粉碎后，用蒸餾水常溫浸潤30 min。70 ℃水浴2 h，期間多次攪拌。然后離心(4000 r/min，20 min)，將上層溶液用6層紗布過濾，將濾渣中液體擠出得到浸提液。取部分浸提液進(jìn)行冷凍干燥和噴霧干燥。冷凍干燥：取多糖溶液用冷凍干燥機(jī)干燥72 h，得到冷凍干燥多糖的粉末; 噴霧干燥：將多糖溶液中加入20%的麥芽糊精，待麥芽糊精全部溶解后，將溶液放入水浴鍋預(yù)熱，然后用噴霧干燥機(jī)按照以下指標(biāo)進(jìn)行干燥，噴霧后得到多糖粉末。噴霧干燥的指標(biāo)：進(jìn)口溫度190 ℃，熱空氣流量38 L/min，蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速30 r/min，霧化壓強(qiáng)21×10 kPa，添加助干劑麥芽糊精20%，控制出口溫 度為70 ℃，折光率為4.3%。醇沉：取適當(dāng)浸提液，加入3倍體積的95%乙醇，顛倒混勻，室溫靜置12 h后離心(4000 r/min，20 min)，棄上清液，沉淀即為醇沉物；取部分醇沉物分別進(jìn)行冷凍干燥和噴霧干燥，即得醇沉冷凍干燥多糖和醇沉噴霧干燥多糖。測(cè)干粉的總糖、還原糖和體外抗氧化活性，其余于-20 ℃保存，在保存的第10，20，30，40天分別檢測(cè)體外抗氧化活性。

1.2.2 香菇多糖總糖含量測(cè)定

具體步驟參照姜瓊等的方法[12]。

1.2.3 還原糖含量測(cè)定

采用 3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測(cè)定，參照李志霞等的方法[13]。

1.2.4 DPPH自由基清除能力

參照初維等的方法并稍做修改[14]。

DPPH測(cè)試液的配制：準(zhǔn)確稱取7.864 mg DPPH用無水乙醇溶解，超聲5 min，定容于10 mL容量瓶中搖勻，置于棕色瓶中保存，在3.5 h內(nèi)用完。

將香菇多糖溶液稀釋至一定的濃度，取2 mL多糖溶液樣品置于試管中，再加入2 mL DPPH溶液，渦旋混勻，避光反應(yīng)(5000 r/min 條件下離心15 min，靜置 15 min)，在517 nm處測(cè)其吸光值；以2 mL去離子水加入2 mL無水乙醇調(diào)零。香菇多糖提取液對(duì) DPPH自由基清除能力用 R 表示：R(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%。

式中：Ai為2 mL DPPH·溶液與2 mL待測(cè)樣品混合液的吸光度；Aj為2 mL 待測(cè)樣品溶液與 2 mL無水乙醇混合液的吸光度；Ac為2 mL DPPH·溶液與2 mL無水乙醇混合液的吸光度。

1.2.5 總抗氧化活性 ABTS

參照Ye等的方法并稍做修改[15]。

ABTS工作液的配制：將0.0768 g的ABTS和0.01324 g的K2S2O8分別溶于20 mL的去離子水，等待2種溶液充分溶解之后混勻，在室溫下將混合液靜置于黑暗條件下12～16 h，使用前用無水乙醇稀釋，稀釋至在734 nm下的吸光值為0.700±0.2。ABTS遇到氧化劑，溶液被氧化后由深藍(lán)色生成藍(lán)綠色的ABTS+。

取該稀釋液2.9 mL,加入0.1 mL樣品，混合均勻于30 ℃下反應(yīng)20 min,在734 nm下測(cè)吸光值A(chǔ)樣品，以去離子水代替樣品作為對(duì)照，測(cè)吸光值A(chǔ)對(duì)照，ABTS·+清除率為ABTS·+=(1-A樣品/A對(duì)照)×100%。

1.2.6 總還原力的變化

對(duì)一種物質(zhì)來說，提供電子的能力越強(qiáng)，物質(zhì)所具有的還原力就越強(qiáng)，所以，物質(zhì)反映出的還原力實(shí)際上是它提供電子的能力。本實(shí)驗(yàn)中選擇的氧化劑是鐵氰化鉀，具有抗氧化的物質(zhì)可以使得溶液中的Fe3+還原成Fe2+，從而使反應(yīng)溶液的顏色由黃色逐漸變成淺綠色，反應(yīng)后在700 nm處測(cè)得吸光值。如果吸光度越大說明樣品的還原能力越強(qiáng)，被檢測(cè)的樣品所具有的抗氧化能力越高[16]。

參照游麗君的方法并稍做修改[17]。

磷酸鹽緩沖液的配制：取3.1196 g磷酸二氫鈉溶于100 mL去離子水配制成0.2 mol/L的溶液，再取2.8392 g磷酸氫二鈉溶于100 mL去離子水配制成0.2 mol/L的溶液，用pH計(jì)測(cè)定pH，使pH為6.6。

