王天星,鐘隆潔,蘇凱麒,秦 臻,胡 寧,王 平

(浙江大學生物傳感器國家專業(yè)實驗室,生物醫(yī)學工程教育部重點實驗室,生儀學院,杭州 310027)

伴隨世界性的城市工業(yè)化和現(xiàn)代化,全球慢性患病率正呈快速上升趨勢,慢性病患者數(shù)量日益增多,對全球范圍人群的健康產(chǎn)生巨大影響。單以慢性病中最常見的糖尿病為例,根據(jù)2015年國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)年鑒報告(參考文獻:2015 IDF DIABETES ATLAS),全球糖尿病人群已高達4.15億,預計到2040年,全球糖尿病人群將達到6.42億[1]。糖尿病的主要危害是長期高血糖引起的慢性并發(fā)癥,包括動脈粥樣硬化性心血管病變、糖尿病腎病、足病、眼病等,導致糖尿病患者致死致殘[2]。糖尿病人群患有超重或肥胖、高血壓、血脂異常、高尿酸血癥等心血管危險因素的顯著比例高于普通人群。實際上糖尿病患者發(fā)生心血管病變有多重危險因素,依次為低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)升高、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低、糖化血紅蛋白(HbA1c)升高、高血壓和吸煙等。研究結(jié)果顯示[3]:不患有血脂異常及高血壓的單純糖尿病患者之比例不足三分之一,三分之二以上的糖尿病患者都至少患有高血壓及血脂異常中的一種。如可聯(lián)合血糖、血脂、尿酸、血酮等快速檢測指標,對于患者早期發(fā)現(xiàn)代謝異常、及時干預并監(jiān)測代謝指標非常重要。而多種指標快速聯(lián)合檢測的技術(shù)為臨床實驗室進入基層社區(qū)醫(yī)院、甚至實現(xiàn)家庭化的現(xiàn)場和床旁檢驗創(chuàng)造了條件,同時為通過互聯(lián)網(wǎng)進行大數(shù)據(jù)醫(yī)療診斷提供了技術(shù)手段,使得包括檢查檢驗在內(nèi)的醫(yī)療資源高度融合與信息共享,也為慢病實現(xiàn)三級診療、促進不同級別和類別醫(yī)療機構(gòu)間的有序轉(zhuǎn)診打下基礎(chǔ)。

圖1 毛細作用驅(qū)動的微流控通道技術(shù)原理

便攜型體外診斷產(chǎn)品的發(fā)展經(jīng)歷了第1代定性檢測(試條試紙)[4-5];第2代半定量(色板卡比色或半定量儀器閱讀)[6-7];第3代全定量系統(tǒng)(較少的手工操作)[8];第4代產(chǎn)品往自動化、智能化、網(wǎng)絡(luò)化、多參數(shù)、高精度、快速、微量樣本等方向發(fā)展。第一、二代的便攜型體外診斷產(chǎn)品常用于非專業(yè)的家庭、個人健康保健,而第3代、第4代產(chǎn)品,將用于醫(yī)院門急診、社區(qū)醫(yī)療的定量檢測。早期的便攜型體外診斷產(chǎn)品發(fā)展始于20世紀中期,主要是以干化學試紙檢測血糖及尿糖。此后免疫層析和斑點金免疫滲濾等免疫測定技術(shù)推動了感染性疾病、心臟標志物等便攜型體外診斷產(chǎn)品技術(shù)發(fā)展?；谖⒘骺丶夹g(shù)的生物傳感器的出現(xiàn)對便攜型體外診斷產(chǎn)品是一個重大轉(zhuǎn)折,后續(xù)體外診斷產(chǎn)品小型化、多參數(shù)、高精度發(fā)展將進入快車道,可解決人們對質(zhì)量問題的困憂,且可實現(xiàn)測試耗用樣本微量化以及多參數(shù)同步檢測等臨床需求。

