王倩倩，盧川，陳良，黃玉仙

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心肝炎一科，上海 201508； 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科，上海 200040

1985年P(guān)an等[1]首次發(fā)現(xiàn)，外泌體是哺乳動物網(wǎng)織紅細胞成熟過程中分泌的直徑為40～100 nm的膜性小囊泡，電子顯微鏡下呈茶托形或一側(cè)凹陷的半球形。外泌體由體內(nèi)各種活細胞分泌，廣泛分布于血液、尿液、乳汁等體液中[2]。外泌體含有豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、微小RNA(microRNA, miRNA)等內(nèi)容物[3]，這些生物信息分子會隨疾病進展、轉(zhuǎn)歸發(fā)生變化，是頗具臨床診斷價值的循環(huán)標(biāo)記[4-5]。因此，提取高純度的外泌體用于后續(xù)臨床診斷具有重要實用價值[6]。根據(jù)外泌體的大小、密度和表面標(biāo)記等物理化學(xué)性質(zhì)，目前獲取外泌體的方法有經(jīng)典的超速離心法、沉淀法、免疫親和捕獲法、分子排阻層析等[7-11]。近幾年來，德國Qiagen公司研發(fā)的外泌體提取試劑盒exoRNeasy利用膜親和吸附原理，可直接獲取血清外泌體的總RNA[12]，便于操作且效率高，適用于大規(guī)模提取血清標(biāo)本進行后續(xù)miRNA測序和 定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)等實驗[13]。但是，exoRNeasy操作手冊規(guī)定提取血清外泌體所需標(biāo)準血清量為1～4 mL ,而臨床實踐中患者血清標(biāo)本珍貴且體積有限，能否用較少的血清量達到預(yù)期的實驗效果值得探索。本研究以健康人和慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者血清為樣本，利用exoRNeasy Serum/Plasma Midi試劑盒提取250、500、1 000 μL血清外泌體中RNA，并對miRNA相對表達量進行對比分析，選取能檢測外泌體中miRNA的最小血清體積，為后續(xù)研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

隨機篩選2017年9—11月上海市公共衛(wèi)生臨床中心肝病科乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B virus e antigen, HBeAg)陽性CHB初治患者9例，無基礎(chǔ)疾病健康者9例。采集靜脈血5 mL，加入含分離膠的促凝管，室溫靜置至少30 min，3 000g離心 15 min，取上層淡黃色血清約 2 mL，置-80 ℃冰箱備用。本研究通過了上海市公共衛(wèi)生臨床中心醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，志愿者均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1儀器與試劑外泌體RNA提取試劑盒為exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit(德國Qiagen公司，cat.no.77044)。透射電子顯微鏡型號Philips CM120(荷蘭Philips公司)。兔單抗Anti-CD63 [EPR5702](ab134045)、兔單抗Anti-TSG101 [EPR7130(B)](ab125011)購自英國Abcam公司，β-actin [GT5512]購自美國GeneTex公司。Stepone plus實時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。TaqManTMMicroRNA Reverse Transcription Kit購自美國Applied Biosystems公司，Bulge-Loop Reverse Transcription Primers購自廣州市銳博生物科技有限公司，Thunderbird SYBR qPCR Mix購自日本Toyobo公司。miR-122反轉(zhuǎn)錄引物序列為hsa-miR-122-3p：5′-AACGCCAUUAUCACACUAA-AUA-3′，由廣州市銳博生物科技生物有限公司合成。

1.2.2血清中外泌體的提取德國Qiagen公司exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit使用膜親和結(jié)合步驟從血清中分離外泌體，步驟簡述如下。①血清梯度離心步驟： 4 ℃， 2 000g離心10 min，去除死細胞，取上清液繼續(xù) 10 000g離心30 min；然后 14 000g離心10 min，徹底去除血清中的細胞碎片，進行后續(xù)外泌體的提取(圖1)。②正常人和CHB患者血清分別取250、500、1 000 μL,加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)稀釋至總體積均為 1 000 μL，然后按試劑盒說明書操作，可獲得外泌體，用于后續(xù)鑒定。

