趙彩云，蘇錦松，劉川，張藝

沙棘葉收載于《四川省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2014年版），為胡頹子科植物中國(guó)沙棘（Hippophae rhamnoidesL.subsp.sinensisRousi）、云南沙棘（Hippophae rhamnoidesL.subsp.yunnanensis Rousi）的干燥葉，具有健脾消食，止咳祛痰和活血散瘀的功效，用于治脾虛食少，食積腹痛、咳嗽痰多、胸痹心痛、瘀血經(jīng)閉及跌撲瘀腫[1]。前期研究表明，沙棘葉次生代謝產(chǎn)物主要為黃酮類成分，包括異鼠李素、山柰素和槲皮素及其苷類成分等，黃酮類化合物具有改善微循環(huán)、改變體內(nèi)酶活性、降血脂、降膽固醇、抗自由基、抗氧化、增強(qiáng)免疫功能、抑菌、抗病毒和抗炎癥等藥理作用[2]?！端拇ㄊ〔厮幉臉?biāo)準(zhǔn)》（2014年版）中沙棘葉的薄層鑒別項(xiàng)僅對(duì)槲皮素和異鼠李素兩種黃酮苷元成分進(jìn)行定性鑒別，且異鼠李素拖尾現(xiàn)象較嚴(yán)重，見(jiàn)圖1。為了提高鑒別的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)以野生資源量大，中國(guó)特有的中國(guó)沙棘為研究對(duì)象，同時(shí)以槲皮素、異鼠李素以及山奈素三種黃酮苷元為對(duì)照品，研究建立了中國(guó)沙棘葉的薄層色譜鑒別法，以期提高現(xiàn)有法定標(biāo)準(zhǔn)中沙棘葉的薄層色譜鑒別方法。

圖1 《四川省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2014年版）中沙棘葉TLC圖

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

共12 批次，采自四川、西藏及甘肅（見(jiàn)表1），經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院張藝研究員鑒定其基原為胡頹子科沙棘屬中國(guó)沙棘 (H.rhamnoidesL.subsp.sinensisRousi)的葉片，新鮮葉片采集后立即用硅膠干燥。

表1 12批次中國(guó)沙棘葉樣品信息表

1.2 儀器

ZF-20D型暗箱式紫外分析儀（上海顧村電光儀器廠）；KQ-50B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Sartorius BP121s型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；ULUP-I-10T型優(yōu)普超純水機(jī)（成都超純科技有限公司）；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

1.3 試藥

槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：MUST-150907，純度：99.35%）、山柰素對(duì)照品（純度：99.26%）和異鼠李素對(duì)照品（純度：99.13%），以上對(duì)照品均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取槲皮素、山奈素、異鼠李素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇超聲溶解，分別配置為0.468 mg﹒mL-1、0.256 mg﹒mL-1、0.196 mg﹒mL-1的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取中國(guó)沙棘葉粉末（過(guò)三號(hào)篩）約1.0 g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇40 mL，稱定重量，以70 ℃加熱回流提取1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。取續(xù)濾液20 mL置具塞錐形瓶中，加鹽酸3mL，在75 ℃水浴中加熱水解30 min，立即冷卻，濾過(guò)。取濾過(guò)液10 mL，蒸干，加水15 mL溶解，用乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯溶液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。

2.1.3 顯色劑的制備 稱取三氯化鋁1 g，加乙醇100 mL溶解制成l%的三氯化鋁乙醇溶液。

2.1.4 TLC 鑒別 按照薄層色譜法（2015版《中國(guó)藥典》通則0502）試驗(yàn)[3]，吸取對(duì)照品溶液1 μL、供試品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一實(shí)驗(yàn)室自制的含3%醋酸鈉溶液制備的硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸（6 : 4 : 1.5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1 %三氯化鋁試液，熱風(fēng)吹干，置紫外光燈（365 nm）下觀察，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 中國(guó)沙棘葉TLC圖