由于生物反應的特點,多種因素會影響產(chǎn)品的精度,包括生物敏感試劑的選擇,電極敏感材料的選擇、原物料性能的波動、生產(chǎn)過程的控制、生產(chǎn)環(huán)境的變化、樣本內(nèi)外源物質(zhì)的干擾、操作影響因素等,例如:血樣的紅細胞壓積(Hematocrit)影響著血液的粘度和流量及其運輸氧氣的能力、血樣的擴散速度、物質(zhì)在細胞間的擴散速度等等,以及一些內(nèi)外源物質(zhì)的干擾,顯著影響測試結(jié)果的準確度[9];另外,不同的電極材料和不同的生物敏感試劑的匹配度直接影響產(chǎn)品的靈敏度、線性、穩(wěn)定性,這也是直接制約開發(fā)多參數(shù)POCT的技術(shù)障礙之一[10];還有,原物料的選擇和控制、生產(chǎn)工藝的搭建和控制,是保證生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定、產(chǎn)品精度良好的關(guān)鍵。因此,當前國產(chǎn)體外診斷即時檢測產(chǎn)品測試精度偏低、測試項目單一、性能不穩(wěn)定是制約國內(nèi)體外診斷即時檢測產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素。本論文基于毛細驅(qū)動的微流控和微納傳感技術(shù),結(jié)合電分析化學、光化學、生物傳感器技術(shù),開發(fā)了一種高精度、多參數(shù)的POCT集成系統(tǒng),從而能夠用于慢性病生化指標的多參數(shù)聯(lián)合檢測。

1 原理和方法

1.1 毛細作用驅(qū)動的微流控通道技術(shù)原理和結(jié)構(gòu)設(shè)計

微流控(Microfluidics)指的是使用微管道(尺寸為數(shù)十到數(shù)百微米)處理或操縱微小流體(體積為納升到皮升)的系統(tǒng)所涉及的科學和技術(shù),是一門涉及化學、流體物理、微電子、新材料、生物學和生物醫(yī)學工程的新興交叉學科。因為具有微型化、集成化等特征,微流控裝置通常被稱為微流控芯片,也被稱為芯片實驗室(Lab on a Chip)和微全分析系統(tǒng)(Micro-Total Analytical System)。為了進一步提高測量精密度和一致性,我們采取電化學原理的生物傳感器設(shè)計基于毛細作用驅(qū)動的微流控通道加工技術(shù),通過對親水材料電極的選擇、通道的精密微加工、以及運用微流控模型理論推算的孔道設(shè)計,保證產(chǎn)品進樣、生產(chǎn)加工和測試的穩(wěn)定性,保證產(chǎn)品的準確可靠。其毛細作用驅(qū)動的微流控通道技術(shù)原理如圖1所示。

在電化學和光化學技術(shù)基礎(chǔ)上,融合微流控技術(shù),采用復雜的算法校正,如空白值校正和相同測試環(huán)境下的標準曲線校正,可以有效降低內(nèi)外源物質(zhì),血液中紅細胞,溫濕度等系列干擾,從而使產(chǎn)品測試精度獲得極大的提升。以血糖檢測為例,血樣的紅細胞壓積(Hct)影響著血液的粘度和流量及其運輸氧氣的能力、血樣的擴散速度、物質(zhì)在細胞間的擴散速度等等,以及一些干擾物質(zhì)的干擾,顯著影響測試結(jié)果。本文利用微流控技術(shù),在芯片上集成了微通道,試樣預處理、反應及檢測等裝置,同時結(jié)合多電極技術(shù),成功消除了一些常見干擾物的干擾和紅細胞壓積的影響,解決POCT產(chǎn)品在臨床應用中的問題,最少僅需0.5 μL樣本量即可完成測試。