取樣品2 mL置于試管中，加入1% (W/V)的鐵氰化鉀溶液 2 mL，再加入 0.2 mol/L 磷酸緩沖液(pH 6.6) 2 mL，渦旋混勻，置于水浴箱中50 ℃恒溫反應(yīng)20 min。接著加入10% (W/V) TCA 2 mL，渦旋混勻后離心10 min，轉(zhuǎn)速為3000 r/min。取2 mL上清液，加入去離子水2 mL，再加入0.1%(W/V)氯化鐵0.4 mL，渦旋混勻，放置反應(yīng)10 min,測(cè)定樣品在波長700 nm處的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇柄的體外抗氧化作用研究

2.1.1 冷凍干燥的香菇柄多糖對(duì)DPPH自由基的清除VC和多糖樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力見圖1。

表1 DPPH自由基的清除活性分析Table 1 DPPH free radical scavenging activity analysis

圖1 香菇多糖和VC對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.1 Scavenging ability of DPPH free radicals of lentinan and VC

由圖1可知，VC和多糖溶液均能夠有效清除DPPH自由基，并且隨著溶液濃度的增加清除率逐漸上升，最后逐步趨于平穩(wěn)。而在DPPH測(cè)定法中，自由基清除能力的大小是用自由基的半數(shù)清除濃度，即IC50值來評(píng)價(jià)的，IC50值越小表明其自由基清除能力越強(qiáng)，即抗氧化能力越強(qiáng)[18]。由圖1可知，DPPH自由基的清除能力隨著多糖濃度的增加逐漸增強(qiáng)，但是低于VC的清除能力。溶液的顏色由紫色逐漸變成黃色，最后變成無色。溶液顏色越淺反映出溶液抗氧化活性越高。多糖和VC的IC50值分別是0.596,0.048 mg/mL。

2.1.2 冷凍干燥的香菇柄多糖對(duì)ABTS自由基的清除

香菇多糖和VC對(duì)ABTS·+自由基的清除能力見圖，ABTS自由基的清除活性分析見表2。

圖2 香菇多糖和VC對(duì)ABTS·+自由基的清除能力Fig.2 Scavenging ability of ABTS·+ free radicals of lentinan and VC

樣品線性回歸方程回歸系數(shù)(R2)IC50(mg/mL)VCY=1065.27391X-7.82730.986850.05428多糖Y=27.3985X+16.626570.999491.21808

ABTS自由基清除能力常用于評(píng)價(jià)各種物質(zhì)的總的抗氧化能力，由于抗氧化劑可以提供電子或氫原子滅活自由基，從而導(dǎo)致反應(yīng)溶液的顏色由藍(lán)色逐漸變淺直至無色，顏色的變化反映了物質(zhì)抗氧化能力的強(qiáng)弱。在波長734 nm處的吸光值反映物質(zhì)的抗氧化活性[19，20]。

由圖2可知，隨著溶液濃度的增加，對(duì)ABTS自由基的清除能力不斷增大。反映出香菇柄多糖總的抗氧化能力很強(qiáng)，具有很好的抗氧化活性。多糖溶液和VC的IC50值分別為1.22，0.054 mg/mL。

2.1.3 冷凍干燥的香菇柄多糖總的還原力測(cè)定

香菇多糖和VC的還原力見圖3，還原力分析見表3。

圖3 香菇多糖和VC的還原力Fig.3 Reducing force of lentinan and VC

樣品線性回歸方程回歸系數(shù)(R2)IC50(mg/mL)VCY=9.62667X+0.017670.999820.0501多糖Y=0.17213X+0.031130.986972.72386

化合物的還原力可作為化合物具有潛在抗氧化活性的重要指標(biāo)。在反應(yīng)溶液中加入多糖溶液和VC后可以使黃色溶液呈現(xiàn)不同程度的綠色，這是因?yàn)樵诜磻?yīng)溶液中存在還原劑時(shí)，能夠使鐵氰化鉀絡(luò)合物轉(zhuǎn)化為亞鐵形式，并且在700 nm波長處有最大吸收峰，吸光值越大反映化合物的還原力越強(qiáng)[21]。由圖3可知，VC和多糖溶液的還原能力隨濃度的增加而增大，但VC與多糖溶液的還原能力具有顯著的不同，多糖溶液和VC的 IC50值分別是2.72，0.05 mg/mL。

2.2 不同提取方法的體外抗氧化活性的比較

圖4 四種多糖的DPPH自由基的清除能力Fig.4 Scavenging ability of DPPH free radicals of four polysaccharides

圖5 四種多糖的ABTS自由基的清除能力Fig.5 Scavenging capacity of ABTS free radicals of four polysaccharides