2.2 方法耐用性考察

2.2.1 不同溫度的考察 分別考察了不同溫度（4 ℃、20 ℃、35 ℃）對(duì)薄層鑒別的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同溫度條件考察的薄層色譜圖（UV365nm下檢視）

從圖3可知：在不同溫度4 ℃、20 ℃和35 ℃下，對(duì)照品溶液與供試品溶液薄層色譜圖斑點(diǎn)無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象，均能實(shí)現(xiàn)分離，但溫度過(guò)低時(shí)易形成邊緣效應(yīng)。相比較而言，20 ℃能達(dá)到很好的分離效果，說(shuō)明該薄層鑒別方法的耐用性良好。

2.2.2 不同相對(duì)濕度的考察 分別考察了不同相對(duì)濕度（18%、32%、56%）對(duì)薄層鑒別的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同濕度條件考察的薄層色譜圖（UV365nm下檢視）

從圖4可知，在低、中、高不同相對(duì)濕度18%、32%、56% 的條件下展開(kāi)，對(duì)照品溶液與供試品溶液薄層色譜圖斑點(diǎn)無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象，均能實(shí)現(xiàn)分離，相比較而言，32%能達(dá)到很好的分離效果，說(shuō)明該薄層鑒別方法的耐用性良好。

2.3 不同批次中國(guó)沙棘葉的薄層色譜鑒別

按照上述確定的薄層鑒別條件，進(jìn)行12批次不同產(chǎn)地中國(guó)沙棘葉的薄層色譜鑒別，結(jié)果顯示供試品溶液薄層色譜圖中，在與對(duì)照品溶液薄層色譜的相應(yīng)位置上，顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)。色譜圖見(jiàn)圖5。

圖5 12批次不同產(chǎn)地中國(guó)沙棘葉的薄層鑒別色譜圖（UV365nm下檢視）

3 討論

3.1 展開(kāi)劑的選擇

主要考察了3個(gè)展開(kāi)系統(tǒng)：（1）三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸（6:4:1.5）；（2）三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（5:4:1）；（3）甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5:2:1)，結(jié)果表明，展開(kāi)系統(tǒng)（2）中異鼠李素拖尾較嚴(yán)重，展開(kāi)系統(tǒng)（3）中山柰素和異鼠李素未完全分開(kāi)，綜合考慮，確定三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸（6:4:1.5）為中國(guó)沙棘葉的薄層色譜鑒別條件。

3.2 薄層板的選擇

主要考察了硅膠G板、聚酰胺薄膜和含3%醋酸鈉的硅膠G板對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，硅膠G板的薄層色譜圖中山柰素和異鼠李素很難進(jìn)行分離，聚酰胺薄膜的薄層色譜圖中對(duì)照品及供試品拖尾現(xiàn)象均較嚴(yán)重。

3.3 樣品溶液的制備

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，供試品溶液的薄層色譜圖中接近溶劑前沿的部分有較多的紅色斑點(diǎn)，猜測(cè)很有可能為沙棘葉中的葉綠素類等脂溶性成分，在后期質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定中，可考慮在樣品處理過(guò)程中增加石油醚除雜的操作。

本實(shí)驗(yàn)利用三種黃酮類成分對(duì)中國(guó)沙棘葉進(jìn)行薄層色譜的研究和分析，所建立的薄層色譜定性鑒別方法準(zhǔn)確、可靠、適用性強(qiáng)，可以此對(duì)中國(guó)沙棘葉藥材進(jìn)行科學(xué)的質(zhì)量控制。

[1]四川省食品藥品監(jiān)督管理局.四川省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)（2014年版）[M].成都:四川科學(xué)技術(shù)出版社, 2014:87-91.

[2]曹緯國(guó),劉志勤,邵云,等.黃酮類化合物藥理作用的研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào),2003,23(12): 2241-2247.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2015年版[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社.