圖2 集成有試樣預處理裝置和探測單元的測試芯片結(jié)構(gòu)示意圖

測試時,樣本自試樣引入微通道引入測試芯片后,首先通過上游紅細胞壓積探測單元,把試樣的Hct數(shù)據(jù)傳遞到儀器中,然后流經(jīng)試樣預處理單元,消除干擾物質(zhì)的干擾后繼續(xù)流入下游試樣反應區(qū),經(jīng)過一系列酶促反應及電極反應后轉(zhuǎn)化為電信號,該信號被檢測電極檢測,儀器對得到的多個信號進行一系列的計算校正后最終得出準確的測試值,整個過程僅需2 min～3 min,達到快速檢測的目的。

1.2 生物敏感試劑反應原理和多聚物3D骨架酶固定化和分子交互結(jié)晶成型技術(shù)

本論文采用電化學檢測方法對疾病指標進行檢測。各指標的檢測反應原理如圖3所示。

利用一些多聚物特有的3D骨架結(jié)構(gòu)(如圖4(a)和圖4(b)的多聚物纖維結(jié)構(gòu)),把反應酶固定到其骨架結(jié)構(gòu)上,其較大的表面積可以提高酶的反應效率、儲存穩(wěn)定性;3D骨架結(jié)構(gòu)能允許反應分子的自由擴散,但其微孔結(jié)構(gòu)又能有效把紅細胞等可能干擾反應的大顆粒排除在外,減少干擾提高檢測的準確度。分子交互結(jié)晶成型是指兩種不同的晶體彼此之間以一定的結(jié)晶學取向關(guān)系交互連生,或一種晶體嵌生于另一種晶體中的現(xiàn)象。利用分子間的相互作用,圖5(b)是利用分子交互結(jié)晶成型技術(shù)的結(jié)晶形態(tài)比圖5(a)中常規(guī)試劑的結(jié)晶更加均勻,使產(chǎn)品一致性更好,測試精度更高。

圖3 各種試劑反應原理

圖4 多聚物3D骨架結(jié)構(gòu)

圖5 結(jié)晶形態(tài)

2.3 多參數(shù)體外快速診斷系統(tǒng)POCT設(shè)計

通常血糖檢測范圍為0.6 mmol/L～33.3 mmol/L,總膽固醇的檢測范圍2.6 mmol/L～11.7 mmol/L,尿酸的檢測范圍為181 μmol/L～1181 μmol/L,血酮(β-羥丁酸)的檢測范圍為0～8.0 mmol/L,4個指標的檢測濃度范圍差別非常大,反應的靈敏度要求差異大,對檢測儀器不同量程的檢測精度要求高;另一方面,如總膽固醇,需要多酶級聯(lián)反應,反應弱而且慢,靈敏度低,如血酮,其酶促反應和電化學反應很難匹配,反應信號差,靈敏度低,而尿酸,因其濃度低,對靈敏度要求高。

因為溶出電流微弱(通常在nA～μA級別),在進行檢測電路總體設(shè)計時,需要保證高增益、低噪聲和低失真特性;此外,由電極/溶液構(gòu)成的電化學體系等效電路相對比較復雜,在保證檢測電路具有高增益、低失真的同時,還應保證足夠的相位裕度,避免電路不穩(wěn)定甚至自激現(xiàn)象的發(fā)生。圖6是硬件系統(tǒng)的整體結(jié)構(gòu)圖。如圖,硬件系統(tǒng)主要分為電化學檢測電路、電源模塊和無線模塊三部分。

圖6 儀器的硬件系統(tǒng)整體結(jié)構(gòu)圖

在三電極檢測過程中,參比電極與工作電極信號微弱,需要避免引入外部噪聲。傳統(tǒng)電路中多采用無源屏蔽方法,即引入同軸電纜或其他類似結(jié)構(gòu),以中心導線作為參比電極、工作電極信號走線,屏蔽層接地避免外部干擾。但是,因為信號線與屏蔽線之間不可避免存在較大的分布電容,電容充放電的過程會影響信號波形,增大檢測誤差。因此,為避免無源屏蔽引發(fā)的問題,設(shè)計中對參比電極和工作電極引入了有源屏蔽。有源屏蔽電路包含兩個環(huán)節(jié),即對參比電極的有源屏蔽,及對工作電極的有源屏蔽。為保證低噪聲特性,屏蔽不僅包括由電路SMA同軸接口引出的電極連線,還包括 PCB 內(nèi)部的關(guān)鍵走線,且PCB內(nèi)部走線以短路環(huán)的形式提供保護。