由圖4和圖5可知，不同干燥方法下提取的香菇柄多糖對(duì)DPPH自由基清除能力大小依次為：FDP>SDP>AFDP>ASDP，對(duì)ABTS自由基清除能力大小依次為：FDP>SDP>AFDP>ASDP。FDP>SDP，AFDP>ASDP得知冷凍干燥得到的多糖比噴霧干燥得到的多糖具有更好的清除自由基的能力，有更好的體外抗氧化活性。因?yàn)閲婌F需要較高的溫度，香菇多糖在溫度高于80 ℃的水溶液中，糖鏈由三重螺旋解螺旋變?yōu)樗缮⒌膯捂淸22]，高溫使得多糖的結(jié)構(gòu)可能被破壞，所以活性受到了影響。

由FDP>AFDP，SDP>ASDP可知， 醇沉后的多糖的抗氧化性要比沒有醇沉的弱，因?yàn)榇汲梁蟮亩嗵亲兊觅|(zhì)地堅(jiān)硬不溶于水，在溶解過程中破壞了多糖的結(jié)構(gòu)，使得多糖的抗氧化性弱于未醇沉的多糖。并且醇沉后可能損失了一些物質(zhì)，可能損失的物質(zhì)具有抗氧化活性。所以選擇了冷凍干燥并且無醇沉的多糖來研究時(shí)間對(duì)于體外抗氧化的影響，分別研究了第10，20，30，40天對(duì)抗氧化活性的影響。

2.3 儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)于香菇柄多糖體外抗氧化性的影響

表4 DPPH自由基的清除活性分析Table 4 DPPH free radical scavenging activity analysis

表5 ABTS自由基的清除活性分析Table 5 ABTS free radical scavenging activity analysis

圖6 不同時(shí)間段和濃度的香菇柄多糖的抗氧化性Fig.6 Antioxidant activities of Lentinus edodes stem polysaccharides at different time and content

注：A為DPPH自由基清除率；B為ABTS自由基清除率；C為還原力。

表6 總的還原力Table 6 Reducing force analysis

由表4～表6可知，香菇柄多糖隨著貯存時(shí)間的延長，IC50值逐漸增大，表明多糖抗氧化性逐漸減弱。由圖6可知，40天結(jié)束后對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力很強(qiáng)并且有很好的還原力，反映出香菇柄多糖還具有較好的抗氧化活性?？寡趸钚噪S著時(shí)間延長而逐漸減弱，但是仍然具有很好的抗氧化活性。在40天結(jié)束后當(dāng)香菇柄多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，其DPPH和ABTS自由基清除率分別達(dá)59.8%和70%，表明香菇柄多糖具有良好的抗氧化活性，而抗氧化能力對(duì)癌癥、動(dòng)脈硬化、糖尿病、心血管病、老年癡呆等疾病的治療有著重要的意義[23]。

3 結(jié)論

香菇柄多糖對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基有著很好的清除作用，并且具有很好的還原力，說明香菇柄多糖具有很好的體外抗氧化活性。香菇柄多糖的抗氧化性具有劑量和時(shí)間的依賴性。

香菇柄多糖的抗氧化活性均隨著多糖濃度增加而逐漸增長。在相同的多糖濃度下,冷凍干燥得到的多糖的體外抗氧化活性要顯著高于噴霧得到的多糖的抗氧化活性,醇沉得到的多糖的體外抗氧化活性要低于沒有醇沉得到的多糖的抗氧化活性。因?yàn)閲婌F在干燥過程中需要較高的溫度，入口溫度達(dá)到190 ℃，出口溫度達(dá)到70 ℃。在高溫下多糖的結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，進(jìn)而影響了多糖的抗氧化活性。在醇沉后多糖粉末質(zhì)地堅(jiān)硬，再次溶于水需要較高溫度，所以多糖結(jié)構(gòu)可能改變，進(jìn)而影響體外的抗氧化效果，多糖結(jié)構(gòu)的變化需要進(jìn)一步研究。香菇柄多糖的提取在醇沉前后的體外抗氧化存在著很大的不同，沒有經(jīng)過醇沉的香菇柄多糖體外抗氧化活性明顯高于醇沉后的，沒有經(jīng)過醇沉的香菇柄多糖雜質(zhì)較多，并且用于干燥的成本很大，所以在工業(yè)生產(chǎn)上選擇了醇沉的方法，這樣可以大大提高提取效率。

香菇柄多糖能夠很好地清除自由基，具有很好的體外抗氧化活性。因?yàn)槎嗵堑幕瘜W(xué)性質(zhì)是很穩(wěn)定的，香菇柄多糖如果是純多糖，那么多糖的體外抗氧化活性隨著時(shí)間延長不會(huì)降低，可是實(shí)驗(yàn)證明多糖的抗氧化活性隨著時(shí)間延長而降低，可能是提取的香菇粉里面含有雜質(zhì)，有可能是蛋白，蛋白的活性不穩(wěn)定所以造成香菇柄多糖的活性不穩(wěn)定。

本實(shí)驗(yàn)為香菇柄多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)研究奠定了前期基礎(chǔ)，同時(shí)為香菇柄多糖的抗氧化藥理作用機(jī)制的深入研究提供了準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)證明香菇柄多糖具有很好的抗氧化活性，可作為一種天然抗氧化劑。

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