1.2.3外泌體生物學(xué)特性鑒定①透射電子顯微鏡形態(tài)觀察[12]：用50 μL PBS溶解Qiagen試劑盒提取的1 mL血清中的外泌體。采用磷鎢酸負染色法，將Parafilm膜平整黏貼于玻璃表面，50 μL樣品滴于膜上，帶有Formvar支持膜的銅網(wǎng)覆蓋在樣品液滴上，使其漂浮3～10 min。將50 μL 2%磷鎢酸染液滴于Parafilm膜上，用濾紙沿銅網(wǎng)邊緣吸干液體。白熾燈下干燥10 min,備用。透射電子顯微鏡下觀察。②蛋白免疫印跡法檢測外泌體標(biāo)記蛋白[12]：用50 μL RIPA裂解液裂解Qiagen試劑盒提取的1 mL血清中的外泌體，進行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，10～15 mA恒流電泳3～4 h。然后以濕轉(zhuǎn)法將SDS-PAGE凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜，用含5%脫脂奶粉的含吐溫20的PBS(PBS with Tween 20，PBST)封閉液置于搖床，室溫封閉1 h以上。加入一抗(1∶1 000 封閉液稀釋)，4 ℃過夜。次日，PBST 洗膜(5 min，3次)后加入相應(yīng)的二抗室溫反應(yīng)2 h，加入化學(xué)發(fā)光底物顯色觀察。

Cells, fragments, apoptotic bodies and other components in serum were completely removed by gradient centrifugation and then the serum was used to isolate exosomes.

圖1血清梯度離心流程圖

Fig.1Flowchartofgradientcentrifugationofserum

1.2.4血清外泌體總RNA提取及miRNA檢測[14]外泌體中總RNA提取按Qiagen公司試劑盒exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit 說明書操作。使用QIAzol 裂解結(jié)合于離心柱膜上的外泌體，在 QIAzol 洗脫液中加入氯仿，回收水相與乙醇混合。將所有液體轉(zhuǎn)移至RNeasy MinElute離心柱中瞬離30 s，然后用Buffer RWT和RPE洗3 次，離心，最后加14 μL RNase-free水，獲得總RNA。取11 μL RNase-free水溶解的外泌體總RNA，加入5 μL反轉(zhuǎn)錄引物Mix,70 ℃放置 10 min，冰上孵育2 min。然后加入反轉(zhuǎn)錄體系進行miRNA特異性反轉(zhuǎn)錄,獲得20 μL cDNA產(chǎn)物。將cDNA原液稀釋4倍后，取2 μL行實時熒光定量PCR檢測。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 1 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸 30 s， 40個循環(huán)。以外源性線蟲cel-miR-39 為內(nèi)參基因，2-△△Ct值表示miR-122的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。應(yīng)用 K-S 檢驗對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，兩組間計量數(shù)據(jù)比較采用F檢驗和t檢驗，3組間計量數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析；分類資料采用卡方檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體形態(tài)學(xué)鑒定

透射電子顯微鏡(×46 000)觀察顯示，采用exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit獲得的外泌體為大小不等的圓形至橢圓形囊泡狀結(jié)構(gòu)，可呈分散或聚集分布，由染色較深的脂質(zhì)雙層膜及其內(nèi)染色較淡的低電子密度物質(zhì)組成，囊泡粒徑大小多分布于40～100 nm，與文獻報道的 30～150 nm 基本一致(圖2)。

The arrows refer to the exosomes.

圖2透射電子顯微鏡觀察Qiagen試劑盒提取的外泌體

Fig.2TransmissionelectronmicroscopyofserumexosomesisolatedbyQiagenexoRNeasySerum/PlasmaMidiKit

2.2 外泌體表面標(biāo)記蛋白的表達鑒定

采用蛋白免疫印跡法檢測外泌體標(biāo)記蛋白的表達情況。結(jié)果顯示，exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit提取的外泌體表達其表面特異性標(biāo)記蛋白TSG101和CD63，但內(nèi)參β-actin陰性；對照樣品中TSG101和CD63低表達，β-actin陽性。結(jié)果表明， exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit從血清中提取的外泌體確實存在(圖3)。

圖3蛋白免疫印跡法檢測外泌體和非外泌體的標(biāo)記

Fig.3Westernblottinganalysisofexosomalandnonexosomalmarkers

2.3 實時熒光定量 PCR 檢測從不同體積血清中提取的外泌體中 miR-122的表達

miR-122是肝細胞中含量最豐富的miRNA，占肝臟總miRNA的70%，且與肝臟生理功能密切相關(guān)，它能通過結(jié)合病毒RNA來直接抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)復(fù)制[15]。很多研究報道血清miR-122可作為肝臟損傷的生物標(biāo)記，且其水平與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、HBV DNA和HBV表面抗原(HBV surface antigen，HBsAg)密切相關(guān)[16-17]。研究表明，與正常人相比，CHB患者尤其是HBeAg陽性患者循環(huán)中miR-122水平升高[18]，因此本實驗選取miR-122來比較HBeAg陽性CHB患者與健康人從不同量血清中提取的外泌體中miRNA表達量。采用exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit提取CHB患者和健康人血清外泌體的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后行實時熒光定量PCR檢測。內(nèi)參基因cel-miR-39在不同類型的樣本中表達水平穩(wěn)定,循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)約為13。結(jié)果顯示, CHB 患者和健康人的血清體積每增加1倍，Ct值遞減一個循環(huán)，PCR信號隨血清體積呈線性增加。采用實時熒光定量 PCR 檢測CHB患者和健康人從不同體積血清中提取的外泌體中miR-122表達情況，初始血清量分別為250、500、1 000 μL，CHB患者miR-122表達量比健康人分別上調(diào) 22.44、21.48、20.69 倍(P=0.42)(圖4～5)。