為進一步降低噪聲,電化學檢測電路使用四層FR4材質(zhì)基底PCB設(shè)計,并以PCB第1層為關(guān)鍵走線布線層,第2層為地層,為微弱信號提供完整的地平面;并以第3層為電源層,第4層為輔助布線層,通過地層與電源層,將微弱信號與可能產(chǎn)生干擾的強信號進行隔離。電池組采用聚合物鋰離子電芯組合,聚合物電芯具有內(nèi)阻小,容量大,循環(huán)次數(shù)多,壽命長,無記憶效應防爆等優(yōu)點;電池組帶智能控制保護電路,能防止過充,過放,過流,短路。

下位機軟件程序集成在單片機 MSP430 Flash存儲器中,主要完成的功能為:接收上位機發(fā)送的命令與參數(shù)指令,完成相應的操作,并將數(shù)據(jù)發(fā)送給上位機。其算法實現(xiàn)流程圖如圖7所示。

圖7 多參數(shù)體外快速診斷系統(tǒng)的電化學算法實現(xiàn)流程圖

DPSV 算法主要涉及以下參數(shù):富集電壓與富集時間、靜息電壓與靜息時間、掃描初始電壓、掃描終止電壓、掃描步進電壓、采樣周期、采樣寬度、脈沖周期與脈沖幅度等。DPSV 算法中,在一個脈沖周期內(nèi),檢測系統(tǒng)進行兩次電流采樣,即分別在前采樣點采集得到電流數(shù)據(jù)I1,在后采樣點得到電流數(shù)據(jù)I2,并求得兩者電流之差;通過上述過程,能有效地消除充放電電流對于檢測的影響。DPSV算法以10 ms為單位時間,并將程序的一次執(zhí)行過程嵌入10 ms延時時序,能夠有效減少程序的運行時間,并保證算法生成波形的周期誤差控制在±0.2%以內(nèi),滿足檢測需要。

3 實驗結(jié)果與討論

在電化學技術(shù)基礎(chǔ)上,融合微流控技術(shù),采用復雜的算法校正,可以有效降低內(nèi)外源物質(zhì),血液中紅細胞,溫濕度等系列干擾,從而使產(chǎn)品測試精度獲得極大的提升。以血糖檢測為例,血樣的紅細胞壓積(Hct)影響著血液的粘度和流量及其運輸氧氣的能力、血樣的擴散速度、物質(zhì)在細胞間的擴散速度等等,以及一些干擾物質(zhì)的干擾,顯著影響測試結(jié)果。本文利用微流控技術(shù),在芯片上集成了微通道,試樣預處理、反應及檢測等裝置,同時結(jié)合多電極技術(shù),成功消除了一些常見干擾物的干擾和紅細胞壓積的影響,使得產(chǎn)品的測試精準度極大地提升。同時由于采用微流控技術(shù),試劑設(shè)計精巧,在集成上述諸多功能的基礎(chǔ)上,最少僅需0.5 μL樣本量即可完成測試。

圖8 各因素對血糖測試結(jié)果的影響對比

抗壞血酸在人體中廣泛存在,達到一定濃度會對血糖測試產(chǎn)生極大的干擾,本文采用了在測試芯片上集成了試樣預處理裝置,干擾從40%降低到了5%的可接受范圍,如圖8(a)所示。

進一步在測試芯片上集成了紅細胞壓積探測單元,顯著降低了紅細胞壓積的影響,使得本測試芯片的應用人群范圍可以覆蓋到貧血及新生兒等特殊人群,其測試結(jié)果如圖8(b)所示。

本文利用利用分子平衡抑制作用、高分子多聚物網(wǎng)架與酶的固定化技術(shù)、分子組合結(jié)晶成型的技術(shù),開發(fā)傳感器生物敏感試劑,成功解決了試劑的熱穩(wěn)定性、反應適配性、試劑溶液均一性、試劑固定生產(chǎn)一致性和可控性、干燥后固定試劑均一性等問題,保證傳感器的一致性,同時使反應靈敏度和重復精度大幅提高,如圖9所示。圖9(a)中曲線表示改進前FAD型葡萄糖脫氫酶試劑的線性測試反應曲線圖:反應信號很弱,不同濃度樣本的反應曲線梯度不能很好的分開。圖9(b)中曲線表示改進后FAD型葡萄糖脫氫酶試劑的線性測試反應曲線圖:反應信號強,不同濃度樣本的反應曲線梯度很好的分開,同一濃度反應曲線的一致性好。

圖9 FAD型葡萄糖脫氫酶試劑改進前和改進后的反應曲線對比

血酮體(β-羥丁酸)試劑的開發(fā):采用復合β-羥丁酸脫氫酶及新型電子介體技術(shù),使反應靈敏度和重復精度大幅提高,測試時間大幅縮短,如圖10所示。圖10(a)中曲線表示改進前β-羥丁酸試劑的線性測試反應曲線圖:反應信號較弱,不同濃度樣本的反應曲線梯度分開不顯著,同一濃度反應曲線的一致性不佳。圖10(b)中曲線表示改進后β-羥丁酸試劑的線性測試反應曲線圖:反應信號強,不同濃度樣本的反應曲線梯度很好的分開,同濃度反應曲線的一致性好。

實驗結(jié)果表明,我們設(shè)計的基于微納傳感結(jié)合微流控的高精度、多參數(shù)體外快速診斷POCT系統(tǒng),在檢測血糖、血酮、等方面具有良好的一致性和實用性,同時具有良好的抗干擾性能。

圖10 血酮體(β-羥丁酸)試劑改進前和改進后的反應曲線對比

4 結(jié)論

本文主要介紹了基于微流控及微納傳感技術(shù)的高精度、多參數(shù)體外快速診斷系統(tǒng)。利用高分子多聚物3D骨架酶固定化技術(shù)以及分子交互結(jié)晶成型的技術(shù),成功解決了試劑溶液均一性、試劑固定生產(chǎn)一致性和可控性、干燥后固定試劑均一性等問題,保證產(chǎn)品優(yōu)良的一致性;通過微納材料技術(shù)的應用,成功提高了試劑的靈敏度和檢測限。應用基于血液特異的電阻抗譜分析以及基于擴散差異的動態(tài)電流技術(shù)對血樣內(nèi)源外源干擾物和存儲操作環(huán)境等因素對測量結(jié)果的抗干擾處理。基于毛細作用驅(qū)動的微流控通道加工技術(shù),通過對親水材料電極的選擇、通道的精密微加工、以及運用微流控模型理論推算的孔道設(shè)計,保證檢測的準確可靠。在生物傳感芯片上集成了微通道、試樣預處理、反應及檢測等裝置,同時結(jié)合多電極參比技術(shù)、電阻抗譜分析技術(shù)、動態(tài)電流檢測技術(shù),采用多維度多參數(shù)聯(lián)合的算法校正,成功降低消除了測試樣品的內(nèi)外源物質(zhì)、紅細胞壓積、溫濕度等系列干擾,有效克服了常規(guī)POCT產(chǎn)品在臨床應用中的精度和靈敏度不夠的問題。最后通過檢測實驗結(jié)果分析,驗證了基于微流控及微納傳感技術(shù)的高精度、多參數(shù)體外快速診斷系統(tǒng)可以可靠和快速地對血酮、血糖等指標進行綜合檢測的功能。

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