圖4實時熒光定量PCR檢測血清外泌體中miR-122的Ct值

Fig.4TheCtvalueofmiR-122inserumexosomesdetectedbyreal-timefluorescentquantitativePCR

圖5實時熒光定量PCR檢測健康人和慢性乙型肝炎患者不同血清量外泌體中miR-122的表達

Fig.5TheexpressionofmiR-122inexosomesfromserumwithdifferentvolumeinchronichepatitisBpatientsandhealthysubjectsdetectedbyreal-timefluorescentquantitativePCR

3 討論

外泌體是由多種細胞分泌的膜性生物運輸體，其內(nèi)容物種類繁多。外泌體的生物功能有物質(zhì)運輸、信息傳遞和免疫調(diào)節(jié)等，還攜帶大量病理生理生物標(biāo)記信息。外泌體被釋放至體液和微環(huán)境時，可攜帶生物信息進行長距離的細胞間通訊。研究表明，外泌體在臨床診斷和治療中有廣闊應(yīng)用前景[19]，在心血管疾病[20]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[21]、腫瘤[22]和肝臟疾病[23]診治中扮演著極其重要的角色。很多研究發(fā)現(xiàn)，外泌體源性miRNA可作為一種生物標(biāo)記用于疾病診斷和預(yù)后。外泌體膜結(jié)構(gòu)的保護使體液中外泌體源性miRNA等不易被破壞，具有更好的抗降解能力，因此是一種理想的非侵入性“液體活檢”方法[24]。

迄今為止，雖然血清外泌體的提取方法很多，但最大的局限性是缺少標(biāo)準化的外泌體分離方法，以及樣本的收集和處理方法，如何獲取高質(zhì)量外泌體及其內(nèi)含物仍是困擾研究者們的一個難題。經(jīng)典的差速超速離心法富集外泌體步驟繁瑣耗時，技術(shù)要求高，所需血清量多；基于聚合物沉淀的方法提取的外泌體純度低，摻雜很多雜質(zhì)；基于表面蛋白標(biāo)記親和分離方法獲得的為某個蛋白標(biāo)記陽性的外泌體亞群，不能反映外泌體的整體情況[10-11]；凝膠尺寸排阻色譜分離的外泌體缺乏特異性，符合過濾尺寸內(nèi)的任何微粒包括細胞碎片、血小板和淋巴細胞等都會被分離出來，不利于下游分析。本研究使用最新的膜親和離心柱方法提取血清中外泌體及外泌體中RNA，可高效率、低損失地獲得外泌體RNA，適合臨床實驗室工作，有利于下游的分析驗證[25]。

本研究通過電子顯微鏡和蛋白免疫印跡法對exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit提取的外泌體生物學(xué)形態(tài)和表面標(biāo)記蛋白進行驗證。結(jié)果顯示，外泌體在電子顯微鏡下顯示為直徑30～100 nm的脂質(zhì)雙層膜的囊泡狀結(jié)構(gòu)，其表面表達外泌體特征性蛋白TSG101和CD63，但不表達β-actin，證實該方法提取的確實是外泌體。exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit操作手冊中標(biāo)準血清量為1 mL，但當(dāng)臨床血清資源有限時，250或500 μL血清能否達到同樣的實驗效果，本研究對此進行了初步探索，用實時熒光定量PCR對CHB與健康人不同體積血清中提取的外泌體miR-122表達量進行分析。結(jié)果顯示，血清體積每增加1倍，Ct值遞減1個循環(huán)，PCR信號隨血清體積呈線性增加。針對不同初始血清量，CHB患者miR-122表達量相比健康人升高的倍數(shù)沒有統(tǒng)計學(xué)差異。因此，利用exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit提取外泌體中miRNA驗證表達差異時，少量血清可達到與1 mL血清相同的結(jié)果，這對解決臨床血清資源有限這一問題有實際意義。

本研究也存在一定局限性。首先，本研究例數(shù)較少，后續(xù)需擴大樣本量，進一步評價該方法的臨床應(yīng)用價值。其次，對于CHB患者血清中表達豐度較低的miRNA是否可達到相同的驗證效果，還需進一步探索。

綜上所述，使用Qiagen exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit提取血清外泌體時，需根據(jù)研究的疾病、目的、下游實驗設(shè)計及實際樣本量來綜合考慮實驗使用的血清量。

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